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문제 정의
- 이에 본 연구는 V. alginolyticus에 대한 특성을 규명하고 이를 사멸 시킬 수 있는 파아지를 개발하고자하였다. 우선 V.
- 이에 본 연구에서는 서해안 양식장의 해수와 어ㆍ패류로부터 V. alginolyticus와 이에 대한 특이적인 파아지를 분리 동정 하였다. 분리된 V.
제안 방법
- 지난해 7-8월 사이에 우리나라의 서해안 및 남해안에 위치한 100여 군데의 양식장에서 물 샘플을 확보하였다. V. alginolyticus는 전복과 넙치에 병어 샘플로부터 멸균 면봉을 이용 하여 채취한 후 alkaline peptone water (APW) 에 증균 배양 하며 thiosulfate- citrate-bile salts-sucrose agar (TCBS) 를 선택배지로 하여 동정하였다. API20E kit (BioMerieux, France) 와 16S rRNA gene을 이용하여 V.
- V. alginolyticus를 대상으로 서해안 양식장의 물샘플을 이용하여 한 종의 파아지 VAP11을 분리 하였다. 이 파아지는 spot assay에서 투명한 용균 반점을 형성 하는 것으로 나타났다.
- 구리 grid (200 mesh) 에 파아지 정제액 5 µl을 묻혀 1∼2분간 건조시켰으며 2% uranyl acetate용액으로 30초간 염색하여 건조한 후 전자현미경 (HITACHI H-7650, JAPAN) 100 KV하에서 파아지의 형태를 관찰하고 촬영을 하였다.
- 정제된 파아지액 20 µl에 5배 농축의 loading buffer를 넣은 후 100 ℃에서 2∼3분 단백질들의 시스테인결합을 끊어 순수하게 단백질 크기로만 분리하고 5% stacking gel과 12% separating gel을 만들어 100 V로 50분간 SDS-PAGE하였다. 그리고 Coomassie blue법으로 2시간 염색한 후 10% acetate와 15% methanol을 섞은 탈색액으로 탈색시켜 밴드를 확인 후 gel은 gel dry-film에 부착시켜 파아지의 구조 단백질을 관찰하였다.
- 또 분리된 파아지 핵산이 DNA인지 RNA인지를 확인하기 위하여 각각 DNase 100 µl/ml 및 RNase 100 µl/ml으로 37 ℃에서 2시간 처리한 핵산과 대조군으로 효소를 처리 하지 않은 핵산을 함께 0.7% agarose gel에 전기영동 시킨 후 UV 하에서 관찰 하였다.
- alginolyticus) 는 우리나라 전 연안에서 높은 빈도로 발견되며 인간 및 어패류에 감염을 유발시키는 박테리아의 일종이다. 본 연구는 서해안 양식장의 해수와 어패류에서 V. alginolyticus와 이에 대한 특이적인 용균성 파아지를 분리하였으며 분리된 파아지의 형태학적 특성을 전자현미경으로 확인 하였다. 또한 파아지의 핵산의 종류 및 구조 단백질의 특성 대한 연구가 수행되었다.
- alginolyticus와 이에 대한 특이적인 파아지를 분리 동정 하였다. 분리된 V. alginolyticus 특이 파아지에 대한 구조적 특성을 조사하였다.
- 분리한 파아지 핵산을 ethdium bromide 5 µl/ml가 첨가된 0.7% agarose gel에서 100 V의 전압으로 전기영동 한 후 UVtransilluminator (SL-20, USA) 에서 관찰하였다.
- 순수 분리한 파아지 VAP11에 대한 negative stain으로 그 형태를 관찰 하였다. 파아지 VAP11은 60nm 크기의 둥근 육각형의 두부 형태였으며, 미부는 상대적으로 짧았으며 크기는 20 nm였다 (Fig.
- 여과된 파아지 샘플을 원균주인 V. alginolyticus 500 µl가 도말되어 있는 3% 식염이 첨가된 BHI 배지에 접종하여 나타나는 monolayer spot plaque을 관찰하였다.
- alginolyticus에 대한 특성을 규명하고 이를 사멸 시킬 수 있는 파아지를 개발하고자하였다. 우선 V. alginolyticus를 서해안 양식장의 해수와 어패류로부터 분리 동정 하였으며 이에 대한 특이적인 파아지를 분리하여 그에 대한생물학적 특성을 조사하였다. 이러한 결과들을 바탕으로 Vibrio 질병에 대한 예방 및 치료 대책의 가능성이 수월해 질 것으로 생각된다.
- 이후 V. alginolyticus가 더 이상 자라지 않는 것을 확인한 후 파아지가 있는 것으로 추정되는 배양액을 800 × g으로 원심 분리하였으며 상청액을 0.2 µm 실린지 필터로 여과하였다.
- 물 샘플의 여과 및 파아지 증식용 액체 배지는 이 등 (2011) 의 여과 및 액체배지 제조 방법에 준하였다. 파아지가 V. alginolyticus를 통해 증식되는 역가를 확인하기 위해 2% NaCl을 첨가한 Brain Heart Infusion(이하 BHI) 평판 배지를 사용 하였으며 BHI 액체배지에 0.7% 한천을 첨가하여 autoclave 한 후 cap tube에 5 ml씩 분주하여 사용하였다.
대상 데이터
- DNA sequencing에 사용된 V. alginolyticus의 16S rRNA gene에 대한 universal primer는 F, 5'-AGAGTTT GATCMTGGCTCAG-3', R, 5'-TACGGYTACCTTGT TACGAC-3'을 각각 사용하였다.
- 지난해 7-8월 사이에 우리나라의 서해안 및 남해안에 위치한 100여 군데의 양식장에서 물 샘플을 확보하였다. V.
이론/모형
- 물 샘플의 여과 및 파아지 증식용 액체 배지는 이 등 (2011) 의 여과 및 액체배지 제조 방법에 준하였다. 파아지가 V.
- 파아지 구조 단백질 분석은 Laemmli (1970) 의 방법에 준하여 실시하였다. 정제된 파아지액 20 µl에 5배 농축의 loading buffer를 넣은 후 100 ℃에서 2∼3분 단백질들의 시스테인결합을 끊어 순수하게 단백질 크기로만 분리하고 5% stacking gel과 12% separating gel을 만들어 100 V로 50분간 SDS-PAGE하였다.
- 파아지를 농축시키기 위해 증폭 되어진 파아지액에 20% polyehthylene glycol 6000 (PEG 6000) 과 3% NaCl을 넣고 4 ℃ 하룻밤 정치한 후 10,000 × g에서 30분 원심 분리 하는 PEG 침전법을 사용하였다.
- 파아지를 농축시키기 위해 증폭 되어진 파아지액에 20% polyehthylene glycol 6000 (PEG 6000) 과 3% NaCl을 넣고 4 ℃ 하룻밤 정치한 후 10,000 × g에서 30분 원심 분리 하는 PEG 침전법을 사용하였다. 파아지의 정제는 CsCl 밀도구배 원심분리법를 이용하였다. CsCl의 구배를 ρ 1.
- 파아지의 형태관찰은 이 등 (2011) 의 형태 관찰 방법에 따라 실시하였다. 구리 grid (200 mesh) 에 파아지 정제액 5 µl을 묻혀 1∼2분간 건조시켰으며 2% uranyl acetate용액으로 30초간 염색하여 건조한 후 전자현미경 (HITACHI H-7650, JAPAN) 100 KV하에서 파아지의 형태를 관찰하고 촬영을 하였다.
성능/효과
- 한편 gelatin 분해율과 citrate이용 능에 있어서는 차이가 있는 것으로 나타났다. 16S rRNA universal primer를 이용한 염기 서열 분석 실험에서는 Genbank에 등록 된 V. alginolyticus의 16S ribosomal RNA gene과 99.7% 상동성을 나타내어 분리 된 박테리아가 V. alginolyticus 임이 증명 되었다.
- alginolyticus는 전복과 넙치에 병어 샘플로부터 멸균 면봉을 이용 하여 채취한 후 alkaline peptone water (APW) 에 증균 배양 하며 thiosulfate- citrate-bile salts-sucrose agar (TCBS) 를 선택배지로 하여 동정하였다. API20E kit (BioMerieux, France) 와 16S rRNA gene을 이용하여 V. alginolyticus임을 증명하였다.
- alginolyticus ATCC 17749와 유사한 둥글고 진한 황색을 나타내는 것으로 확인하였다. V. alginolyticus를 API20E kit로 실험한 결과 lysine decarboxylase, ornithin decarboxylase, indol, glucose, mannitol, sucrose, oxidase에는 두 균 모두 양성 반응을 보였으나 gelatin 분해율과 citrate 이용 능에서는 차이가 있었다. 그러나 대조군으로 사용한 표준 균주인 V.
- 균주 분리를 위해 전복과 넙치의 병어 샘플로부터 멸균 면봉을 이용하여 채취한 후 APW에 증균 배양하여 TCBS를 선택배지를 이용한 집락의 형태적 특성은 KCTC에서 분양 받은 표준 균주인 V. alginolyticus ATCC 17749와 유사한 둥글고 진한 황색을 나타내는 것으로 확인하였다. V.
- 그리고 DNase와 RNase를 처리한 결과 DNase 처리 샘플에서는 효소에 의해서 분해되어 밴드를 관찰 할 수 없었으며 RNase 처리 샘플에서는 파아지 VAP11의 핵산과 같은 위치에 밴드가 확인 되었다. 그 결과 파아지 VAP11의 핵산은 DNA인 것으로 확인 되었다.
- alginolyticus를 API20E kit로 실험한 결과 lysine decarboxylase, ornithin decarboxylase, indol, glucose, mannitol, sucrose, oxidase에는 두 균 모두 양성 반응을 보였으나 gelatin 분해율과 citrate 이용 능에서는 차이가 있었다. 그러나 대조군으로 사용한 표준 균주인 V. alginolyticus ATCC 17749와 유사한 생화학적 특성을 나타내는 것으로 보아 V. alginolyticus로 동정 할 수 있었다 (Table 1). 또한 16S rRNA universal primer를 이용한 염기 서열 분석 결과 Genbank에 등록되어진 accession number HM771350.
- 2). 그리고 DNase와 RNase를 처리한 결과 DNase 처리 샘플에서는 효소에 의해서 분해되어 밴드를 관찰 할 수 없었으며 RNase 처리 샘플에서는 파아지 VAP11의 핵산과 같은 위치에 밴드가 확인 되었다. 그 결과 파아지 VAP11의 핵산은 DNA인 것으로 확인 되었다.
- alginolyticus로 동정 할 수 있었다 (Table 1). 또한 16S rRNA universal primer를 이용한 염기 서열 분석 결과 Genbank에 등록되어진 accession number HM771350.1인 V. alginolyticus의 16S ribosomal RNA gene과 99.7% 상동성을 나타내었다.
- 본 연구에서 확보된 파아지의 형태학적 특징으로 보아 DNA 파아지일 것으로 추정되었으며 파아지 VAP11의 핵산은 23 Kb 크기의 핵산인 것으로 전기영동 결과 확인 되었다. 또한 핵산을 RNase와 DNase로 처리 하였을 시 DNase에서만 분해되었으므로 파아지 VAP11의 핵산은 DNA인 것으로 최종 확인 되었다.
- Bradley 등 (1967) 에 의하면 수축하지 않는 짧은 꼬리를 가진 형태의 파아지는 핵산으로 이중나선 DNA를 가진다고 하였다. 본 연구에서 확보된 파아지의 형태학적 특징으로 보아 DNA 파아지일 것으로 추정되었으며 파아지 VAP11의 핵산은 23 Kb 크기의 핵산인 것으로 전기영동 결과 확인 되었다. 또한 핵산을 RNase와 DNase로 처리 하였을 시 DNase에서만 분해되었으므로 파아지 VAP11의 핵산은 DNA인 것으로 최종 확인 되었다.
- 또한 파아지의 핵산의 종류 및 구조 단백질의 특성 대한 연구가 수행되었다. 분리된 파아지는 형태학적으로 60 nm의 육각형 두부와 20 nm의 짧은 미부를 가진 podoviridae과로 분류되었다. 핵산을 분리한 결과 23 Kb 크기의 DNA로 판명 되었으며 구조 단백질은 37.
- cereus) 파아지는 여섯 종류의 단백질 분획이 존재 하는 것으로 나타났다. 세 종류의 파아지 모두 90.5 kDa과 61.5 kDa 사이에 두 종류의 단백질 분획이 공통적으로 존재 하였고 파아지 VAP11과 E. tarda 파아지 사이의 구조 단백질의 양상은 거의 유사 하였으나 E. tarda 파아지에서 세 종류의 단백질 분획이 더 존재 하는 것으로 나타났다. 파아지 VAP11과 B.
- 이 전에 분리된 V. alginolyticus를 사용하여 서해안 양식장으로부터 100개의 물 샘플을 가지고 시험한 결과 한 종류의 파아지가 분리 되었으며 이를 VAP11이라 명명하였다.
- 파아지 VAP11과 B. cereus 파아지 사이의 구조 단백질은 공통적인 한 종류의 뚜렷한 밴드를 가지고 있었으며 세 종류의 파지 중 B. cereus 파아지에 가장 작은 단백질 분획이 존재 하는 것으로 나타났다.
- 3는 파아지 VAP11의 구조적 단백질의 특성을 알아보기 위해 실시한 SDS-PAGE에 대한 결과이다. 파아지 VAP11은 37.8 kDa과 198 kDa 사이에 일곱 종류의 단백질 분획이 존재하고 Edwardsiella tarda(E. tarda) 파아지는 열 종류의 단백질 분획이 존재하였으며 Bacillus cereus (B. cereus) 파아지는 여섯 종류의 단백질 분획이 존재 하는 것으로 나타났다. 세 종류의 파아지 모두 90.
- 파아지 VAP11의 핵산을 앞의 실험 방법으로 분리한 다음 Lamda DNA / Hind Ⅲ를 size marker로 하여 0.7% agarose gel 전기영동 한 결과 23 Kb 정도의 DNA size band를 관찰 할 수 있었다 (Fig. 2). 그리고 DNase와 RNase를 처리한 결과 DNase 처리 샘플에서는 효소에 의해서 분해되어 밴드를 관찰 할 수 없었으며 RNase 처리 샘플에서는 파아지 VAP11의 핵산과 같은 위치에 밴드가 확인 되었다.
- 파아지의 구조 단백질 분석에서는 37.8 kDa과 198 kDa사이에 일곱 종류의 단백질 분획이 존재하는 것으로 나타났으며 기존에 보유한 E. tarda 파아지와 비교시 세 종류의 단백질 분획이 더 존재 하였으며 B. cereus 파아지에서는 한 종류의 분획이 덜 존재하는 것으로 확인 되었다. 그러나 형태학적으로 E.
- 이 파아지는 spot assay에서 투명한 용균 반점을 형성 하는 것으로 나타났다. 파아지의 형태적인 특성은 두부와 미부를 가진 파지로서 두부는 둥근 육각형에 가까우며 크기는 60 nm이고 미부는 짧았으며 크기는 20 nm로 Ackermann & Nguyen (1983) 과 Bladley 등 (1967) 의 파아지 분류 중 C형에 속하는 것으로 확인 되었으며 ICTV의 분류 기준에 의하면 podoviridae과에 속하는 것으로 추측 된다. 주 등(1997) 이 보고한 V.
- 분리된 파아지는 형태학적으로 60 nm의 육각형 두부와 20 nm의 짧은 미부를 가진 podoviridae과로 분류되었다. 핵산을 분리한 결과 23 Kb 크기의 DNA로 판명 되었으며 구조 단백질은 37.8 kDa과 198 kDa 사이에 7종류의 단백질 분획이 존재함을 확인 하였다.
후속연구
- 결론적으로 본 연구에서는 V. alginolyticus 파아지 VAP11의 기본적인 특성을 밝혔으며 이러한 결과들은 각종 박테리아성 질병의 예방 및 치료를 위한 항생제 대체제로서 숙주균 특이 파아지 개발을 위해 기초자료로 활용될 수 있을 것으로 생각된다.
- cereus 파아지에서는 한 종류의 분획이 덜 존재하는 것으로 확인 되었다. 그러나 형태학적으로 E. tarda 파아지와 VAP11은 같은 과에 속하는 것처럼 보였으나 각 단백질의 크기와 수에 있어서 다소 차이가 있는 것으로 보아 추후 같은 모양을 가진 종의 파아지를 세분화 시키고자 할 때 SDS-PAGE가 유용하게 이용될 수 있을 것으로 생각된다.
- alginolyticus를 서해안 양식장의 해수와 어패류로부터 분리 동정 하였으며 이에 대한 특이적인 파아지를 분리하여 그에 대한생물학적 특성을 조사하였다. 이러한 결과들을 바탕으로 Vibrio 질병에 대한 예방 및 치료 대책의 가능성이 수월해 질 것으로 생각된다.
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