Streptococcus(S.) suis is a pathogen, causing meningitis, septicemia and sudden death in weaning piglets as well as fattening pigs. Using multiplex PCR method based S. suis capsular genes, 61 S. suis isolates was classified as serotypes 2, 7, 9 and untypable. Genotyping of S. suis isolates was analy...
Streptococcus(S.) suis is a pathogen, causing meningitis, septicemia and sudden death in weaning piglets as well as fattening pigs. Using multiplex PCR method based S. suis capsular genes, 61 S. suis isolates was classified as serotypes 2, 7, 9 and untypable. Genotyping of S. suis isolates was analysed by PFGE pattern with treated Sma I restricted enzyme. Of the 61 S. suis, 25 (40.9%) were serotype 2, 6 (9.8%) were serotype 7, 5 (8.2%) were serotype 9, and 25 (40.9%) were untypable, respectively. Twenty four PFGE patterns were detected in this study and also PFGE patterns were classified according to serotype; serotype 2 was classified as 6 genotypes, serotype 7 was 5 genotypes, serotype 9 was 3 genotypes, and untypable was 11 genotypes, respectively.
Streptococcus(S.) suis is a pathogen, causing meningitis, septicemia and sudden death in weaning piglets as well as fattening pigs. Using multiplex PCR method based S. suis capsular genes, 61 S. suis isolates was classified as serotypes 2, 7, 9 and untypable. Genotyping of S. suis isolates was analysed by PFGE pattern with treated Sma I restricted enzyme. Of the 61 S. suis, 25 (40.9%) were serotype 2, 6 (9.8%) were serotype 7, 5 (8.2%) were serotype 9, and 25 (40.9%) were untypable, respectively. Twenty four PFGE patterns were detected in this study and also PFGE patterns were classified according to serotype; serotype 2 was classified as 6 genotypes, serotype 7 was 5 genotypes, serotype 9 was 3 genotypes, and untypable was 11 genotypes, respectively.
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문제 정의
이번 연구에서는 경북지역 양돈장에서 의뢰된 환돈에서 분리된 S. suis를 대상으로 PCR에 의한 협막혈청형별을 실시하였으며 PFGE를 이용하여 유전형별을 시도하여 그 결과를 토대로 역학적 추적조사의 실험실 분석의 기초자료로 이용하기 위한 유용성을 확인하기 위해 실험을 실시하고 그 결과를 보고하고자 한다.
제안 방법
분석프로그램인 Fingerprinting II Informatix software (Biorad, USA)를 이용하여 유전자수준에서의 상동성을 분석하는 절차를 따랐다. DNA 분절의 위치는 1% 허용범위를 적용하였고 개별 DNA 분절의 분자량은 표준 marker의 DNA 분절 lane에 기초하여 정렬하였다. 균주 간의 clustering은 unweighted pair group method of average linkage (UPGMA)에 의해 dendrogram을 작성하였다.
Genomic DNA 분절을 위한 제한효소는 Sma I(Takara, Japan)을 사용하였으며 plug 절편을 gel casting stand에 올려놓은 후 준비한 1% Seakem gold agarose를 분주하고 CHEF Mapper XA PFGE system(Biorad, USA)에서 6V/cm, 120°, switch time 1.2∼30초의 반응조건으로 20시간 동안 전기영동을 하였고, 25 ml ethidium bromide (10 mg/ml, Bioneer, Korea) 첨가한 500 ml 멸균증류수에 30분간 염색하고 UV transilluminator상에서 DNA 분절을 확인한 후 화상장치(Gel Doc XR, Biorad, USA)를 이용하여 촬영하였다.
PFGE는 plug 제작, 균주용해, 제한효소 처리, 전기 영동의 실시, 염색, 상관관계 분석의 단계로 나누어 수행하였으며, 미국 질병통제센터(CDC)에서 운영 중인 PFGE network인 'PulseNet'에서 사용되는 표준 실험법(2006)과 Luey 등(2007)의 방법을 응용하여 다음과 같이 실시하였다.
PFGE는 plug 제작, 균주용해, 제한효소 처리, 전기 영동의 실시, 염색, 상관관계 분석의 단계로 나누어 수행하였으며, 미국 질병통제센터(CDC)에서 운영 중인 PFGE network인 'PulseNet'에서 사용되는 표준 실험법(2006)과 Luey 등(2007)의 방법을 응용하여 다음과 같이 실시하였다. 먼저 분리주의 분절 DNA 크기를 측정하기 위해 표준 DNA marker로써 Salmonella Braenderup ATCC BAA-664주를 사용하였으며(Hunter 등, 2005), lysostaphin (1.6 mg/ml, Sigma, USA)과 lysozyme (0.94 mg/ml, Sigma, USA) 첨가 3 ml의 cell suspension TE buffer (100 mM Tris, 100 mM EDTA, pH 7.5)에 실험균주를 접종하고 탁도를 조정한 후 10분간 실온에 정치하였고 proteinase K (20 mg/ml, Sigma, USA) 10 ml를 첨가하여 동량의 plug mold (Biorad, USA)에 분주하여 4℃에서 굳혀 agarose plug를 제작하였다.
이론/모형
2004년부터 2009년 사이에 경북지역 양돈장에서 병성감정 의뢰된 환돈의 뇌 및 폐장 등의 실질장기에서 분리된 61개 S. suis 분리균주를 대상으로 실험에 사용하였으며 Wisselink 등(1999, 2002)의 방법에 따라 PCR기법을 이용하여 혈청형을 분류하였다.
DNA 분절의 위치는 1% 허용범위를 적용하였고 개별 DNA 분절의 분자량은 표준 marker의 DNA 분절 lane에 기초하여 정렬하였다. 균주 간의 clustering은 unweighted pair group method of average linkage (UPGMA)에 의해 dendrogram을 작성하였다.
2∼30초의 반응조건으로 20시간 동안 전기영동을 하였고, 25 ml ethidium bromide (10 mg/ml, Bioneer, Korea) 첨가한 500 ml 멸균증류수에 30분간 염색하고 UV transilluminator상에서 DNA 분절을 확인한 후 화상장치(Gel Doc XR, Biorad, USA)를 이용하여 촬영하였다. 분석프로그램인 Fingerprinting II Informatix software (Biorad, USA)를 이용하여 유전자수준에서의 상동성을 분석하는 절차를 따랐다. DNA 분절의 위치는 1% 허용범위를 적용하였고 개별 DNA 분절의 분자량은 표준 marker의 DNA 분절 lane에 기초하여 정렬하였다.
성능/효과
suis를 대상으로 PCR에 의한 혈청형별과 PFGE에 의한 유전형별을 실시한 결과는 다음과 같았다. Multiplex PCR을 이용한 혈청형 분류 결과 S. suis 1형은 확인되지 않았고, 2형이 25주(41%), 7형이 6주(9.8%), 9형이 5주(8.2%)이었고 형별되지 않은 경우가 25주(41%)로 나타났으며 분리주는 분리농장별 동일혈청형만 존재하는 것으로 확인되었다. PFGE에 의한 유전적 상관관계를 분석한 결과 전체적으로 24가지의 유전형으로 분류되었으며 혈청형별로는 2형이 6 genotype, 7형이 5 genotype, 9형이 3 genotype, 비형별 균주가 11 genotype으로 유전형별되었다.
2%)이었고 형별되지 않은 경우가 25주(41%)로 나타났으며 분리주는 분리농장별 동일혈청형만 존재하는 것으로 확인되었다. PFGE에 의한 유전적 상관관계를 분석한 결과 전체적으로 24가지의 유전형으로 분류되었으며 혈청형별로는 2형이 6 genotype, 7형이 5 genotype, 9형이 3 genotype, 비형별 균주가 11 genotype으로 유전형별되었다.
S. suis의 유전형별을 위해 제한효소 Sma I으로 처리하고 PFGE를 실시하여 분리주의 DNA 분절 양상을 분석한 결과 모두 24가지의 유전형으로 분류되었다(Fig. 1). 혈청형 2형의 경우 총 6가지의 유전형으로 분류되었으며 Seo-SJ 농장의 경우 2004년에 분리된 2주와 2005년에 분리된 4주가 모두 동일한 혈청형이었고 유전형도 동일한 것으로 확인되었으나, 반면 Song-JS 농장의 동일한 혈청형 2형의 분리주가 분리 연도에 따라 유전형이 다른 것으로 나타났다(Fig.
이번 실험에서 혈청형별로 PFGE에 대한 비교분석에서 동일농장에서 분리된 동일 혈청형의 경우 분리연도에 따라 유전형이 다른 예가 일부 확인되었다. Seo-SJ 농장은 분리연도에 상관없이 동일한 유전형으로 조사되었고 Song-JS, Kim_BD 및 Lee-BS 농장에서는 분리연도가 다른 경우에 동일한 혈청형에서도 유전형이 다른 것으로 확인되었다. 이러한 예가 동일 농장 내 균주 간 발병시기의 경과에 따른 농장 내 균주의 유전변환에 의해 질병이 재발한 것인지 아니면 감염돈의 신규입식 등으로 외부 유입에 따른 새로운 발병인지를 밝혀낼 수 있는 새로운 유전자 검사법의 도입이 필요하리라고 생각한다.
4). 이번 실험에서 multiplex PCR 법에 의해 혈청형이 확인되지 않은 25주의 S. suis에 대해 PFGE에 의한 유전적 상관관계를 조사한 결과 11가지의 유전형으로 분류되었으며 해당하는 18개 농장 중에서 3주 이상 분리된 3호에 대해서 유전형을 조사한 결과 2호(Song-JS, Kim-Ns)는 동일한 유전형으로 확인되었으나 2005년과 2006년에 각각 분리된 Lee-BS 농장은 유전형이 서로 다른 것으로 나타났다(Fig. 5).
suis에 의한 연쇄상구균증은 대부분이 serotype 2에 의한 것으로 알 수 있고 PCR에 의한 혈청형별과 PFGE를 병행하여 실시함으로써 동일농장내 발생한 감염증에 대해 유입경로의 분석과 차단을 위한 기초자료로 활용이 가능할 것으로 생각한다. 이번 실험에서 혈청형별로 PFGE에 대한 비교분석에서 동일농장에서 분리된 동일 혈청형의 경우 분리연도에 따라 유전형이 다른 예가 일부 확인되었다. Seo-SJ 농장은 분리연도에 상관없이 동일한 유전형으로 조사되었고 Song-JS, Kim_BD 및 Lee-BS 농장에서는 분리연도가 다른 경우에 동일한 혈청형에서도 유전형이 다른 것으로 확인되었다.
8%라고 보고하였고 PFGE에 의한 유전형은 총 302주가 60가지의 유전형으로 분류되며 동일 농장 내에서도 여러 형태의 유전형이 존재한다고 보고하였다. 이번 실험에서는 경북 지역 40개 양돈장에서 분리된 61주를 대상으로 PCR에 의한 혈청형별을 시도한 결과 2형이 41%를 차지하여 So 등(1995)이 도축돈의 폐렴 병변부에서 분리한 S. suis 2형이 32.1%라는 성적보다는 다소 높은 것으로 조사되었으나 Koo 등(2002)이 도축돈을 대상으로 조사한 결과인 38%와는 유사한 성적으로 나타나 국내에서 발생하는 돼지의 S. suis에 의한 연쇄상구균증은 대부분이 serotype 2에 의한 것으로 알 수 있고 PCR에 의한 혈청형별과 PFGE를 병행하여 실시함으로써 동일농장내 발생한 감염증에 대해 유입경로의 분석과 차단을 위한 기초자료로 활용이 가능할 것으로 생각한다. 이번 실험에서 혈청형별로 PFGE에 대한 비교분석에서 동일농장에서 분리된 동일 혈청형의 경우 분리연도에 따라 유전형이 다른 예가 일부 확인되었다.
suis serotype 2의 subtyping을 위해 PFGE를 실시하고 항생제 감수성 결과, 병원성 관련인자 및 MLST 성적과 비교한 결과 PFGE에서 9가지 유전형으로 분류되었으며 시험법의 표준화로 실험실간 분리주에 자료를 공유함으로써 유전적 상관관계 분석이 가능할 것으로 기대하였다. 이번 실험에서는 총 61주의 S. suis에서 24가지 유전형으로 분류되었고 PCR에 의한 혈청형별을 실시한 후 혈청형별 유전학적 상관관계를 분석한 결과 2형, 7형, 9형, 기타 형별에서 각각 6가지, 6가지, 3가지, 11가지 유전형으로 분류되어 지역별, 시기별, 농장간 분리된 S. suis의 관련성을 비교 분석하는데 도움이 될 것으로 생각한다. Berthelot-Hérault 등(2002)은 프랑스 내 돼지와 외국사람 유래 123개 S.
1). 혈청형 2형의 경우 총 6가지의 유전형으로 분류되었으며 Seo-SJ 농장의 경우 2004년에 분리된 2주와 2005년에 분리된 4주가 모두 동일한 혈청형이었고 유전형도 동일한 것으로 확인되었으나, 반면 Song-JS 농장의 동일한 혈청형 2형의 분리주가 분리 연도에 따라 유전형이 다른 것으로 나타났다(Fig. 2). 혈청형 7형을 대상으로 유전자 분석 패턴을 조사한 결과 6가지 유전형으로 분류되었고 Kim-BD 동일농장에서 2007년과 2009년에 각각 분리된 동일혈청형에 대해서 다른 유전형으로 분류되는 것으로 나타났다(Fig.
2). 혈청형 7형을 대상으로 유전자 분석 패턴을 조사한 결과 6가지 유전형으로 분류되었고 Kim-BD 동일농장에서 2007년과 2009년에 각각 분리된 동일혈청형에 대해서 다른 유전형으로 분류되는 것으로 나타났다(Fig. 3). 혈청형 9형인 5주의 S.
3). 혈청형 9형인 5주의 S. suis에 대해 유전형을 조사한 결과 3가지 유전형으로 분류되었으며 2005년도에 동일농장(Lee-JW, Ha-JD)에서 분리된 9형의 S. suis는 각각 동일한 유전형으로 확인되었다(Fig. 4). 이번 실험에서 multiplex PCR 법에 의해 혈청형이 확인되지 않은 25주의 S.
후속연구
Seo-SJ 농장은 분리연도에 상관없이 동일한 유전형으로 조사되었고 Song-JS, Kim_BD 및 Lee-BS 농장에서는 분리연도가 다른 경우에 동일한 혈청형에서도 유전형이 다른 것으로 확인되었다. 이러한 예가 동일 농장 내 균주 간 발병시기의 경과에 따른 농장 내 균주의 유전변환에 의해 질병이 재발한 것인지 아니면 감염돈의 신규입식 등으로 외부 유입에 따른 새로운 발병인지를 밝혀낼 수 있는 새로운 유전자 검사법의 도입이 필요하리라고 생각한다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
Streptococcus(S.) suis는 어떤 균인가?
Streptococcus(S.) suis는 Gram 양성의 연쇄상구균으로 면양혈액 첨가배지에서 주로 α-용혈을 일으키고 상부호흡기관(특히 편도 및 비강)에 주로 상재하며 돼지를 사육하는 대부분 나라에서 질병을 일으키는 원인균이다(Marois 등, 2007). 돼지에서 S.
S. suis는 질병의 진행에 따라 어떤 기관에서 검출이 되는가?
suis는 주로 16주령 이하에서 질병을 일으키며(Reams 등, 1996) 뚜렷한 증상없이 폐사하거나 뇌막염에 의한 운동실조, paddling, 안구진탕 등의 신경증상을 동반한 전구 증상을 나타내고(Clifton-Hadley 등, 1986) 관절염, 패혈증, 폐렴 및 드물게 심내막염, 비염, 유산, 질염 등을 유발한다(Sanford와 Tilker, 1982; Sihvonen 등, 1986). 외형적으로 건강한 돼지의 비강, 편도, 상부호흡기에 존재하다가 질병 진행에 따라 생식기와 소화관에서도 검출이 되며 보균돈의 유입에 의한 발병이 주를 이룬다(Mwaniki 등, 1994; Higgins와 Gottschallk, 1999). S.
S. suis는 돼지에게서 어떤 증상을 나타내는가?
) suis는 Gram 양성의 연쇄상구균으로 면양혈액 첨가배지에서 주로 α-용혈을 일으키고 상부호흡기관(특히 편도 및 비강)에 주로 상재하며 돼지를 사육하는 대부분 나라에서 질병을 일으키는 원인균이다(Marois 등, 2007). 돼지에서 S. suis는 주로 16주령 이하에서 질병을 일으키며(Reams 등, 1996) 뚜렷한 증상없이 폐사하거나 뇌막염에 의한 운동실조, paddling, 안구진탕 등의 신경증상을 동반한 전구 증상을 나타내고(Clifton-Hadley 등, 1986) 관절염, 패혈증, 폐렴 및 드물게 심내막염, 비염, 유산, 질염 등을 유발한다(Sanford와 Tilker, 1982; Sihvonen 등, 1986). 외형적으로 건강한 돼지의 비강, 편도, 상부호흡기에 존재하다가 질병 진행에 따라 생식기와 소화관에서도 검출이 되며 보균돈의 유입에 의한 발병이 주를 이룬다(Mwaniki 등, 1994; Higgins와 Gottschallk, 1999).
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