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문제 정의
- 본 연구에서는 국내산 삼채 뿌리를 70% 에탄올로 추출하여 추출물의 항염증 효과를 관찰하였다. 항염증 효과를 관찰하기 위하여, nitrite의 생성량과 전염증성 사이토카인 분비를 측정하였고, 그 조절기전으로 HO-1과 MAPKs, Iĸ-Bα를 관찰하였다.
- 삼채가 RAW 264.7 세포에서 전염증성 인자를 단백질 수준에서 억제하였음에 착안하여 (Fig. 3), mRNA수준에서도 전염증성 인자들을 억제하는지 알아보기로 하였다. 삼채를 다양한 농도로 전 처리한 후 LPS로 자극하였다.
- 삼채의 항염증 작용을 알아보기 위하여 RAW 264.7 세포에서 LPS 자극에 의한 NO 생성에 미치는 영향을 조사하였다. 삼채를 다양한 농도로 3시간 전처리하고 LPS (500 ng/ml)로 자극하였다.
- 하지만 아직 국내산 삼채에 대한 연구는 활발히 이루어지고 있지 않은 실정이다. 이 연구는 국내산 삼채에 대한 첫 번째 연구로, 그 기전 및 효능 연구에 초점을 두고 진행하였다.
- 이 연구에서는 국내산 삼채 뿌리의 효능에 초점을 맞추어, 국내산 삼채 뿌리의 항염증 효과를 관찰하였다. 효과를 규명하기 위해서, 대식세포주인 RAW264.
제안 방법
- LPS (500 ng/ml)로 자극한 후 24시간 동안 배양한 뒤, 세포 상층액을 취해 96-well plate에 loading하였다. 100 ㎕의 그리스 시약을 첨가하고, 그 혼합물의 흡광도를 측정하였다. 흡광도는 spectrometer로 540 nm에서 측정하였다.
- 7 대식세포는 FBS (10 %)과 penicillin (100 U/ml)와 streptomycin sulfate (100 ㎍/ml)가 함유된 PRMI1640배지에서 습한 조건의 37℃, 5 % CO2 Incubator에서 배양하였다. Confluent를 70 %로 유지해주었고, 2일에 한번 씩 개대 배양을 하였다. Passage 3회 이상에서 실험에 사용하였고, 8회 이상이 되었을 때는 폐기하였다.
- ERK, p38, JNK의 phosphorylation과 Iκ-Bα, HO-1을 ECL detection 용액 (Amersham)으로 확인하였다.
- LPS (500 ng/ml)로 RAW 264.7 cell을 자극하기 전 삼채를 3시간동안 전 처리 하였다. Pro-inflammatory cytokine 의 생성에 미치는 약물의 효과를 검증하기 위해서 LPS로 자극한 후 24시간 뒤 이들 전염증성 사이토카인을 세포 상층액에서 ELISA법으로 정량하였다.
- 7 cell을 자극하기 전 삼채를 3시간동안 전 처리 하였다. Pro-inflammatory cytokine 의 생성에 미치는 약물의 효과를 검증하기 위해서 LPS로 자극한 후 24시간 뒤 이들 전염증성 사이토카인을 세포 상층액에서 ELISA법으로 정량하였다. ELISA는 Mouse ELISA kit for IL-1β, IL-6, TNF-α를 구입하여 시행하였다.
- RAW 264.7 세포에서 전염증성 사이토카인의 발현에 대한 삼채의 효과를 조사하기 위하여, 삼채를 다양한 농도로 전처리하고 LPS로 자극하였다. 24 시간 후 세포 상층액에서 IL-1β, IL-6, TNF-α를 측정한 결과 LPS 자극은 대식세포에서 IL-1β, IL-6, TNF-α 발현을 유의성있게 증가시켰다.
- 그리고 침전물에 DEPC 처리한 증류수를 15 ㎕씩 넣어 RNA를 용해시키고 정량 한다.mRNA의 발현을 정량적으로 표현하기 위해 정량 중합 효소 반응을 측정하였다. 합성된 cDNA 1 ㎕, Real time PCR master mix 4㎕ (Roche), pimer 및 probe를 넣고 PCR 조건으로 반응 시켰다.
- 7 세포의 생존율은 밀집세포의 미토콘드리아 탈수소 효소에 의해 자줏빛 formazan 생성물로 변하는 MTT환원을 바탕으로 MTT분석법으로 측정했다. 간단히 설명하면 지수성장을 하는 세포들은 RPMI-1640배지에서 동일한 밀도로 현탁하였고, 여러 가지 농도로 삼채를 처리하였다. 24시간 동안 배양한 뒤 5 mg/ml의 농도로 배양하기 위해서 MTT용액을 첨가하고 다시 30분 동안 배양하였다.
- 게다가 삼채 추출물은 HO-1을 유도하였고, 삼채의 HO-1 유도 능력이 삼채의 항염증 효과에 기여함을 보여주었다. 그리고 사이토카인 억제에 따른 염증 억제 기전으로 p38의 활성을 억제하였다.
- HO-1의 발현이 염증성 인자들을 억제하여 항염증 효과가 있음에 착안하면, 삼채의 HO-1의 유도가 궁극적으로 삼채의 nitrite와 IL-1β생성 억제에 크게 기여했다고 추측할 수 있다. 그리고 정말로 HO-1이 삼채의 염증 억제효과에 주요하게 작용하는 지 알아보기 위해, HO-1억제제를 처리하였다. HO-1억제제를 처리하면 삼채의 HO-1 유도 능력이 감소할 것이고, HO-1 유도능력이 감소하면 염증 억제효과가 감소할 것이라는 가정하에 연구를 진행한 결과, 예상대로 HO-1억제제를 처리 시 삼채의 항염증 효과가 감소하였다.
- 삼채 뿌리 70%에탄올 추출물의 대식세포 독성에 관해 알아보기 위하여 RAW 264.7 세포에 삼채 추출물을 여러 농도로 처리하여 24 시간 후에 세포의 생존율을 측정하였다. 그 결과 삼채 추출물을 처리한 실험군은 DMSO를 처리한 대조군에 비해 세포 생존율을 저하시키지 않았다.
- 삼채가 HO-1 발현에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 삼채 (500 ㎍/ml)을 처리하여 시간별로 HO-1의 발현을 관찰하였다. 그 결과, 삼채를 처리한 후 1시간부터 HO-1의 발현이 mRNA 수준 및 단백질 수준에서 증가하였다 (Fig.
- 삼채가 RAW 264.7 세포에서 LPS로 유도된 염증 억제 기전을 알아보기 위해 MAPK family인 ERK, JNK, p38의 활성화 정도를 알아보기로 하였다. MAPKs의 활성화는 각각의 인산화를 통해 이루어진다.
- 7 세포에서 LPS 자극에 의한 NO 생성에 미치는 영향을 조사하였다. 삼채를 다양한 농도로 3시간 전처리하고 LPS (500 ng/ml)로 자극하였다. 24 시간 후 세포 상층액에서 NO의 생성을 측정한 결과 LPS 자극은 대식세포에서 NO의 생성을 증가 시켰다.
- 3), mRNA수준에서도 전염증성 인자들을 억제하는지 알아보기로 하였다. 삼채를 다양한 농도로 전 처리한 후 LPS로 자극하였다. 24시간 후 IL-1β, IL-6, TNF-α의 mRNA를 측정한 결과 LPS 자극은 mRNA의 발현을 유의성있게 증가시켰다.
- 3), mRNA수준에서도 전염증성 인자들을 억제하는지 알아보기로 하였다. 삼채를 다양한 농도로 전 처리한 후 LPS로 자극하였다. 24시간 후 IL-1β, IL-6, TNF-α의 mRNA를 측정한 결과 LPS 자극은 mRNA의 발현을 유의성있게 증가시켰다.
- 삼채에서 유도된 HO-1이 과연 삼채의 항염증 작용에서 주요한 작용을 하는지 알아보기 위해, 삼채를 처리하기 전에, HO-1 억제제인, tin (Sn) protoporphryin-IX (SnPP)를 처리하였다. SnPP를 처리하고, 삼채를 처리하여 HO-1의 발현이 억제된 후, 삼채가 억제했던 IL-1β의 변화를 관찰한 결과, 삼채의 IL-1β억제 효과가 없어졌다 (Fig.
- 세포들은 RPMI-1640배지에서 2 x 105/well의 밀도로 현탁하였고, 여러 가지 농도로 삼채를 처리하였다. LPS (500 ng/ml)로 자극한 후 24시간 동안 배양한 뒤, 세포 상층액을 취해 96-well plate에 loading하였다.
- mRNA의 발현을 정량적으로 표현하기 위해 정량 중합 효소 반응을 측정하였다. 합성된 cDNA 1 ㎕, Real time PCR master mix 4㎕ (Roche), pimer 및 probe를 넣고 PCR 조건으로 반응 시켰다. PCR 조건은 92˚C에서 30초, 60˚C에서 45초, 그 후에 72˚C에서 30초를 40cycle로 하였다.
- 항염증 효과를 관찰하기 위하여, nitrite의 생성량과 전염증성 사이토카인 분비를 측정하였고, 그 조절기전으로 HO-1과 MAPKs, Iĸ-Bα를 관찰하였다.
- 효과를 규명하기 위해서, 대식세포주인 RAW264.7 세포에 lipopolysaccharide (LPS)로 염증을 유도하였을 때, nitrite와 IL-1β, IL-6, tumor necrosis factor (TNF)-α와 같은 염증성 인자들을 조사하였고, 그 조절 기전으로 HO-1과 mitogen activated-protein kinases (MAPKs), nuclear factor kappa B (NF-ĸB)의 변화를 관찰하였다.
대상 데이터
- Fetal bovine serum (FBS), RPMI-1640, penicillin -streptomycin등의 세포 배양용 시약들은 Gibco BRL (Grand Island, USA)사에서 배양조는 Corning (Rochester, USA)사에서 구입하였다. 실험에 사용된 시약 중 HEPES, sodium dodesyl sulfate (SDS), acrylamide, bisacrylamide, LPS, Tris-HCl 등은 SIGMA (St.
- RAW264.7 대식세포는 ATCC에서 동결상태로 구입하였다. RAW264.
- 7 대식세포는 ATCC에서 동결상태로 구입하였다. RAW264.7 대식세포는 FBS (10 %)과 penicillin (100 U/ml)와 streptomycin sulfate (100 ㎍/ml)가 함유된 PRMI1640배지에서 습한 조건의 37℃, 5 % CO2 Incubator에서 배양하였다. Confluent를 70 %로 유지해주었고, 2일에 한번 씩 개대 배양을 하였다.
- 실험에 사용된 시약 중 HEPES, sodium dodesyl sulfate (SDS), acrylamide, bisacrylamide, LPS, Tris-HCl 등은 SIGMA (St. Louis, USA)사에서 구입하였으며, 실험에 사용된 항체인 anti-phospho-extracelluar signal-regulated kinase (ERK 1/2), anti-phospho -c-Jun NH2-terminal kinase (JNK), anti-phospho -p38, anti-(inhibitory) Iĸ-Bα, anti-HO-1은 Cell signaling사 (Beverly, MA, USA)에서 구입하였다.
- 실험에 사용한 삼채는 (주)삼채, 순천만 삼채 농장에서 채집하였으며, 삼채 추출물의 제조 방법은 국내산 삼채 뿌리 10 g을 300 ml의 70 %에탄올을 사용하여 가열 환류추출한 후 여과하고 여액을 감압 농축하여 삼채 70 % 에탄올 추출물 (5.6 g, 수득율 56 %)을 얻었다.
데이터처리
- 모든 실험 결과는 3회 이상 실시하여 그 평균값을 기초로 Mean ± SE 로 나타나었으며, 실험결과에 대한 통계처리는 SPSS를 이용하여 Two-way ANOVA에 준하였고 p-value가 0.05 미만일 경우 유의한 것으로 판정하였다.
이론/모형
- RAW264.7 세포의 생존율은 밀집세포의 미토콘드리아 탈수소 효소에 의해 자줏빛 formazan 생성물로 변하는 MTT환원을 바탕으로 MTT분석법으로 측정했다. 간단히 설명하면 지수성장을 하는 세포들은 RPMI-1640배지에서 동일한 밀도로 현탁하였고, 여러 가지 농도로 삼채를 처리하였다.
성능/효과
- 1. 삼채 70% 에탄올 추출물은 대식세포에서 세포 독성을 보이지 않았다.
- 15분 후 인산화 정도를 측정한 결과 LPS로 자극한 RAW 264.7 세포에서는 ERK, JNK, p38의 활성과 Iĸ-Bα의 분해가 증가하였다.
- 2. 삼채 70% 에탄올 추출물은 nitrite와 IL-1β의 생성을 유의성 있게 억제하였다.
- 24 시간 후 세포 상층액에서 IL-1β, IL-6, TNF-α를 측정한 결과 LPS 자극은 대식세포에서 IL-1β, IL-6, TNF-α 발현을 유의성있게 증가시켰다.
- 삼채를 다양한 농도로 3시간 전처리하고 LPS (500 ng/ml)로 자극하였다. 24 시간 후 세포 상층액에서 NO의 생성을 측정한 결과 LPS 자극은 대식세포에서 NO의 생성을 증가 시켰다. 삼채를 전처리한 실험군에서는 nitrite의 생성이 유의하게 억제되었다(Fig.
- 24시간 후 IL-1β, IL-6, TNF-α의 mRNA를 측정한 결과 LPS 자극은 mRNA의 발현을 유의성있게 증가시켰다.
- 4. 삼채 70% 에탄올 추출물은 p38의 활성화를 억제하였다.
- 그리고 정말로 HO-1이 삼채의 염증 억제효과에 주요하게 작용하는 지 알아보기 위해, HO-1억제제를 처리하였다. HO-1억제제를 처리하면 삼채의 HO-1 유도 능력이 감소할 것이고, HO-1 유도능력이 감소하면 염증 억제효과가 감소할 것이라는 가정하에 연구를 진행한 결과, 예상대로 HO-1억제제를 처리 시 삼채의 항염증 효과가 감소하였다. 이는 삼채의 주요한 항염증 기전은 HO-1임을 보여준다.
- SnPP를 처리하고, 삼채를 처리하여 HO-1의 발현이 억제된 후, 삼채가 억제했던 IL-1β의 변화를 관찰한 결과, 삼채의 IL-1β억제 효과가 없어졌다 (Fig. 6).
- 삼채 추출물은 nitrite 생성과 IL-1β의 생성을 유의성있게 억제함으로서 염증 억제 효과를 보여주었다. 게다가 삼채 추출물은 HO-1을 유도하였고, 삼채의 HO-1 유도 능력이 삼채의 항염증 효과에 기여함을 보여주었다. 그리고 사이토카인 억제에 따른 염증 억제 기전으로 p38의 활성을 억제하였다.
- 7 세포에 삼채 추출물을 여러 농도로 처리하여 24 시간 후에 세포의 생존율을 측정하였다. 그 결과 삼채 추출물을 처리한 실험군은 DMSO를 처리한 대조군에 비해 세포 생존율을 저하시키지 않았다. 즉, 삼채는 RAW 264.
- 삼채가 HO-1 발현에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 삼채 (500 ㎍/ml)을 처리하여 시간별로 HO-1의 발현을 관찰하였다. 그 결과, 삼채를 처리한 후 1시간부터 HO-1의 발현이 mRNA 수준 및 단백질 수준에서 증가하였다 (Fig. 5A and B). 그리고 나서 3시간에 정점을 이루었고, 그러한 효과가 거의 24시간 까지 지속이 되었다.
- 삼채 추출물은 nitrite 생성과 IL-1β의 생성을 유의성있게 억제함으로서 염증 억제 효과를 보여주었다.
- 삼채를 전처리한 실험군에서는 IL-1β mRNA발현이 유의성있게 억제되었으나, IL-6, TNF-α 발현은 유의성있게 억제되지 않았다 (Fig. 4).
- 그렇기 때문에 HO-1을 유도하는 것은 추후 염증 조절에서 주요한 인자라고 할 수 있다. 이 연구에서 국내산 삼채의 뿌리를 70%에탄올로 추출하여, 그 추출물로 HO-1의 발현을 관찰한 결과, HO-1의 발현이 비교적 이른 시간(1시간)에 빠르게 일어남을 알 수 있었다. HO-1의 발현이 염증성 인자들을 억제하여 항염증 효과가 있음에 착안하면, 삼채의 HO-1의 유도가 궁극적으로 삼채의 nitrite와 IL-1β생성 억제에 크게 기여했다고 추측할 수 있다.
- 그리고 나서 3시간에 정점을 이루었고, 그러한 효과가 거의 24시간 까지 지속이 되었다. 이러한 효과는 삼채 농도 의존적으로 나타남에 따라 (Fig. 5C and D), 삼채의 HO-1 유도능이 있음을 알 수 있었다.
- 이상의 결과를 종합해 보면, 삼채 70% 에탄올 추출물은 대식세포에서 HO-1을 유도하고, p38의 활성을 억제하여 nitrite와 IL-1β의 생성을 억제함을 보여주었다.
후속연구
- 이상의 결과를 종합해 보면, 삼채 70% 에탄올 추출물은 대식세포에서 HO-1을 유도하고, p38의 활성을 억제하여 nitrite와 IL-1β의 생성을 억제함을 보여주었다. 삼채의 이와 같은 작용은 천식, 아토피, 관절염과 같은 자가 면역질환 뿐 문아니라, 소화기 염증질환, 피부염증 질환 등에도 응용이 가능할 것으로 생각된다. 향후 삼채 뿌리 뿐만 아니라 삼채 잎을 통해서도 연구가 이루어지고, 삼채 추출 용매를 변경하고 성분 분석을 하는 등 다양한 연구가 진행되어져야 할 것이다.
- 이상의 결과, 삼채 70% 에탄올 추출물은 대식세포에서 HO-1을 유도하고, p38의 활성을 억제하여 nitrite와 IL-1β의 생성을 억제하였으며, 추후 염증 질환 억제에 탁월한 효과를 보일 것으로 사료된다.
- 삼채의 이와 같은 작용은 천식, 아토피, 관절염과 같은 자가 면역질환 뿐 문아니라, 소화기 염증질환, 피부염증 질환 등에도 응용이 가능할 것으로 생각된다. 향후 삼채 뿌리 뿐만 아니라 삼채 잎을 통해서도 연구가 이루어지고, 삼채 추출 용매를 변경하고 성분 분석을 하는 등 다양한 연구가 진행되어져야 할 것이다.
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