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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 AFLP 분석을 통해 한국의 남해안및 제주 그리고 중국에서 재배되고 있는 강황 (C. longa), 울금 (C. aromatica), 아출 (C. zedoaria), 봉아출 (C. phaeocaulis) 그리고 광서아출 (C. kwangsiensis) 5종 52개체의 유연관계 및 주성분 분석 (PCA)을 통해 유전 다양성을 평가하여 국내재배를 통해서도 품질이 우수하며 뿌리줄기의 생산량이 뛰어난 품종육성을 위한 기초자료로 활용하고자 하였다.
제안 방법
- −70℃에서 보관한 식물체는 액체질소와 막자사발을 이용하여 분쇄한 후 DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN, Germany) 을 이용하여 제작자가 제공한 protocol에 따라 genomic DNA 를 추출하였고, 이를 0.8% agarose gel에서 전기영동한 후, ethidium bromide (EtBr)로 염색하여 UV light 상에서 추출한 genomic DNA의 양과 질 등의 상태를 확인하였으며 NanoDrop 1000 spectrophotometer (NanoDrop, U.S.A.)를 이용하여 260 ㎚에서 정량하였다.
- AFLP 분석은 AFLP Analysis System I (Invitrogen, U.S.A.)과 AFLP Pre-Amp Primer Mix I kit (Invitrogen, U.S.A.)를 이용하여 제작자가 제공한 protocol에 따라 진행하였으며, pre-selective amplification 결과는 1.5% agarose gel에서 전기영동을 통해 확인하였다. Selective PCR 증폭은 preselective amplification을 실시한 반응액을 Tris-EDTA (pH 8.
- Capillary electrophoresis system을 이용하여 나온 AFLP DNA 정보는 Gene Mapper (Applied Biosystems, U.S.A.) 프로그램을 이용하여 분석하였다. 각 시료에 대한 DNA 절편의 증폭여부는 전체 시료의 PCR 증폭 산물에서 noise peak를 제외할 수 있으며 명확하게 PCR 증폭된 peak들만 분석에 이용할 수 있는 형광 값 200을 기준으로 peak의 유무를 1 (유) 또는 0 (무)으로 점수를 부여하였으며, 유전적 유연관계와 주성분 분석은 각각 NTSYSpc version 2.
- PCR 증폭 조건은 94℃에서 30초, 65℃에서 30초 (−0.7℃/1 cycle) 그리고 72℃에서 2분을 반응하도록 12 cycle을 touch down PCR 하였고, 이후에는 94℃에서 30초, 56℃에서 30초 그리고 72℃에서 2분의 조건으로 30 cycle 반응시켰다.
- Selective PCR 증폭은 preselective amplification을 실시한 반응액을 Tris-EDTA (pH 8.0) 완충용액으로 10배 희석한 것의 2 ㎕를 주형 DNA로 사용하였으며, 2.5 μM MseI primer, 1 μM EcoRI primer, 10 × buffer, 8 mM dNTP 그리고 0.65 U TaKaRa Ex Taq (TaKaRa, Japan)이 포함된 총 10 ㎕ 의 반응액에서 실시하였다.
- 총 6조합의 MseI (+3)과 EcoRI (+3) primer가 selective PCR 증폭에 사용되었으며, EcoRI (+3) primer에는 6-FAM 또는 VIC 형광 dye가 결합된 것을 사용하였다 (Table 2). Selective PCR된 시료들은 36 ㎝ capillary가 장착된 ABI3130 XL (Applied Biosystems, U.S.A.)을 이용하여 전기영동을 하였다.
- Table 3. Summary of results for PCR amplicons generated by AFLP analysis using six combinations of selective primer pairs in 52 Curcuma germplasm lines.
- 또한 수집한 시료의 잎을 깨끗이 씻어 물기를 제거한 후 액체질소에 급랭시켜−70℃ 초저온 냉동고에서 보관하고 genomic DNA 추출에 이용하였다.
- 7℃/1 cycle) 그리고 72℃에서 2분을 반응하도록 12 cycle을 touch down PCR 하였고, 이후에는 94℃에서 30초, 56℃에서 30초 그리고 72℃에서 2분의 조건으로 30 cycle 반응시켰다. 총 6조합의 MseI (+3)과 EcoRI (+3) primer가 selective PCR 증폭에 사용되었으며, EcoRI (+3) primer에는 6-FAM 또는 VIC 형광 dye가 결합된 것을 사용하였다 (Table 2). Selective PCR된 시료들은 36 ㎝ capillary가 장착된 ABI3130 XL (Applied Biosystems, U.
대상 데이터
- 본 실험에 분석용도로 사용한 강황 (C. longa)은 제주, 진도및 중국 사천성 3개 지역에서 23개체, 울금 (C. aromatica)은 제주와 진도 2개 지역에서 13개체, 아출 (C. zedoaria)은 제주 1개 지역에서 7개체, 봉아출 (C. phaeocaulis)은 중국 사천성 1개 지역에서 광서아출 (C. kwangsiensis)은 광서성 1개 지역에서 각각 7개체와 2개체를 직접 방문하여 채집하였으며, 총 52개체의 유전자원 계통을 공시하였다 (Table 1). 수집한 종별 시료는 한국한의학연구원 분류동정자문회의 동정을 거쳐 그 종을 확정지었으며, 각 종별 시료의 기원식물은 압착석엽표본을 제작하고 표본번호를 부여하여 한국한의학연구원 한약표준표본관 (KHSHR)에 보관하였다.
- kwangsiensis)은 광서성 1개 지역에서 각각 7개체와 2개체를 직접 방문하여 채집하였으며, 총 52개체의 유전자원 계통을 공시하였다 (Table 1). 수집한 종별 시료는 한국한의학연구원 분류동정자문회의 동정을 거쳐 그 종을 확정지었으며, 각 종별 시료의 기원식물은 압착석엽표본을 제작하고 표본번호를 부여하여 한국한의학연구원 한약표준표본관 (KHSHR)에 보관하였다. 또한 수집한 시료의 잎을 깨끗이 씻어 물기를 제거한 후 액체질소에 급랭시켜−70℃ 초저온 냉동고에서 보관하고 genomic DNA 추출에 이용하였다.
데이터처리
- ) 프로그램을 이용하여 분석하였다. 각 시료에 대한 DNA 절편의 증폭여부는 전체 시료의 PCR 증폭 산물에서 noise peak를 제외할 수 있으며 명확하게 PCR 증폭된 peak들만 분석에 이용할 수 있는 형광 값 200을 기준으로 peak의 유무를 1 (유) 또는 0 (무)으로 점수를 부여하였으며, 유전적 유연관계와 주성분 분석은 각각 NTSYSpc version 2.2 (Exeter Software, U.S.A.) 프로그램의 비가중산술평균 (UPGMA, Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean)과 Mini tab 16 (Minitab Inc., U.S.A.) 프로그램의 다변량 주성분 분석법을 각각 이용하여 작성하였다.
이론/모형
- Table 1. Curcuma 52 germplasm lines used in this study for AFLP analysis.
- 2. Dendrogram of Curcuma 52 germplasm lines by unweighted pair grouping method of averages (UPGMA) cluster analysis using polymorphic peak profiling generated from the AFLP analysis.
성능/효과
- AFLP 분석을 통해 얻어진 349개의 polymorphic peak들은 NTSYSpc program의 비가중 산술평균 분석 (UPGMA)을 이용하여 유사도 (similarity coefficient)를 확인한 결과, 그 범위는 0.60에서 0.99에 걸쳐 나타났으며 유사도 0.68을 기준으로 Curcuma속 5종이 나뉨을 확인하였다 (Fig. 2). 강황 (C.
- AFLP 분석을 통해 얻어진 유연관계와 주성분분석 결과를 종합하면 유연관계 분석은 본 실험에서 사용한 Curcuma속 5종 모두 유전 유사도에서 종별 및 지역별 유집이 이뤄졌음을 확인할 수 있었으며, 주성분분석은 이차원상 분포도를 통해 강황 (C. longa)의 국내재배종과 중국재배종 구분을 제외하면 5종의 종별 구분이 가능함을 확인하였다. 따라서 Curcuma속 수집유전자원의 종간 유전적 관계와 지역별 유전 다양성 분석은 주성분 분석보다 유연관계 분석에서 보다 명확한 결과를 도출할 수 있었다.
- 한국과 중국에서 재배하고 있는 Curcuma속 5종 52개체를대상으로 AFLP 분석을 한 결과, 6쌍의 primer 조합에서 643개의 total peak가 확인되었고 그 중에서 349개가 polymorphic peak였다. Primer 조합당 평균 total peak 개수는 107개였으며, polymorphic peak는 평균 58개가 확인되었다. Fig.
- 4%의 polymorphism 이 확인되었다 (Table 3). 결과적으로 6쌍의 primer 조합 전체의 polymorphism은 54.3%였는데, 이는 인도에서 자생하는 Curcuma속 15종의 유전 다양성 분석에서 Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)는 93.6%의 polymorphism을 보인 결과와 Inter Simple Sequence Repeats (ISSR)은 95.6%의 polymorphism을 보인 결과와는 차이가 있다 (Syamkumar and Sasikumar, 2007). 또한 인도에서 지역별로 수집한 강황 (C.
- longa)의 국내재배종과 중국재배종 구분을 제외하면 5종의 종별 구분이 가능함을 확인하였다. 따라서 Curcuma속 수집유전자원의 종간 유전적 관계와 지역별 유전 다양성 분석은 주성분 분석보다 유연관계 분석에서 보다 명확한 결과를 도출할 수 있었다.
- aromatica)의 경우 유연관계에서는 재배지역별로 명확히 구분이 되어졌으나, 주성분분석 결과에서는 재배지에 관계없이 혼재되어 있음을 확인하였다. 또한 유연관계 분석에서는 아출 (C. zedoaria)과 봉아출 (C. phaeocaulis)의 종간 구분이 명확하였으나 주성분분석 결과에서는 다른 종들과 비교하여 두 종간의 유사도가 높은 것으로 나타났다.
- zedoaria)간 유전 유사도가 높음을 확인하였다. 또한 중국에서 수집한 봉아출 (C. phaeocaulis)과 광서아출 (C. kwangsiensis) 2종은 강황 (C. longa), 울금 (C. aromatica) 그리고 아출 (C. zedoaria) 3종과는 비교적 낮은 유전 유사도인 각각 0.65와 0.60을 보였다. 이러한 결과는 Syamkumar와 Sasikumar (2007)가 보고한 인도에 자생하는 Curcuma속 15종의 유전 다양성을 inter simple sequence repeats (ISSR)과 RAPD를 이용하여 분석한 결과 강황 (C.
- 아출 (C. zedoaria)과 광서아출 (C. kwangsiensis)은 first principal component 값−10과 second principal component 값이 −5 ~ 0 사이의 범위에서 종간 구분이 가능하게 유집을 이루며 분포하고 있음을 보여 준다 (Fig. 3).
- 70을 기준으로 제주, 진도 그리고 중국의 지역별로 구분되어 분포하였다. 울금 (C. aromatica) group에 속한 개체들도 제주와 진도 각 수집지역별로 유집이 됨을 확인하였고, 제주에서 수집한 아출 (C. zedoaria)과도 유사도 0.68에서 유집이 이뤄져서 울금 (C. aromatica)과 아출 (C. zedoaria)간 유전 유사도가 높음을 확인하였다. 또한 중국에서 수집한 봉아출 (C.
- longa)의 유연관계에서는 중국, 진도 및 제주 각 재배지역별 수집 개체들의 유집이 분명하게 이뤄졌으나 주성분분석 결과에서는 국내에서 재배되고 있는 개체들인 진도와 제주가 중국에서 재배되고 있는 개체들과 이차원상의 분포범위가 다름을 확인할 수 있었다. 울금 (C. aromatica)의 경우 유연관계에서는 재배지역별로 명확히 구분이 되어졌으나, 주성분분석 결과에서는 재배지에 관계없이 혼재되어 있음을 확인하였다. 또한 유연관계 분석에서는 아출 (C.
- 60을 보였다. 이러한 결과는 Syamkumar와 Sasikumar (2007)가 보고한 인도에 자생하는 Curcuma속 15종의 유전 다양성을 inter simple sequence repeats (ISSR)과 RAPD를 이용하여 분석한 결과 강황 (C. longa)과 아출 (C. zedoaria)이 유전적으로 보다 가까우며 울금 (C. aromatica)이 두 종에 비해 유전적으로 먼 것과는 차이가 있다. 이러한 결과의 차이는 본 실험에서 유전유사도 분석을 위해 이용한 AFLP가 Syamkumar와 Sasikumar (2007) 가 이용한 ISSR과 RAPD 마커와의 차이에 따른 것으로 사료된다.
- 3). 이의 결과는 강황 (C. longa)의 유연관계에서는 중국, 진도 및 제주 각 재배지역별 수집 개체들의 유집이 분명하게 이뤄졌으나 주성분분석 결과에서는 국내에서 재배되고 있는 개체들인 진도와 제주가 중국에서 재배되고 있는 개체들과 이차원상의 분포범위가 다름을 확인할 수 있었다. 울금 (C.
- 1에서 보는 바와 같이 M-CAA/E-AAG primer 조합의 AFLP 지문분석 패턴을 분석한 결과, 주로 peak가 분포한 범위는 100 ~ 220 bp였다. 전체 6쌍의 primer 조합 가운데 M-CAA/EAAG에서 가장 많은 85개의 polymorphic peak으로 81.7%의 polymorphism을 보여 Curcuma속 수집유전자원들을 분류하는데 이용성이 높을 것이라 판단되며, M-CAA/E-AGG에서 가장 적은 33개의 polymorphic peak으로 32.4%의 polymorphism 이 확인되었다 (Table 3). 결과적으로 6쌍의 primer 조합 전체의 polymorphism은 54.
- 한국과 중국에서 재배하고 있는 Curcuma속 5종 52개체를대상으로 AFLP 분석을 한 결과, 6쌍의 primer 조합에서 643개의 total peak가 확인되었고 그 중에서 349개가 polymorphic peak였다. Primer 조합당 평균 total peak 개수는 107개였으며, polymorphic peak는 평균 58개가 확인되었다.
후속연구
- , 2007). 따라서 본 연구결과는 Curcuma속 수집 유전자원들 간의 유전다양성 분석을 통해 품종육성을 위한 기초자료 및 종판별 또는 원산지 구별을 위한 분자마커 개발로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
- 우리나라도 Curcuma속 작물이 가진 약용 및 산업원료로서 무한한 가치가 있음을 깨닫고 1990년대에 일본으로부터 종경을 도입하여 재배하고 있으나, 재배지역이 제주 및 남부지역으로 한정되어 있으며 재배종과 재배면적 등의 작물정보가 정확히 파악되고 있지 않아 관련 정보가 부족한 실정이다 (Choi, 2004). 열대성 작물인 Curcuma속 작물을 국내 기후조건에서 재배하였을 경우, curcumin의 약리성분함량이 높지 않아 약재로 사용하기에 부적합하거나 뿌리줄기의 생산량이 떨어지는 등의 문제가 발생할 수 있으므로 국내 재배를 통해서도 품질이 우수한 뿌리줄기를 다량으로 생산 할 수 있는 품종 개발을 위한 연구가 필요하다.
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