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문제 정의
- 따라서 본 연구는 우리나라의 기후풍토와 토양환경에 잘 적응하여 살균력과 생존성이 뛰어난 세균을 선발하고자 우리나라 고추재배지역에서 탄저병이 발생한 고추로부터 항진균 물질을 생산하는 세균을 분리하고, 그 효과를 규명하여, 이를 고추 탄저병의 생물적 방제제로 이용하기 위한 기초적인 실험을 수행한 결과이다.
제안 방법
- Paenibacillus sp. IUB225-08 균주가 배지에서 생산한 물질이 C. gloeosporioides의 균사 생장에 대한 억제효과를 조사하기 위해 작물의 진균병 방제에 널리 사용되고 있는 7종의 농약과 부탄올 분획물의 효과를 비교하였다. 그 결과 Table 2와 같이 각각의 농약을 100 μg/mL 농도로 처리한 배지에서 C.
- IUB225-08 균주가 액체배지에서 생산한 항균물질과 시판 농약의 고추탄저병균 포자발아에 미치는 효과를 조사하기 위해 C. gloeosporioides의 포자 현탁액을 1~5 × 106 conidia/mL가 되도록 준비하여 PDA 배지에 1 mL씩 고르게 분주하여 접종하였다.
- 항균물질 생산을 위한 Paenibacillus sp. IUB225-08 균주의 최적 배양온도와 배양시간을 알아보기 위해 LB 배지 100 mL가 들어있는 삼각플라스크에 균을 접종하고 배양 온도를 각각 20℃, 25℃, 30℃, 40℃로 맞춘 뒤 180 rpm에서 72시간 동안 진탕 배양하였다. 균의 생장정도는 분광광도계(Ultrospec 2000, Pharmacia Biotech, England)를 사용하여 660 nm에서 측정하였다.
- IUB225-08가 생산한 물질의 부탄올 분획물을 100 μg/mL의 농도로 30 μL 처리한 후 70%의 상대습도가 유지되는 습실에 넣고 25℃에서 10일 동안 배양하여 고추에 발생한 탄저병의 발병정도를 조사하였다(Manandhar et al., 1995).
- 배지의 초기 pH가 Paenibacillus sp. IUB225-08의 항균물질 생산에 미치는 효과를 알아보기 위해 LB배지 100 mL에 1N HCl과 1N NaOH을 이용하여 pH를 4.0~10.0으로 조정한 후 균을 접종하고 25에서 180 rpm으로 72시간 진탕 배양한 후 배양액은 회수하여 10,000 rpm으로 30분간 원심분리(VS23STM, Vision Co., Korea)한 후 부탄올로 분획하고 동결건조한 후 농도를 희석하여 pH의 차이에 따른 균의 생장과 항균 활성을 조사하였다.
- 고추탄저병균의 포자를 접종한 고추종자에 대해 Paenibacillus sp. IUB225-08이 생산하는 물질의 항진균 효과를 조사하였다. 고추탄저병균의 포자를 접종하지 않은 대조군은 발아와 동시에 근모가 활발하게 형성되면서 정상적으로 생장하였으나, C.
- 고추에서 분리한 세균들이 C. gloeosporioides 균사의 생장을 억제하는지 조사하기 위해 PDA 배지에서 7일 배양한 고추탄저병균의 균사체를 직경 5 mm의 cork borer로 절단한 뒤 PDA 배지 중앙에 획선 접종된 분리균주에 20 mm의 간격으로 놓고, 25℃에서 5일간 대치배양한 후 생긴 생장저지대(Inhibition zone)를 단위로 측정하여 항균 효과가 높은 세균을 선발하였다(Schiewe and Mendgen, 1992; Victor and Editor, 1991).
- 고추종자를 0.5%의 차아염소산나트륨으로 30분간 소독하고 멸균수로 2회 수세한 뒤 6시간 동안 멸균수에 침지 후, C. gloeosporioides의 포자 현탁액 1 × 106 conidia/mL의 농도에서 1시간 침지한 다음 상온에서 건조시켰다.
- IUB225-08 균주의 최적 배양온도와 배양시간을 알아보기 위해 LB 배지 100 mL가 들어있는 삼각플라스크에 균을 접종하고 배양 온도를 각각 20℃, 25℃, 30℃, 40℃로 맞춘 뒤 180 rpm에서 72시간 동안 진탕 배양하였다. 균의 생장정도는 분광광도계(Ultrospec 2000, Pharmacia Biotech, England)를 사용하여 660 nm에서 측정하였다. 배양이 끝난 배양액은 회수하여 10,000 rpm으로 30분간 원심분리(VS23STM, Vision Co.
- 배양액을 부탄올로 분획하여 얻어진 물질과 시판되는 농약의 항균력을 비교하기 위해 carbendazim, benomyl, folpet, iprodione, polyoxin D zinc salt, polyoxin B, trifloxystrobin 등 7종의 농약과 항균물질을 생산하는 균주의 배양액을 부탄올로 분획하여 얻어진 물질을 건조한 후 각각 10 μg/mL, 100 μg/mL의 농도로 조정하고 멸균한 PDA 배지의 온도가 50℃일 때 넣고 잘 섞은 후 petri dish에 부어 굳혔다. 그리고 PDA에서 25℃, 5일 간 배양한 C. gloeosporioides 균사체를 멸균한 직경 5 mm의 cork borer로 절단한 후 각각의 농약과 부탄올 추출물이 함유되어있는 배지의 중앙에 접종하고 25℃에서 5일간 배양하여 각각의 공시된 항균물질의 균사생장 억제 효과를 mm 단위로 측정하였다.
- gloeosporioides의 포자 현탁액 1 × 106 conidia/mL의 농도에서 1시간 침지한 다음 상온에서 건조시켰다. 그리고 이 종자를 부탄올 분회물에 6시간 침지한 후 petri-dish 내에 멸균수로 적신 여과지 위에 올려놓고 습도 70%, 온도 25℃의 암 상태에서 14일간 관찰하여 종자의 발아 상태를 조사하였다.
- 대조군의 고추는 탄저병균만을 접종하였고, 처리군은 대조군과 같이 상처를 낸 고추에 고추탄저병균을 접종한 후 100 μg/mL 농도의 부탄올 분획물을 30 μL를 접종하였다.
- 배양액을 부탄올로 분획하여 얻어진 물질과 시판되는 농약의 항균력을 비교하기 위해 carbendazim, benomyl, folpet, iprodione, polyoxin D zinc salt, polyoxin B, trifloxystrobin 등 7종의 농약과 항균물질을 생산하는 균주의 배양액을 부탄올로 분획하여 얻어진 물질을 건조한 후 각각 10 μg/mL, 100 μg/mL의 농도로 조정하고 멸균한 PDA 배지의 온도가 50℃일 때 넣고 잘 섞은 후 petri dish에 부어 굳혔다.
- 분리한 길항세균 중 고추탄저병균의 포자발아에 억제력이 높은 균을 선발하기 위해 고추탄저병균의 균사생장에 억제력을 나타낸 각각의 균주들을 LB배지에 접종하여 25℃에서 180 rpm으로 2일 동안 진탕배양한 후 얻어진 배양액을 10,000 rpm으로 30분간 원심분리(VS23STM, Vision Co., Korea)한 후 상등액 50 μL를 paper disc (Avantec, 8 mm, Toyo Roshi Kaisha, Ltd. Japan)에 적셔, 탄저병균의 포자 현탁액(1~5 × 106 conidia/mL)이 1 mL접종된 PDA 배지의 중앙에 올려놓고 25℃에서 3일 간 배양한 뒤 생장저지대(inhibition zone)의 직경을 단위로 측정하여 포자의 발아를 억제하는 세균을 선발하였다.
- 선발된 항균물질 생산 세균을 동정하기 위해 Bergey’s Manual에 따라 그람염색, 내생포자염색, 형태, 운동성, 당 분해능 등의 생리·생화학적 특성을 분석하였으며(Holt et al., 1994), 이와는 별도로 Biolog(Biolog, Inc. USA)사의 Biolog MicroLog 3, 4.01 version을 이용하여 선발된 세균을 최종적으로 동정하였다.
- 시판되고 있는 cabendazim, iprodione, benomyl, folpet, polyoxin D zinc salt, polyoxin B, trifloxystrobin 등 7종의 농약과 배양액을 부탄올로 분획하여 얻어진 물질을 100 μg/mL의 농도로 50 μL씩 paper disc에 적신 후, 고추탄저병균의 포자가 접종된 PDA배지의 중앙에 접종하고 25℃에서 3일 동안 배양하여 생장저지대(inhibition zone)의 직경을 로 측정하였다.
- 대조군의 고추는 탄저병균만을 접종하였고, 처리군은 대조군과 같이 상처를 낸 고추에 고추탄저병균을 접종한 후 100 μg/mL 농도의 부탄올 분획물을 30 μL를 접종하였다. 접종처리가 끝난 대조군과 처리군의 고추는 25℃가 유지되는 70%의 습실에서 10일 간 배양한 후 탄저병의 발생 여부를 조사하였다. 배양 10일 후 C.
- 항균물질의 생산을 위해 선발한 균을 LB배지에 접종하고 25℃에서 180 rpm으로 72시간 동안 진탕 배양한 후 배양액을 10,000 rpm으로 30분간 원심분리(VS23STM, Vision Co., Korea)한 후 butanol과 물(1:1)로 3회 반복 분획 후 부탄올 층만을 회수하여 농축기(N-1, Tokyo Rikakikai Co., Japan)로 감압 농축한 후 동결건조(Operon Co., Korea)하여 고추탄저병균에 항균 활성을 나타내는 물질을 추출하였다(Fig. 1).
- 항진균 활성이 있는 세균을 분리하기 위하여 전국 60개 지역의 고추재배지에서 탄저병균에 감염된 고추열매를 채집하여 실험실로 옮겨 4℃에 보관하면서 균을 분리하였다.
대상 데이터
- gloeosporioides의 균사생장과 포자의 발아를 억제하는 균주들을 선발하여 그 중 가장 우수한 효과를 나타내는 Paenibacillus sp. IUB225-08을 최종 선발하였다.
- 국내 고추 재배지에서 고추탄저병균인 C. gloeosporioides에 대해 균사생장이나 포자발아 억제력이 우수한 균주를 선발하였다. 선발된 균주의 생리·생화학적특성과 MicroLog 방법을 이용하여 동정한 균주는 Paenibacillus sp.
- 순수 분리된 균주들이 생산한 물질의 항균성을 탐색하기 위해 고추에 탄저병을 일으키는 Colletotrichum gloeosporioides 균주를 서울대학교 식물병원성 곰팡이유전자 은행으로부터 분양받아 실험에 사용하였다.
- 5%(w/v), Difco, USA)를 사용하여 25℃에서 배양하였다. 항진균 물질을 생산하기 위한 배지로는 LB(Luria-Bertani; tryptone 1%(w/v), yeast extract 0.5%(w/v), NaCl 0.5%(w/v), Difco, USA)를 이용하여 25℃에서 180 rpm, 48시간 진탕배양 하였으며, 항진균력을 검정하기 위한 배지로는 항생제가 포함되지 않은 PDA(potato dextrose agar, potatoes infusion 20%(w/v), Bacto dextrose 2%(w/v), Bacto agar 1.5%(w/v), Difco, USA)를 사용하였다.
이론/모형
- 고추탄저병균에 항진균성을 나타낸 세균을 선발한 후 이를 동정하기 위해 Bergey’s Manual에 따라 조사한 형태적, 생리·화학적 특성은 Table 1과 같다.
성능/효과
- Paenibacillus sp. IUB225-08 균주가 생산하는 물질이 C. gloeosporioides의 포자발아에 미치는 효과를 규명하기 위해 7 종의 농약과 부탄올로 분획한 물질을 이용해 고추탄저병균의 포자 발아억제 실험을 수행한 결과, iprodione, folpet, polyoxin D zinc salt, polyoxin B 등 4종의 농약은 고추탄저병균의 포자 발아를 전혀 억제하지 못하는 것으로 나타나 실험에 사용한 고추탄저병 균주는 이들 농약에 대해 100% 저항성을 나타내고 있었으며, carbendazim, benomyl, trifloxystrobin 등 3종의 농약을 처리한 배지에서의 포자발아 억제환의 길이가 각각 15 mm, 12 mm, 10 mm로 나타나 포자의 발아가 농약에 의해 억제되는 것으로 나타났다. Paenibacillus sp.
- Paenibacillus sp. IUB225-08 균주의 배양액을 부탄올로 분획한 물질의 포자 발아의 억제환 길이는 23 mm로 나타나 포자 발아억제 효과가 실험에 사용한 모든 농약에 비해 높게 나타났다(Table 2).
- 이에 비해 Paenibacillus sp. IUB225-08 배양액을 부탄올로 분획한 물질을 처리한 군에서의 균사생장은 62.5%가 억제되어 시판농약에 비해 항균효과가 높게 나타났다(Table 2, Fig. 5).
- Paenibacillus sp. IUB225-08를 배양한 액체배지에 부탄올을 첨가하여 분획한 물질과 시판 농약의 C. gloeosporioides에 대한 균사생장과 포자 발아억제 효과를 조사한 결과 부탄올 분획물이 시판 농약에 비해 고추탄저병균의 균사생장과 포자발아를 크게 억제하는 것으로 나타났다. 또한 고추열매와 고추종자에 C.
- Paenibacillus sp. IUB225-08의 배양액과 배양액을 부탄올로 분획한 물질의 C. gloeosporioides 포자에 대한 발아억제력을 분석한 결과 부탄올로 분획한 물질의 포자 발아 억제력이 배양액에 비해 2배 이상 높게 나타났다. 따라서 Paenibacillus sp.
- 따라서 Paenibacillus sp. IUB225-08의 배양액을 부탄올로 분획해서 분리한 물질에는 항진균 효과를 나타내는 유효성분이 배양액에 비해 많이 함유되어 있다는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4).
- IUB225-08이 생산하는 물질의 항진균 효과를 조사하였다. 고추탄저병균의 포자를 접종하지 않은 대조군은 발아와 동시에 근모가 활발하게 형성되면서 정상적으로 생장하였으나, C. gloeosporioides를 접종한 종자에서는 종자가 부패하면서 배축에서 모마름병 증상이 발생한 것을 확인 할 수 있었다. 본 실험 결과는 Lee (1995)가 고추종자의 종피, 배유 및 자엽에서 G.
- 그 결과 Table 2와 같이 각각의 농약을 100 μg/mL 농도로 처리한 배지에서 C. gloeosporioides의 균사체를 배양했을 때 대조군에 비해 carbendazim은 37.5%, iprodione는 55%, benomyl과 trifloxystrobin 등은 각각 52.5%의 균사생장이 억제되었으며, polyoxin D zinc salt와 polyoxin B는 균사생장이 각각 10% 억제 되었고, folpet을 처리한 배지에서는 균사생장이 전혀 억제되지 않았다.
- 또한 이 균주는 최적 배양온도는 25℃인 것으로 나타났다. 따라서 항진균물질의 생산을 위한 최적의 배양 조건은 pH 7.0과 25℃에서 60시간 배양하는 것으로 나타났다(Fig. 3).
- gloeosporioides에 대한 균사생장과 포자 발아억제 효과를 조사한 결과 부탄올 분획물이 시판 농약에 비해 고추탄저병균의 균사생장과 포자발아를 크게 억제하는 것으로 나타났다. 또한 고추열매와 고추종자에 C. gloeosporioides 포자와 부탄올로 분획한 물질을 동시에 접종한 결과 부탄올 분획물이 고추와 고추종자의 병 발생을 억제하는 것으로 나타났다. 따라서 본 연구를 통해 Paenibacillus sp.
- 배지의 초기 pH 및 배양 온도가 항진균물질의 생산에 매우 큰 영향을 준다는 보고에 따라(Gong et al., 2003) pH가 항진균물질의 생산에 미치는 효과를 조사한 결과균의 생장은 pH 8.0 에서 가장 높게 나타났으며, 항진균 물질의 생산은 pH 7.0에서 가장 우수하였다(Fig. 2). 또한 이 균주는 최적 배양온도는 25℃인 것으로 나타났다.
- dematium를 분리하여, 이들 균이 고추종자의 모잘록병 및 모마름병을 일으킨다고 보고한 것과 매우 유사한 것으로 사료되었다. 부탄올 분획 물질을 처리한 군은 대조군에 비해 종자의 발아는 느리게 진행되었지만 종자가 발아하여 근모를 형성하고 병이 발생하지 않는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 6). Park et al.
- IUB225- 08로 명명되었다. 항진균물질의 최적 생산을 위한 배양 조건은 pH 7.0, 25℃에서 60시간인 것으로 나타났다. Paenibacillus sp.
후속연구
- gloeosporioides의 포자만을 접종한 대조군에서는 고추탄저병이 발생하였으나 부탄올 분획물을 처리한 실험군은 고추탄저병이 발생하지 않아 Paenibacillus sp. IUB225-08 균주가 배지에 분비한 물질에는 고추탄저병균의 균사체나 포자의 생장을 억제할 수 있는 함유되어 있다는 것이 밝혀져, 실용화를 위해서는 앞으로 포장 실험을 통한 항균효과 입증 실험이 필요한 것으로 사료되었다(Fig. 7).
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