선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 본 연구는 Hovenia dulcis Thunberg 추출물을 동물에 투여하여 세포나 조직에 독성을 나타내는 산소대사물들에 관여하는 효소들의 변화에 대하여 연구하고자 한다.
제안 방법
- Tetrazolium 염의 환원속도는 xanthine에서 urate가 생성될때 terazolium 염의 환원으로 540 ㎚에서 흡광도가 증가하는 것을 이용하였다. 0.1 M 인산염 완충액(pH 7.8), 10 mM EDTA, 1% gelatine, 0.2 mM phenazine methosulfate, 4 mM nitroblue tetrazolium, 그리고 0.2 ㎖의 효소액을 넣어 2.0 ㎖가 되게 하였다. 그리고 25℃에서 5분간 방치한 후 xanthine 0.
- Cytochrome c의 환원속도 측정은 superoxide radical에 의해 환원되는 cytochrome c가 이 효소에 의해 억제되는 것을 이용 하여 측정하였다. 즉, 세포질에 존재하는 Cu·Zn-SOD의 활성도는 0.
- Hovenia dulcis Thunberg 추출물을 복용시킨 실험동물에서 미토콘드리아에서 생성되는 superoxide radical의 함량 변화를 관찰하기 위한 방법으로 ferricytochrome C의 환원속도와 Tetrazolium 염의 환원속도를 측정하였다. B6C3F1 쥐 간 조직 내에서 superoxide radical 함량을 ferricytochrome c의 환원속도 이용하여 측정한 결과를 Fig.
- Tetrazolium 염의 환원속도는 xanthine에서 urate가 생성될때 terazolium 염의 환원으로 540 ㎚에서 흡광도가 증가하는 것을 이용하였다. 0.
- Hovenia dulcis Thunberg의 추출물에서 산소독성에 대한 효과를 알아보기 위하여 4주령 B6C3F1 쥐를 구입하여 실험에 사용하였다. 구입한 쥐를 5군으로 나누어 각 군당 10마리씩 배정하였다. 각 군의 쥐는 1주일간 안정시킨 후 Kolaja 등(1998)이 설계한 실험 방법에 의해 실험하였다.
- 그리고 25℃에서 5분간 방치한 후 xanthine 0.5 ㎖와 인산염 완충액을 0.5 ㎖를 넣어 잘 섞은 다음 540 ㎚에서 10분간 흡광도의 증가를 측정하였다(Fried & Fried 1974).
- 조 효소의 단백질량은 Pierce사 제품의 Micro BCATM protein assay reagent Kit를 사용하여 ELISA reader를 이용하여 562 ㎚에서 측정하였다. 그리고 그때 bovine gamma globulin(BGG)을 표준단백질로 사용하여 정량하였다.
- 3 ㎖를 넣었다. 그리고 이것을 온도 조절기가 부착된 분광광도계에서 37℃를 유지하면서 550 ㎚에서 2분 간 흡광도의 변화를 관찰하였다. 그리고 이 반응액에 3 ㎍의 superoxide dismutase를 첨가하여 흡광도의 변화가 억제되는 것을 관찰하였다.
- 5 ㎎ 비율로 생리식염수에 녹여 1주일에 2회씩 8주간 주사하였다. 그리고 주사 후 12주(총 20주)를 더 사육하였고, 경구 탈구법으로 도살한 후에 간에서 암의 발병을 확인하였으며, 생화학적 검사를 실시하는데 이용하였다.
- Superoxide radical을 과산화수소로 전환하여 제거하는 효소인 superoxide dismutase(SOD) 활성도는 cytochrome c의 환원에 기인된다. 따라서 cytochrome c의 환원속도 측정은 superoxide radical에 의해 환원되는 cytochrome c가 superoxide dismutase(SOD)에 의해 억제되는 것을 이용하여 측정하였고, 그 결과를 Table 1과 Fig. 3에 나타냈다.
- 또한 mitochondria에 존재하는 Mn-SOD의 활성도는 Cu·Zn-SOD 가 KCN에 억제되는 성질을 이용하여 상기 혼합액에 KCN만을 2 mM로 하여 동일한 조건으로 측정하였다(Salin 등 1978).
- 음지에서 건조시킨 후 2～3 ㎝ 크기로 절단한 Hovenia dulcis Thunberg 1 ㎏을 5ℓ round flask에 넣고 70% ethanol(EtOH)로 4시간 환류하는 방법으로 3회씩 반복하여 추출하였다. 추출물은 여과를 통하여 부유물을 제거한 후에 감압 농축하였고, 농축물은 감압 하에 동결 건조하여 동물 사육에 사용하였다.
- 제1군은 정상 대조군으로 사용하기 위하여 특이식을 하지 않은 상태로 20주간 사육하였다.
- 제2군은 간암을 유발시키는 화학물질 중 하나인 N,N-diethylnitrosamine(DEN)을 체중 ㎏당 17.5 ㎎ 비율로 생리식염수에 녹여 1주일에 2회씩 8주간 주사하였다. 그리고 주사 후 12주(총 20주)를 더 사육하였고, 경구 탈구법으로 도살한 후에 간에서 암의 발병을 확인하였으며, 생화학적 검사를 실시하는데 이용하였다.
- 제4군은 제2군과 같은 방법으로 DEN을 1주일에 2회씩 주사하여 8주간 주사하여 암을 발병시킨 후, 9주째부터 500 ppm 농도의 Hovenia dulcis Thunberg 추출물을 물 대신 12주 더 복용시켜 모두 20주를 사육하였다.
- 제5군은 제2군과 같은 방법으로 DEN을 1주일에 2회씩 주사하여 8주간 주사하면서 3군과 같은 방법으로 70% 에탄올로 추출한 Hovenia dulcis Thunberg 추출물을 물 대신 계속 복용시켜 사육하였다.
- 즉, 세포질에 존재하는 Cu·Zn-SOD의 활성도는 0.1 mM EDTA를 함유하는 50 mM 인산염 완충액(pH 7.8) 2.1 ㎖와 0.5 mM xanthine 0.3 ㎖, 50μM KCN 0.1 ㎖, 1％ sodium deoxycholate 0.1 ㎖에 0.1 mM cytochrome c 0.3 ㎖, xanthine oxidase 0.1 ㎖(시료를 넣지 않은 상태에서 흡광도 증가가 0.02되게 조절한 것)와 시료액 10 ㎕를 넣고 550 ㎚에서 흡광도의 증가를 3분 동안 측정하였다.
- 추출 시료의 동결 건조는 냉동 건조기(Martin Christ Alpha type, Germany)를 사용하였고, 효소 활성도 측정은 조직 파쇄기(Utra-Turrax T25, Germany), 초음파 파쇄기(Sonics and Materials VC-375, USA), 전기 영동기(Mighty Small SE250, Hoefer, USA) 와 ELISA reader(Spectra Max 340, USA), incubator(Boekel incubator shaker II, Model 136400) 및 UV/Visible Spectrometer(Varian Cary 3E, Australia)를 이용하였다.
대상 데이터
- Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM), Dulbecco's phosphate buffered saline(PBS), trypsin-EDTA, Lglutamine는 Gibco BRL사 제품을 사용하였으며, Ethanol(EtOH, 99.5%)은 삼전 화학에서 구입하여 사용하였다.
- Hovenia dulcis Thunberg의 추출물에서 산소독성에 대한 효과를 알아보기 위하여 4주령 B6C3F1 쥐를 구입하여 실험에 사용하였다. 구입한 쥐를 5군으로 나누어 각 군당 10마리씩 배정하였다.
- 본 연구에 사용한 Hovenia dulcis Thunberg은 국내의 영천 산지에서 채취한 Hovenia dulcis Thunberg의 목질 부분만을 구입하여 음지에서 건조하였고, 건조된 시료는 2～3 ㎝로 잘라서 추출하는데 사용하였다. 그리고 Hovenia dulcis Thunberg 에 존재하는 물질의 산소독성에 대한 효과를 알아보기 위해 4주령 B6C3F1 쥐를 구입하여 사육하면서 실험하였다.
- 그리고 Tris(hydroxymethyl) - aminomethane (Tris)과 acrylamide, N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine(TMEDA) 및 sodium dodecylsulfate(SDS) 등은 Bio-Rad(Hercules Co.) 제품을 사용하였다.
- 본 연구에 사용한 Hovenia dulcis Thunberg은 국내의 영천 산지에서 채취한 Hovenia dulcis Thunberg의 목질 부분만을 구입하여 음지에서 건조하였고, 건조된 시료는 2～3 ㎝로 잘라서 추출하는데 사용하였다. 그리고 Hovenia dulcis Thunberg 에 존재하는 물질의 산소독성에 대한 효과를 알아보기 위해 4주령 B6C3F1 쥐를 구입하여 사육하면서 실험하였다.
- 실험동물인 B6C3F1 쥐에 DEN 투여와 Hovenia dulcis Thunberg 를 복용시키며 20주 사육한 후 쥐의 체중 변화를 Fig. 1에 나타내었다. Fig.
이론/모형
- Ferricytochrome c 환원 속도의 측정은 superoxide dismutase 를 사용하여 ferricytochrome c를 환원하는 환원 속도 변화를 UV/Visible Spectrometer로 정량하였다(McCord & Fridovich 1969).
- 구입한 쥐를 5군으로 나누어 각 군당 10마리씩 배정하였다. 각 군의 쥐는 1주일간 안정시킨 후 Kolaja 등(1998)이 설계한 실험 방법에 의해 실험하였다.
성능/효과
- DEN 투여와 함께 Hovenia dulcis Thunberg 추출물을 함께 복용시킨 제5군(30.01±1.95 g)에서는 2군에 비해 체중이 회복되었으나, 제1군과 제3군보다 체중이 적음을 보였다.
- Fig. 2에서 보는 바와 같이 DEN만을 투여한 제2군(115.00± 18.41)은 정상군인 제1군과 Hovenia dulcis Thunberg 추출물만 복용한 제3군(85.97±11.68 units/㎎ protein, 이하 단위 생략)에 비해 51.5%, 33.7%로 현저하게 증가되었고, DEN을 투여하고 Hovenia dulcis Thunberg 추출물을 복용한 제4군(122.73±25.40) 에 비해 12.2% 감소되었다.
- Superoxide의 제거에 미치는 영향을 알아보기 위해 cytochrome c의 환원속도를 측정한 결과, 미토콘드리아에 존재하는 Mn-SOD 의 활성도는 DEN만을 투여한 제2군의 Mn-SOD는 다른 군에 비해 유의적(p<0.01)으로 감소하였다. 그러나 제4군과 제5군에서의 Mn-SOD 활성도는 제2군에 비해 유의적인 증가함을 보였다.
- 그러나 DEN 투여 후 Hovenia dulcis Thunberg 추출물을 복용시킨 4군(81.85±15.69)의 경우 제1군과 제3군에 비해 42.8%, 43.9% 감소한 함량을 보였고, Hovenia dulcis Thunberg 추출물을 복용시키며 DEN을 투여한 제5군(85.28±27.30)에서는 제1군과 제3군에 비해 40.4%, 41.6% 감소한 함량을 보였다.
- 4% 감소하여 현저하게 낮은 함량을 나타내었다. 그러나 DEN 투여 후 Hovenia dulcis Thunberg 추출물을 복용시킨 제4군과 DEN을 투여하면서 Hovenia dulcis Thunberg 추출물을 복용시킨 제5군에서는 제2군보다는 15.3%, 20.2%가 증가함을 보였다. 이러한 경향성은 DEN 을 투여하여 암이 발생하면 Superoxide radical의 함량이 정상 군인 제1군과 Hovenia dulcis Thunberg 추출물을 복용시킨 제3군에 비해 50.
- 7%로 현저하게 증가되었다. 그러나 DEN을 투여하여 암을 발생시킨 후 Hovenia dulcis Thunberg 추출물을 복용한 제4군과 Hovenia dulcis Thunberg 추출물을 복용하면서 DEN을 투여한 제5군은 정상대조군인제1군에 비해 61.7%, 49.1%로 현저하게 증가하였다. 이상과 같은 결과로 볼 때 DEN에 의한 암을 유발한 세포에서 Hovenia dulcis Thunberg 추출물은 superoxide radical의 생성에 영향이 없는 것으로 사료되었다.
- 그러나 DEN을 투여하여 암을 발생시킨후 Hovenia dulcis Thunberg 추출물을 복용한 제4군과 Hovenia dulcis Thunberg 추출물을 복용하면서 DEN을 투여한 제5군 (113.13±30.43)은 정상대조군인 제1군(75.86±5.56)에 비해 61.7%, 49.1%로 현저하게 증가하였다.
- 이는 Hovenia dulcis Thunberg 추출물을 복용한 군들에서 Cu·Zn-SOD 및 Mn-SOD의 활성도가 증가하므로 Hovenia dulcis Thunberg 추출물이 superoxide radical을 제거하는데 직접 관여하는 것으로 생각되었다. 그러나 Mn-SOD는 제4군에서 유의적 감소함을 보인 반면에 제5군에서는 유의적인 증가를 보였고, 이는 Hovenia dulcis Thunberg 추출물이 암의 발병 전에 투여 시에는 Mn-SOD의 활성도에 영향을 주지만, 암이 발병된 후에는 Mn-SOD의 활성도에 영향을 주지 못하는 것으로 사료되었다.
- 이 결과는 Sassa 등(1999)이 보고한 13762NF mammary adenocacinoma에 걸린 F-344 쥐에서 보인 체중 감량 효과와 clarithromycin으로 처리하였을 때의 체중 회복 효과와 일치하였다. 그리고 암에 의해 줄어든 체중은 Hovenia dulcis Thunberg 추출물을 복용하면 체중이 회복되지는 않으나, DEN과 Hovenia dulcis Thunberg 추출물을 함께 복용하면 체중이 회복되고 있는 것을 알 수 있었다. 이는 Hovenia dulcis Thunberg 추출물에 암을 억제하거나 또는 암에 의한 체중 감소를 막아내는 물질이 함유되어 있는 것으로 사료된다.
- 그리고 이것을 온도 조절기가 부착된 분광광도계에서 37℃를 유지하면서 550 ㎚에서 2분 간 흡광도의 변화를 관찰하였다. 그리고 이 반응액에 3 ㎍의 superoxide dismutase를 첨가하여 흡광도의 변화가 억제되는 것을 관찰하였다. 이때 환원되는 cytochrome c의 양은 분자흡광 계수(EM cm=195,000)로 계산하였다.
- 그러나 제4군과 제5군에서의 Mn-SOD 활성도는 제2군에 비해 유의적인 증가함을 보였다. 그리고 제4군과 제5군의 Cu·Zn-SOD 활성도도 정상 대조군인 제1군과 비교하여 볼 때 유의적인 증가함을 보였다. 이상과 같은 결과로 보아 Hovenia dulcis Thunberg 추출물을 복용한 군들에서 Cu·Zn-SOD 및 Mn-SOD의 활성도가 증가하므로 Hovenia dulcis Thunberg 추출물이 superoxide radical 을 제거하는데 직접 관여하는 것으로 사료되었다.
- 따라서 Hovenia dulcis Thunberg 추출물은 노화 및 생체독성의 중요한 지표로 이용되는 반응성 산소 독성과 관련된 효소에 직접적인 관련이 있는 것으로 사료되었다.
- 2% 감소되었다. 또한 Hovenia dulcis Thunberg 추출물만을 복용한 제3군은 정상대조군에 비해 함량이 13.3% 증가하였다. 그러나 DEN을 투여하여 암을 발생시킨후 Hovenia dulcis Thunberg 추출물을 복용한 제4군과 Hovenia dulcis Thunberg 추출물을 복용하면서 DEN을 투여한 제5군 (113.
- 2% 증가하는 것을 알 수 있었다. 또한 tetrazolium 염의 환원속도를 측정한 경우, DEN만을 투여한제2군은 정상군인 제1군과 Hovenia dulcis Thunberg 추출물만 복용한 제3군에 비해 51.5%, 33.7%로 현저하게 증가되었다. 그러나 DEN을 투여하여 암을 발생시킨 후 Hovenia dulcis Thunberg 추출물을 복용한 제4군과 Hovenia dulcis Thunberg 추출물을 복용하면서 DEN을 투여한 제5군은 정상대조군인제1군에 비해 61.
- 세포질에 존재하는 Cu,Zn-SOD와 mitochondria에 존재하는 Mn-SOD의 활성은 2군(Cu,Zn-SOD, 322.69±72.21 units/㎎ protein;Mn-SOD, 73.82±11.17 units/㎎ protein)과 1군(Cu,Zn-SOD, 307.00± 24.89; Mn-SOD, 102.37±3.00)의 비교에서 Cu, Zn-SOD의 경우 유의적인 차이가 없었으나, Mn-SOD에서는 유의적(p<0.01)으로 감소하는 것으로 나타났다.
- 실험동물인 B6C3F1 쥐의 체중 변화는 DEN을 투여한 후 Hovenia dulcis Thunberg 추출물을 복용시킨 제4군과 DEN을 투여와 함께 Hovenia dulcis Thunberg 추출물을 복용시킨 제5군에서는 제1군과 제3군보다 체중은 적었으나, 제2군보다는 체중이 많이 나감을 보였다. 이 결과는 암에 의해 줄어든 체중이 Hovenia dulcis Thunberg 추출물을 복용하면 회복되고 있는 것으로 보아 Hovenia dulcis Thunberg 추출물에 암을 억제하는 물질이 함유되어 있는 것으로 사료되었다.
- 실험동물인 B6C3F1 쥐의 체중 변화는 DEN을 투여한 후 Hovenia dulcis Thunberg 추출물을 복용시킨 제4군과 DEN을 투여와 함께 Hovenia dulcis Thunberg 추출물을 복용시킨 제5군에서는 제1군과 제3군보다 체중은 적었으나, 제2군보다는 체중이 많이 나감을 보였다. 이 결과는 암에 의해 줄어든 체중이 Hovenia dulcis Thunberg 추출물을 복용하면 회복되고 있는 것으로 보아 Hovenia dulcis Thunberg 추출물에 암을 억제하는 물질이 함유되어 있는 것으로 사료되었다.
- 2%가 증가함을 보였다. 이러한 경향성은 DEN 을 투여하여 암이 발생하면 Superoxide radical의 함량이 정상 군인 제1군과 Hovenia dulcis Thunberg 추출물을 복용시킨 제3군에 비해 50.4%, 51.4% 현저하게 감소한 낮은 함량을 나타내나, Hovenia dulcis Thunberg 추출물을 복용시키면 superoxide radical 함량이 15.3%, 20.2% 증가하는 것을 알 수 있었다. 또한 tetrazolium 염의 환원속도를 측정한 경우, DEN만을 투여한제2군은 정상군인 제1군과 Hovenia dulcis Thunberg 추출물만 복용한 제3군에 비해 51.
- 2% 증가하였다. 이러한 경향성은 DEN을 투여하여 암이 발생하면 superoxide radical의 함량이 정상군인 제1군과 Hovenia dulcis Thunberg 추출물을 복용시킨 3군에 비해 50.4%, 51.4% 감소하여 현저하게 낮은 함량을 나타내나, Hovenia dulcis Thunberg 추출물을 복용시키면 superoxide radical 함량이 15.3%, 20.2% 증가하는 것을 알 수 있었다.
- 그리고 제4군과 제5군의 Cu·Zn-SOD 활성도도 정상 대조군인 제1군과 비교하여 볼 때 유의적인 증가함을 보였다. 이상과 같은 결과로 보아 Hovenia dulcis Thunberg 추출물을 복용한 군들에서 Cu·Zn-SOD 및 Mn-SOD의 활성도가 증가하므로 Hovenia dulcis Thunberg 추출물이 superoxide radical 을 제거하는데 직접 관여하는 것으로 사료되었다.
- 1%로 현저하게 증가하였다. 이상과 같은 결과로 볼 때 DEN에 의한 암을 유발한 세포에서 Hovenia dulcis Thunberg 추출물은 superoxide radical의 생성에 영향이 없는 것으로 사료되었다.
- 또한 본 연구에서는 정상대조군인 제1군보다 DEN만을 투여한 제2군에서 xanthine oxidase 활성도가 증가하는 것은 McCord & Roy(1983)의 연구 결과와 같이 DEN이 간세포를 손상시키므로 xanthine dehydrogenase 가 superoxide radical을 발생시키는 xanthine oxidase로 전환되기 때문으로 생각되었다. 이상과 같은 결과로 볼 때 DEN에 의해 암이 유발된 세포에서 Hovenia dulcis Thunberg 추출물은 superoxide radical의생성에 영향이 없는 것으로 생각되었다.
- 제4군과 제5군의 Cu,Zn-SOD 활성도는 정상대 조군인 제1군과 비교하여 볼 때 유의적(p<0.01)으로 증가함을 보였다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.