[논문]재조합 단백질 A 제조공정시료의 안정성실험에 관한 연구

김유곤; 이우종; 원찬희; 신철수

doi:10.5806/ast.2012.25.6.483

[국내논문] 재조합 단백질 A 제조공정시료의 안정성실험에 관한 연구
Study on stability test of in process sample of recombinant Protein A 원문보기

분석과학 = Analytical science & technology, v.25 no.6, 2012년, pp.483 - 491

김유곤 (한국생산기술연구원) , 이우종 (한국생산기술연구원) , 원찬희 (전북대학교 환경공학과) , 신철수

초록
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본 연구는 재조합 단백질 A를 생산하기 위한 정제공정 즉, 생산공정은 양이온교환칼럼(SP)과 음이온교환칼럼(Q)을 통하여 정제한 후 최종 재조합 단백질 A를 생산하게 되는데, 공정단계별로 생산된 시료를 바로 다음단계 공정으로 가지 못하는 경우 보관을 하는데 있어 안정성 확보 문제를 가지고 있다. 이에 본 연구에서 생산공정에서 생산된 시료를 보관 했을때 적정 보관조건과 시간을 알아보고자 하는데 목적이 있다. 즉, 공정시료의 저장방법 및 저장기간 설정과 경시변화에 따른 품질의 안정성의 평가를 목적으로 한다. 실험항목은 엔도톡신, SDS PAGE, HPLC 순도 그리고 농도이다. 실험결과 양이온교환칼럼 통과 후 냉장($4^{\circ}C$), 실온보관에서 SDS PAGE는 major band, 엔도톡신은 5.0 Eu/mg이하, 농도에서는 평균 8.21~8.24 mg/mL, RSD% 0.10~0.62%, 그리고 HPLC 순도 214 nm에서 평균 99.24~99.37%, RSD% 0.22~0.29%, 280 nm에서 평균 89.72~89.80%, RSD% 0.62~1.26%로서 다소 안정된 결과를 나타내었다. 음이온칼럼통과 후 냉장($4^{\circ}C$), 실온보관에서 SDS PAGE major band, 엔도톡신 0.5 Eu/mg이하, 농도는 평균 5.59 mg/mL, RSD% 0.03~0.10% 그리고 HPLC 순도 214 nm에서 평균 99.74%, RSD% 0.10~0.11%, 280 nm에서 평균 96.16~96.85%, RSD% 0.72~1.13%의 결과를 보였다. 상기의 실험결과로 재조합 단백질 A 제조공정시료의 실온과 $4^{\circ}C$에서 7~8 일 그리고 20~21 일 보관은 물질분해 특성이 없이 안정성이 확보 되었다는 결론을 얻을 수 있었다.

Abstract ▼ AI-Helper

This study is to investigate the issues on how to secure stability during the purification process for the production of recombinant protein A. The final recombinant protein A is produced by passing through the cation exchange column (SP) and the anion-exchange column (Q) during the production process, for which the samples produced by the step-by-step processes can be exposed to trouble in securing stable storage in case the next process cannot be taken within the proper time period. Accordingly, this study aims to evaluate the proper storage conditions and length of time when storing samples produced in the production process. That is, in this study, how to store fair samples, how long the storage period should be set up, and how to evaluate the security of its quality depending on time are dealt with. The items to be experimented with were enodotoxin, SDS-PAGE, HPLC purity and concentration. Experimental results showed that after passing the cation exchange column, when stored at $4^{\circ}C$ or room temperature, SDS-PAGE showed a major band, endotoxin is 5.0 Eu/mg or less, and concentration is on average of 8.21 to 8.24 mg/mL and RSD% 0.10~0.62%. In addition, HLPC purity showed somewhat stable results; at the HPLC purity 214 nm, the average is 99.24% to 99.37% and RSD% is 0.22~0.29%, while the average is 89.72% to 89.80% and RSD% 0.62~1.26% at 280 nm. On the contrary, after passing the anion exchange column, when stored at $4^{\circ}C$ or room temperature, SDS-PAGE revealed the major band, endotoxin is 0.5 Eu/mg or less, and concentration is on average of 5.59 mg/mL and RSD% 0.03~0.10%. when it comes to HLPC purity, the result showed that at the HPLC purity 214 nm, the average is 99.74% and RSD% is 0.10~0.11%, while the average is 96.16% to 96.85% and RSD% 0.72~1.13%. In conclusion, the stability of fair samples of recombinant protein A during the manufacturing process could be obtained without substance decomposition for 7~8 days at $4^{\circ}C$ or 20~21 days at room temperature.

Keyword

AI 본문요약
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문제 정의

본 실험의 목적은 rProtein A의 제조공정시료의 안정성실험을 목적으로 한다. 즉, 양이온교환칼럼과 음이온교환칼럼을 통화하여 정제된 공정시료의 실온보관과 4 °C에서의 보관조건에서 얼마 시간동안 안정성을 확보하는가를 보자고 하였으며, 실험항목은 엔도톡신, SDS PAGE, HPLC 순도, 농도등의 실험을 진행하였다.
본 실험은 순도를 보는 실험으로서 214 nm, 280 nm에서 HPLC Chromatogram의 순도를 확인하는 실험이다. 즉, Chromatogram상에서 주 peak이외에 다른 peak가 얼마정도의 %를 함유하는지 확인 하고자 하였다.
본 실험은 순도를 보는 실험으로서 214 nm, 280 nm에서 HPLC Chromatogram의 순도를 확인하는 실험이다. 즉, Chromatogram상에서 주 peak이외에 다른 peak가 얼마정도의 %를 함유하는지 확인 하고자 하였다. 그리고 실험은 초기 즉, 양이온교환칼럼을 통과시킨 시료 4 ℃ 보관에서 처음 실험한 값을 초기라고 하였으며, 1, 2, 3, 6, 7, 10, 15 그리고 20 일에 각각 냉장 보관 되어 있던 시료를 꺼내어 실험을 수행하고 실온보관에서는 초기, 1, 2, 3, 6, 7 일에 걸쳐 실험을 수행하였다.
본 실험은 rProtein A를 제조하기위해 양이온교환칼럼 통과 후의 시료를 냉장(4 °C)보관 했을때 안정성 여부를 확인하고자 하였다.
본 실험은 음이온교환칼럼 통과 후의 시료를 냉장 (4 °C)보관 했을때 안정성 여부를 확인하고자 하였다.
본 실험은 양이온교환칼럼 통과 후의 시료를 실온 보관 했을때 안정성 여부를 확인하고자 하였다. 실험 항목은 SDS PAGE, 엔도톡신, 농도 그리고 HPLC 순도 등이며, HPLC 순도실험에서는 214 nm, 280 nm에서 실험을 수행하였으며, 실험기간은 초기에서 7 일에 걸쳐 실험을 수행하였다.
본 실험은 음이온교환칼럼 통과 후의 시료를 실온 보관 했을때 안정성 여부를 확인하고자 하였다. 실험 항목은 SDS PAGE, 엔도톡신, 농도 그리고 HPLC 순도 등이며, HPLC 순도실험에서는 214 nm, 280 nm에서 실험을 수행하였으며, 실험기간은 초기에서 8 일에 걸쳐 실험을 수행하였다.

제안 방법

즉, 양이온교환칼럼과 음이온교환칼럼을 통화하여 정제된 공정시료의 실온보관과 4 °C에서의 보관조건에서 얼마 시간동안 안정성을 확보하는가를 보자고 하였으며, 실험항목은 엔도톡신, SDS PAGE, HPLC 순도, 농도등의 실험을 진행하였다.
미생물(E.Coli)를 이용하여 발효를 거쳐 원심분리하여 cell만을 모은 다음 cell lysis를 한 후 양이온교환 칼럼(SP Column)을 거쳐 정제한 후 다시 음이온교환 칼럼(Q Column)을 거쳐 정제 후 최종여과(UF)를 거쳐 제조 한다. 제조공정에 관한 절차를 Table 2에 나타내었다.
실험순서는 농도를 알고 있는 재조합단백질 A 공정 시료를 1 mg/mL로 희석(희석액 이동상)후 Blank 시료를 준비(이동상)하여 준비된 시료를 HPLC에 주입(주입양 : 50 µL)하여 241 nm, 280 nm dual mode로 분석 하였다.
재조합단백질 A를 생산하기 위해 정제단계를 거친, 먼저 양이온교환칼럼(SP)을 통과시킨 공정시료를 4 ℃에서 20 일 까지, 실온에서 7 일 까지 보관하면서 지정된 일자에 꺼내어 실험을 수행하였다. 그리고 음이온교환칼럼(Q)을 통과시킨 공정시료를 4 ℃에서 21일 까지, 실온에서 8 일 까지 보관하면서 지정된 일자에 꺼내어 실험을 수행하였다.
재조합단백질 A를 생산하기 위해 정제단계를 거친, 먼저 양이온교환칼럼(SP)을 통과시킨 공정시료를 4 ℃에서 20 일 까지, 실온에서 7 일 까지 보관하면서 지정된 일자에 꺼내어 실험을 수행하였다. 그리고 음이온교환칼럼(Q)을 통과시킨 공정시료를 4 ℃에서 21일 까지, 실온에서 8 일 까지 보관하면서 지정된 일자에 꺼내어 실험을 수행하였다.
실험항목은 HPLC 순도, 농도, SDS Page, 엔도톡신 등 4개의 실험 항목에 대하여 실험을 수행하였다.
즉, Chromatogram상에서 주 peak이외에 다른 peak가 얼마정도의 %를 함유하는지 확인 하고자 하였다. 그리고 실험은 초기 즉, 양이온교환칼럼을 통과시킨 시료 4 ℃ 보관에서 처음 실험한 값을 초기라고 하였으며, 1, 2, 3, 6, 7, 10, 15 그리고 20 일에 각각 냉장 보관 되어 있던 시료를 꺼내어 실험을 수행하고 실온보관에서는 초기, 1, 2, 3, 6, 7 일에 걸쳐 실험을 수행하였다. 그리고 음이온교환칼럼은 통과시킨 4 ℃ 보관 시료에서 초기, 1, 2, 3, 7, 8, 11, 15 그리고 21 일에 상기와 같은 방법으로 실험을 수행하였으며 실온보관 시료는 초기, 1, 2, 3, 7, 8 일에 걸쳐 실험을 수행하였다.
그리고 실험은 초기 즉, 양이온교환칼럼을 통과시킨 시료 4 ℃ 보관에서 처음 실험한 값을 초기라고 하였으며, 1, 2, 3, 6, 7, 10, 15 그리고 20 일에 각각 냉장 보관 되어 있던 시료를 꺼내어 실험을 수행하고 실온보관에서는 초기, 1, 2, 3, 6, 7 일에 걸쳐 실험을 수행하였다. 그리고 음이온교환칼럼은 통과시킨 4 ℃ 보관 시료에서 초기, 1, 2, 3, 7, 8, 11, 15 그리고 21 일에 상기와 같은 방법으로 실험을 수행하였으며 실온보관 시료는 초기, 1, 2, 3, 7, 8 일에 걸쳐 실험을 수행하였다.
본 실험에 사용된 UV는 GE, GeneQuant이며 측정 파장은 280 nm 이였다. 농도 기준은 5.0 mg/mL 이상으로서, 양이온 및 음이온교환칼럼정제 시료 초기 농도를 기준으로 4 ℃ 20~21 일, 실온 7~8 일 동안 농도 변화 여부를 살펴보았다. 또한 함량 실험은 미국약전(USP)에서 UV 방법으로 하게 되어 있다.
실험순서는 시료를 1 mg/mL로 제조(희석액 초순수) 후 UV 파장 280 nm에서 흡광도를 분석 하였으며, 결과는 3 번 측정 하였고 결과가 %CV, 5%이내 인지를 확인 하였다.
본 실험에서는 발현되는 단백질 major band가 깨지는지 여부를 살펴보는 실험으로서 양이온교환칼럼 후 4 °C에서는 초기, 6, 10 그리고 20 일에 실험을 수행하였으며, 실온에서는 초기, 3, 7 일에 실험을 수행하였다.
실험순서는 UV로 시료의 농도결정(mg/mL) 후 희석 하여 Serial dilution을 하고 희석된 시료 250 µL를 엔도톡신 kit에 주입 한 후 Incubation (37 °C, 60 min) 시킨 다음 결과를 확인 하였다.
그리고 음이온교환칼럼 정제 후 4 °C에서는 초기, 3, 11, 그리고 21 일, 실온에서는 초기, 3 그리고 8 일에 각각 실험을 수행하였다.
이온교환칼럼 후 4 °C에서는 초기, 6 일, 10 일 그리고 20 일에 실험을 수행하였으며, 실온에서는 초기, 3, 7 일에 실험을 수행하였다.
그리고 음이온교환칼럼 정제 후 4 °C에서는 초기, 3, 11, 그리고 21 일, 실온에서는 초기, 3 그리고 8일에 각각 실험을 수행하였다.
본 실험은 rProtein A를 제조하기위해 양이온교환칼럼 통과 후의 시료를 냉장(4 °C)보관 했을때 안정성 여부를 확인하고자 하였다. 실험항목은 SDS PAGE, 엔도톡신, 농도 그리고 HPLC 순도 등이며, HPLC 순도실험에서는 214 nm, 280 nm에서 실험을 수행하였으며, 실험기간은 초기에서 20 일에 걸쳐 실험을 수행 하였다.
rProtein A를 제조하기위한 정제공정단계별 시료의 보관시 안정성 여부를 판단하기 위한 실험으로서 양이온교환칼럼과 음이온교환칼럼 정제 후 냉장(4 ℃)보관과 실온보관 그리고 기간은 냉장보관에서 20~21 일, 실온보관은 7~8 일 동안 보관하였으며, 실험항목은 SDS PAGE, 엔도톡신, HPLC 순도, 농도등 이였다. 각 공정단계 시료의 안정성실험을 통한 저장방법 및 보관기간 설정과 경시변화에 따른 품질의 안정성을 평가를 목적으로 수행된 실험결과 양이온교환칼럼 통과 후 냉장(4 ℃)보관에서는 SDS PAGE는 major band, 엔도톡신은 5.

대상 데이터

Endotoxin Gel Clot은 LONZA, Limulus Amebocyte Lysate PYROGENTPlus Single Test Kit 그리고 Electrophoresis system은 BIO-RAD PowerPac, Invitrogen Novexminicell & XCell SureLock을 사용하였으며, SDS Pre made gel은 KOMA 4-12% Tris, KG5012 그리고 Autopipete(20~1000 µL), Incubator, Volumetricflask, pH meter, Clean bench 등의 실험 기구를 사용하였다.
파장은 214 nm, 280 nm (Mode: Dual), 칼럼은 L35(BioSep-Sec-S2000), 유속은 1 mL/min, 주입량은 20 µL 그리고 체류시간은 20 분 이다.
본 연구에 사용된 시약 및 용매는 Anhydrous sodium phosphate, Monobasic anhydrous, sodium phosphate, 초순수 그리고 Lal water등을 사용 하였다.
본 실험에 사용된 UV는 GE, GeneQuant이며 측정 파장은 280 nm 이였다. 농도 기준은 5.
그리고 음이온교환칼럼 정제 후 4 °C에서는 초기, 3, 11, 그리고 21 일, 실온에서는 초기, 3 그리고 8 일에 각각 실험을 수행하였다. 본 실험에 사용된 Gel clot은 LONZA, Limulus Amebocyte Lysate PYROGENT Plus Single Test Kit를 사용 하였다.
본 실험은 음이온교환칼럼 통과 후의 시료를 냉장 (4 °C)보관 했을때 안정성 여부를 확인하고자 하였다. 실험항목은 SDS PAGE, 엔도톡신, 농도 그리고 HPLC 순도 등이며, HPLC 순도실험에서는 214 nm, 280 nm 에서 실험을 수행하였으며, 실험기간은 초기에서 21일에 걸쳐 실험을 수행하였다.
본 실험은 양이온교환칼럼 통과 후의 시료를 실온 보관 했을때 안정성 여부를 확인하고자 하였다. 실험 항목은 SDS PAGE, 엔도톡신, 농도 그리고 HPLC 순도 등이며, HPLC 순도실험에서는 214 nm, 280 nm에서 실험을 수행하였으며, 실험기간은 초기에서 7 일에 걸쳐 실험을 수행하였다.
본 실험은 음이온교환칼럼 통과 후의 시료를 실온 보관 했을때 안정성 여부를 확인하고자 하였다. 실험 항목은 SDS PAGE, 엔도톡신, 농도 그리고 HPLC 순도 등이며, HPLC 순도실험에서는 214 nm, 280 nm에서 실험을 수행하였으며, 실험기간은 초기에서 8 일에 걸쳐 실험을 수행하였다.
HPLC system은 Waters HPLC를 사용하였으며, Column은 Phenomenex사의 300×7.80 mm (BioSepSec-S2000)을 사용하고 UV는 GE사의 GeneQuant를 사용하였다.

성능/효과

실험결과 SDS PAGE에서는 초기 major band에서 20 일 차에서도 major band로 나타났으며, 엔도톡신은 초기 5.0 Eu/mg이하에서 20 일 차에서도 5.0 Eu/mg이 하의 결과를 보였다. 그리고 농도에서는 초기 8.
0 Eu/mg이 하의 결과를 보였다. 그리고 농도에서는 초기 8.28 mg/mL에서 20 일차 8.31 mg/mL의 결과로 평균 8.21 mg/mL, RSD% 0.1%로서 다소 안정된 결과를 나타내어 농도에 있어서 변화하는 결과를 나타내지 않음을 알 수 있었다. 또한 HPLC 순도에서 초기의 실험결과는 214 nm에서 99.
0 Eu/mg이하의 결과를 보였다. 그리고 농도에서는 초기 8.28 mg/mL에서 7 일차 8.31 mg/mL의 결과로 평균 8.24 mg/mL, RSD% 0.11%로서 다소 안정된 결과를 나타내어 농도에 있어서 변화하는 결과를 나타내지 않음을 알 수 있었다. 또한 HPLC 순도에서 초기의 실험결과는 214 nm에서 99.
실험결과 SDS PAGE에서는 초기 major band에서 21 일 차에서도 major band로 나타났으며, 엔도톡신은 초기 0.5 Eu/mg 이하에서 21 일차에서도 0.5 Eu/mg 이하의 결과를 보였다. 그리고 농도에서는 초기 5.
5 Eu/mg 이하의 결과를 보였다. 그리고 농도에서는 초기 5.62 mg/mL에서 21 일차 5.49 mg/mL의 결과로 평균 5.59mg/mL, RSD% 0.10%로서 다소 안정된 결과를 나타내어 농도에 있어서 변화하는 결과를 나타내지 않음을 알 수 있었다. 또한 HPLC 순도에서 초기의 실험 결과는 214 nm에서 99.
5 Eu/mg 이하의 결과를 보였다. 그리고 농도에서는 초기 5.62 mg/ mL에서 8 일차 5.56 mg/mL의 결과로 평균 5.59 mg/ mL, RSD% 0.03%로서 다소 안정된 결과를 나타내어 농도에 있어서 변화하는 결과를 나타내지 않음을 알수 있었다. 또한 HPLC 순도에서 초기의 실험결과는 214 nm에서 99.
상기의 실험결과 양이온교환칼럼통과 후 시료의 4 °C에서 20 일 동안의 보관은 다른 물질로의 변화나 물질이 변화하는 특성 없이 안정하다는 결론을 얻을 수 있었다.
실험결과 SDS PAGE에서는 초기 major band에서 7일 차에서도 major band로 나타났으며, 엔도톡신은 초기 5.0 Eu/mg이하에서 7 일차에서도 5.0 Eu/mg이하의 결과를 보였다. 그리고 농도에서는 초기 8.
11%로서 다소 안정된 결과를 나타내어 농도에 있어서 변화하는 결과를 나타내지 않음을 알 수 있었다. 또한 HPLC 순도에서 초기의 실험결과는 214 nm에서 99.12%, 7 일차 99.44%로 전체범위 99.12~99.71%로서 평균 99.37%, RSD% 0.22%, 280 nm에서는 초기 90.58%에서 7 일차 90.25%로 평균 89.80%, RSD% 1.26%로서 다소 안정된 결과를 나타내어 순도 실험에서도 다른 물질로의 변화나 물질분해 특성이 없다는 결과를 알 수 있었다.
상기의 실험결과 양이온교환칼럼통과 후 시료의 실온에서 7 일 동안의 보관은 다른 물질로의 변화나 물질이 변화하는 특성 없이 안정하다는 결론을 얻을 수있었다. Fig.
실험결과 SDS PAGE에서는 초기 major band에서 8일 차에서도 major band로 나타났으며, 엔도톡신은 초기 0.5 Eu/mg 이하에서 8 일차에서도 0.5 Eu/mg 이하의 결과를 보였다. 그리고 농도에서는 초기 5.
1%로서 다소 안정된 결과를 나타내어 농도에 있어서 변화하는 결과를 나타내지 않음을 알 수 있었다. 또한 HPLC 순도에서 초기의 실험결과는 214 nm에서 99.12%, 20 일차 99.39%로 전체범위 98.86~99.65%로서 RSD% 0.29%, 280 nm에서는 초기 90.58%에서 20 일차 89.85%로 평균 89.72%, RSD%0.62%로서 다소 안정된 결과를 나타내어 순도 실험에서도 다른 물질로의 변화나 물질분해 특성이 없다는 결과를 알 수 있었다.
10%로서 다소 안정된 결과를 나타내어 농도에 있어서 변화하는 결과를 나타내지 않음을 알 수 있었다. 또한 HPLC 순도에서 초기의 실험 결과는 214 nm에서 99.55%, 21 일차 99.80%로 전체 범위 99.55~99.80%로서 RSD% 0.10%, 280 nm에서는초기 95.84%에서 21 일차 97.29%로 평균 96.16%, RSD% 1.13%로서 다소 안정된 결과를 나타내어 순도 실험에서도 다른 물질로의 변화나 물질분해 특성이 없다는 결과를 알 수 있었다.
상기의 실험결과 음이온교환칼럼통과 후 시료의 실온에서 21 일 동안의 보관은 다른 물질로의 변화나 물질이 변화하는 특성 없이 안정하다는 결론을 얻을수 있었다.
03%로서 다소 안정된 결과를 나타내어 농도에 있어서 변화하는 결과를 나타내지 않음을 알수 있었다. 또한 HPLC 순도에서 초기의 실험결과는 214 nm에서 99.55%, 8 일차 96.75%로 전체범위 95.55~99.84%로서 RSD% 0.11%, 280 nm에서는 초기 95.84%에서 21 일차 96.85%로 평균 95.91%, RSD%0.72%로서 다소 안정된 결과를 나타내어 순도 실험에서도 다른 물질로의 변화나 물질분해 특성이 없다는 결과를 알 수 있었다.
상기의 실험결과 음이온교환칼럼통과 후 시료의 실온에서 8 일 동안의 보관은 다른 물질로의 변화나 물질이 변화하는 특성 없이 안정하다는 결론을 얻을 수있었다. Fig.
10%로서 다소 안정된 결과를 나타내었다. 그리고 HPLC 순도에서 초기의 실험결과는 214 nm에서 99.12%, 20 일차 99.39%로 전체범위 98.86~99.65%로서 RSD% 0.29%, 280 nm에서는 초기 90.58%에서 20 일차 89.85%로 평균 89.72%, RSD%0.62%로서 다소 안정된 결과를 나타내었다. 양이온교환칼럼 통과 후 실온보관 실험결과는 실험결과 SDS PAGE에서는 major band, 엔도톡신은 5.
62%로서 다소 안정된 결과를 나타내었다. 양이온교환칼럼 통과 후 실온보관 실험결과는 실험결과 SDS PAGE에서는 major band, 엔도톡신은 5.0 Eu/mg이하, 농도 평균 8.24 mg/mL, RSD% 0.11%로서 다소 안정된 결과를 나타내었고 HPLC 순도는 214 nm에서 전체범위 99.12~99.71%로서 평균 99.37%, RSD% 0.22%, 280 nm에서 평균 89.80%, RSD% 1.26%로서 다소 안정된 결과를 나타내었다.
음이온칼럼통과 후 냉장(4 ℃)보관 후 SDS PAGE major band, 엔도톡신 0.5 Eu/mg이하, 농도는 초기 5.62 mg/mL에서 21 일차 5.49 mg/mL의 결과로 평균 5.59 mg/mL, RSD% 0.10% 그리고 HPLC 순도에서 초기의 실험결과는 214 nm에서 99.55%, 21 일차 99.80%로 전체범위 99.55~99.80%로서 RSD% 0.10%, 280 nm에서는 초기 95.84%에서 21 일차 97.29%로 평균 96.16%, RSD% 1.13%의 결과를 보였다. 음이온 칼럼통과 후 실온보관에서 실험결과는 SDS PAGE major band, 엔도톡신은 0.
13%의 결과를 보였다. 음이온 칼럼통과 후 실온보관에서 실험결과는 SDS PAGE major band, 엔도톡신은 0.5 Eu/mg 이하, 농도는 초기 5.62 mg/mL에서 8 일차 5.56 mg/mL의 결과로 평균 5.59 mg/mL, RSD% 0.03% 그리고 HPLC 순도에서 초기의 실험결과는 214 nm에서 전체범위 95.55~99.84%로서 RSD% 0.11%, 280 nm에서는 초기 95.84%에서 21 일차 96.85%로 평균 95.91%, RSD% 0.72%의 결과를 나타내었다.
상기의 실험결과로 rProtein A의 제조공정시료(SP)는 냉장(4 ℃) 보관 20 일, 실온 7 일 동안의 보관은 안정하였으며, 또한 제조공정시료(Q)에서도 냉장(4 ℃) 보관 21 일, 실온 8 일 동안의 보관은 안정하였다. 상기의 보관조건과 시간동안 물질분해 특성이 없고, 안정성이 확보 되었다는 결론을 얻을 수 있었다.
rProtein A를 제조하기위한 정제공정단계별 시료의 보관시 안정성 여부를 판단하기 위한 실험으로서 양이온교환칼럼과 음이온교환칼럼 정제 후 냉장(4 ℃)보관과 실온보관 그리고 기간은 냉장보관에서 20~21 일, 실온보관은 7~8 일 동안 보관하였으며, 실험항목은 SDS PAGE, 엔도톡신, HPLC 순도, 농도등 이였다. 각 공정단계 시료의 안정성실험을 통한 저장방법 및 보관기간 설정과 경시변화에 따른 품질의 안정성을 평가를 목적으로 수행된 실험결과 양이온교환칼럼 통과 후 냉장(4 ℃)보관에서는 SDS PAGE는 major band, 엔도톡신은 5.0 Eu/mg 이하, 농도에서는 평균 8.21 mg/mL, RSD% 0.10%로서 다소 안정된 결과를 나타내었다. 그리고 HPLC 순도에서 초기의 실험결과는 214 nm에서 99.
상기의 실험결과로 rProtein A의 제조공정시료(SP)는 냉장(4 ℃) 보관 20 일, 실온 7 일 동안의 보관은 안정하였으며, 또한 제조공정시료(Q)에서도 냉장(4 ℃) 보관 21 일, 실온 8 일 동안의 보관은 안정하였다. 상기의 보관조건과 시간동안 물질분해 특성이 없고, 안정성이 확보 되었다는 결론을 얻을 수 있었다.

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	단틀론항체는 어떻게 존재하는가?	단틀론항체(monoclonal antibody)는 유전자 조작된 동물세포의 배양 시 배지 중으로 분비 생산되며, 세포가 분비하는 다른 단백질들과 배지내의 성분 등이 섞여 매우 낮은 농도로 존재한다. 따라서 목적단클론항체 이외의 불순물 제거가 항체생산에서 중요한 단계이며, 단클론항체 분리정제공정은 배지로부터 단클론 항체만 선택적으로 포획하기 위하여 항체친화성 리간드(antibody affinity ligand)인 프로테인에이(protein A)를 이용한 크로마토그래피(chromatography)가 표준으로 채택되고 있고 protein A를 이용할 경우 정제 첫단계에서 세포배양액으로부터 목적 항체를 95% 이상의 순도로 분리가 가능하고 농축효과도 얻을 수 있다.
	항체친화성 리간드는 무엇이 있는가	항체 친화성 리간드로는 protein A, G, L등이 있으며, 프로테인에이와 지는 각각 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)와 스트렙토코커스 속 (Streptococcus sp.)에서 유래하며 친화도의 차이가 있지만 모두 다양한 종의 면역글로블린지(immunoglobulin G, IgG)의 에프씨 부위(constant region, Fc)에 친화성을 가지는 반면 프로테인엘은 펩토트트렙토코커스 마그너스(Peptostreptococcus magnus)에서 유래하며 면역글로블린지의 카파라이트사슬(kappa light chain)에 친화성을 보이고 특히 카파라이트사슬 I, III, IV에 강하게 흡착하며 다양한 종류의 면역글로블린과 반응이 가능하며 scFv나 Fab과 같은 항체단편 (antibody fragment)들과도 흡착할 수 있다(Fig. 1, Table 1).
	단클론항체 분리정제공정은 무엇이 표준인가?	단틀론항체(monoclonal antibody)는 유전자 조작된 동물세포의 배양 시 배지 중으로 분비 생산되며, 세포가 분비하는 다른 단백질들과 배지내의 성분 등이 섞여 매우 낮은 농도로 존재한다. 따라서 목적단클론항체 이외의 불순물 제거가 항체생산에서 중요한 단계이며, 단클론항체 분리정제공정은 배지로부터 단클론 항체만 선택적으로 포획하기 위하여 항체친화성 리간드(antibody affinity ligand)인 프로테인에이(protein A)를 이용한 크로마토그래피(chromatography)가 표준으로 채택되고 있고 protein A를 이용할 경우 정제 첫단계에서 세포배양액으로부터 목적 항체를 95% 이상의 순도로 분리가 가능하고 농축효과도 얻을 수 있다.

참고문헌 (9)

S. Aldington and J. Bonnerjea, Scale-up of monoclonal antibody purification processes. J. Chrom B, 848, 64-78 (2007).

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Guideline on Stability Testing of Biological Product - KFDA(2008).
ICH guideline Q5C - Quality of Biotechnological Products: Stability Testing of Biotechnological/Biological Products.
ICH guideline Q1A(R2) - Stability Testing of New Drug Substance and Products.
ICH guideline Q1E - Evaluation for Stability Data.
G. Strohlein, L. Aumann, T. Muller-Spath and M. Morbidelli, The multicolumn counter current solvent gradient purification process., BioPharm Int., 42-48 (2007).
D. Agalloco, Control, et al., Process simulation testing for steril bulk pharmaceutical chemicals, PDA Technical Report No. 28, PDA J. Pharm. Sci. Technol., 52, Supplement S3 (1998).
S. R. Gallant, S. Vunnum and S. M. Cramer, Optimization of preparative ion-exchagen chromatography of proteins: linear gradient separations, J. Chromato A, 725, 295-314 (1996).

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S. Liu, R. Tobias and G. Jackowski, Removal of Endotoxin from Recombinant Protein Preparations, Clinical Biochem., 30(6), 455-463 (1997).

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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