제주흑우, 한우 및 수입 소 품종에서 새로운 indel 마커의 다형성과 대립인자 분포 Polymorphisms and Allele Distribution of Novel Indel Markers in Jeju Black Cattle, Hanwoo and Imported Cattle Breeds원문보기
본 연구는 소 유전자 database들에 대한 사전 비교연구에서 발견된 삽입/결실(indel) marker들의 다형성과 각각의 유전자형의 분포를 확인하고자 수행하였다. 먼저, 소의 유전체 서열과 발현서열표식(EST) database 간의 생물정보학적 비교를 통해 전체 51 종의 indel marker들을 검출하였다. 이 중에서 42 종을 평가하여 최종적으로 9 종의 정보력이 있는 marker들을 집단분석을 위해 선발하였다. 각각의 marker들에 대한 염기서열을 재분석하였으며, marker의 다형성을 한국 재래소 품종인 한우와 제주흑우(JBC), Holstein, Angus, Charolais, Hereford 등 6 품종에서 조사하였다. 본 연구에서 이용한 소 6 품종은 8 종의 marker들에 대해 다형성을 나타내었으나, Indel_15의 경우 Holstein과 Charolais에서 다형성이 발견되지 않았다. JBC 집단에 대한 분석에서는 관찰된 이형접합자 빈도는 HW_G1 (0.600)에서 가장 높고, Indel_29 (0.274)에서 가장 낮았다. Marker에 대한 다형정보량의 수준은 HW_G4 (0.373)에서 가장 높고, Indel_6 (0.305)에서 가장 낮은 수준을 보였다. 본 연구에서 조사한 새로운 indel marker들은 특히 제주흑우 집단의 생산성 향상을 위한 분자육종 체계의 개발뿐만 아니라 친자확인이나 생산이력추적을 위한 유전정보를 제공하는데 유용할 것으로 기대된다.
본 연구는 소 유전자 database들에 대한 사전 비교연구에서 발견된 삽입/결실(indel) marker들의 다형성과 각각의 유전자형의 분포를 확인하고자 수행하였다. 먼저, 소의 유전체 서열과 발현서열표식(EST) database 간의 생물정보학적 비교를 통해 전체 51 종의 indel marker들을 검출하였다. 이 중에서 42 종을 평가하여 최종적으로 9 종의 정보력이 있는 marker들을 집단분석을 위해 선발하였다. 각각의 marker들에 대한 염기서열을 재분석하였으며, marker의 다형성을 한국 재래소 품종인 한우와 제주흑우(JBC), Holstein, Angus, Charolais, Hereford 등 6 품종에서 조사하였다. 본 연구에서 이용한 소 6 품종은 8 종의 marker들에 대해 다형성을 나타내었으나, Indel_15의 경우 Holstein과 Charolais에서 다형성이 발견되지 않았다. JBC 집단에 대한 분석에서는 관찰된 이형접합자 빈도는 HW_G1 (0.600)에서 가장 높고, Indel_29 (0.274)에서 가장 낮았다. Marker에 대한 다형정보량의 수준은 HW_G4 (0.373)에서 가장 높고, Indel_6 (0.305)에서 가장 낮은 수준을 보였다. 본 연구에서 조사한 새로운 indel marker들은 특히 제주흑우 집단의 생산성 향상을 위한 분자육종 체계의 개발뿐만 아니라 친자확인이나 생산이력추적을 위한 유전정보를 제공하는데 유용할 것으로 기대된다.
The aim of this study was to screen the polymorphisms and distribution of each genotype of insertion/ deletion (indel) markers which were found in a preliminary comparative study of bovine genomic sequence databases. Comparative bioinformatic analyses were first performed between the nucleotide sequ...
The aim of this study was to screen the polymorphisms and distribution of each genotype of insertion/ deletion (indel) markers which were found in a preliminary comparative study of bovine genomic sequence databases. Comparative bioinformatic analyses were first performed between the nucleotide sequences of Bovine Genome Project and those of expressed sequence tag (EST) database, and a total of fifty-one species of indel markers were screened. Of these, forty-two indel markers were evaluated, and nine informative indel markers were ultimately selected for population analysis. Nucleotide sequences of each marker were re-sequenced and their polymorphic patterns were typed in six cattle breeds: Holstein, Angus, Charolais, Hereford, and two Korean native cattle breeds (Hanwoo and Jeju Black cattle). Cattle breeds tested in this study showed polymorphic patterns in eight indel markers but not in the Indel-15 marker in Charolais and Holstein. The results of analysis for Jeju Black cattle (JBC) population indicated an observed heterozygosity (Ho) that was highest in HW_G1 (0.600) and the lowest in Indel_29 (0.274). The PIC value was the highest in HW_G4 (0.373) and lowest in Indel_6 (0.305). These polymorphic indel markers will be useful in supplying genetic information for parentage tests and traceability and to develop a molecular breeding system for improvement of animal production in cattle breeds as well as in the JBC population.
The aim of this study was to screen the polymorphisms and distribution of each genotype of insertion/ deletion (indel) markers which were found in a preliminary comparative study of bovine genomic sequence databases. Comparative bioinformatic analyses were first performed between the nucleotide sequences of Bovine Genome Project and those of expressed sequence tag (EST) database, and a total of fifty-one species of indel markers were screened. Of these, forty-two indel markers were evaluated, and nine informative indel markers were ultimately selected for population analysis. Nucleotide sequences of each marker were re-sequenced and their polymorphic patterns were typed in six cattle breeds: Holstein, Angus, Charolais, Hereford, and two Korean native cattle breeds (Hanwoo and Jeju Black cattle). Cattle breeds tested in this study showed polymorphic patterns in eight indel markers but not in the Indel-15 marker in Charolais and Holstein. The results of analysis for Jeju Black cattle (JBC) population indicated an observed heterozygosity (Ho) that was highest in HW_G1 (0.600) and the lowest in Indel_29 (0.274). The PIC value was the highest in HW_G4 (0.373) and lowest in Indel_6 (0.305). These polymorphic indel markers will be useful in supplying genetic information for parentage tests and traceability and to develop a molecular breeding system for improvement of animal production in cattle breeds as well as in the JBC population.
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문제 정의
소에서는 전체 유전체 서열이 보고된 이후 next generation sequencing 등을 통해 다량의 유전체 정보들이 지속적으로 보고되고 있으며, 유전 정보들과 표현형의 상관관계의 분석이 진행되고 있다. 본 연구에서는 Bovine Genome Project에서 보고한 소의 유전체 서열과 발현서열표식(expressed sequence tag, EST) database의 서열들을 비교하여 얻어낸 삽입/결실 다형을 나타내는 표지인자들을 한우와 제주흑우를 포함한 소 품종들에서 평가하여 다형성의 유형과 대립인자의 분포를 확인하고자 수행하였다.
제안 방법
Indel marker의 고안은 National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) database 상에 보고된 Bovine Genome Project의 서열을 대상으로 소의 EST 염기서열을 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)을 이용하여 탐색한 후, 단백질 암호화 영역에서 삽입/결실 돌연변이를 보이는 영역을 탐색하였다. Indel marker는 삽입/결실된 서열의 길이가 5-nt 이상, 50-nt 이하인 것만을 선별하였으며, 사전 연구를 통해 한우집단에서 다형성의 빈도가 높은 9 종의 indel marker들을 최종 선발하였다(Table 1).
준비된 반응액에 대한 PCR 증폭은 PTC-200 thermal cycler (Bio-Rad, USA) 상에서 95℃에서 3분간 초기변성, 94℃ 45초-primer annealing 온도에서 45초-72℃ 45초로 구성된 cycle을 40회 반복 수행하고 72℃에서 5분간 최종 신장하였다. PCR 증폭 산물은 ethidium bromide (EtBr)가 함유된 2.0% agarose 겔 상에서 전기영동하거나 10% polyacrylamide gel 상에서 전기영동한 후 EtBr로 염색하여 결정하였다.
Indel marker는 삽입/결실된 서열의 길이가 5-nt 이상, 50-nt 이하인 것만을 선별하였으며, 사전 연구를 통해 한우집단에서 다형성의 빈도가 높은 9 종의 indel marker들을 최종 선발하였다(Table 1). 선정된 indel marker 의 유전자형 분석을 위해 Primer3 v.0.4.0 [30]을 이용하여 유전자 증폭을 위한 primer를 고안하였다(Table 1).
연구에 이용한 9 종의 indel marker의 대립인자별 염기서열은 PCR 산물에 대한 sequencing 분석을 통해 결정하였다. 유전자 PCR 산물에 전기영동 판독 후 결정된 insertion 동형접합 자형, deletion 동형접합자형, 삽입-결실 이형접합자형에 해당 하는 PCR 산물을 각각 3 개체씩 선발하고, PCR 산물을 정제하였다.
연구에 이용한 indel marker의 고안을 위해 한우의 cDNA library sequencing을 통해 얻은 EST 염기서열을 NCBI database 상에 보고된 Bovine Genome 서열을 대상으로 BLAST 분석을 통해 삽입/결실 다형성을 확인하였다. 다형성을 나타내는 총 958 개의 영역을 검출하였다.
연구에 이용한 9 종의 indel marker의 대립인자별 염기서열은 PCR 산물에 대한 sequencing 분석을 통해 결정하였다. 유전자 PCR 산물에 전기영동 판독 후 결정된 insertion 동형접합 자형, deletion 동형접합자형, 삽입-결실 이형접합자형에 해당 하는 PCR 산물을 각각 3 개체씩 선발하고, PCR 산물을 정제하였다. 정제된 PCR 산물을 주형으로 PCR primer를 이용하여 dye-termination 반응을 수행한 후, MegaBase1000 (Amersham Pharmacia, USA)을 이용하여 염기서열을 결정하였고, 다시 BLAST 검색을 통해 GenBank database에 보고된 서열과 비교하였다.
유전자형 결정을 위한 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 반응은 50 ng의 genomic DNA 용액에 1× PCR buffer, 125 mM dNTP, 0.3 unit Taq DNA polymerase (iNtRON Biotechnology, Korea)에 각각의 primer와 멸균 증류수를 첨가하여 최종 20 μl가 되게 하여 준비하였다.
전혈에서 DNA 분리는 Sambrook 등[31]의 방법을 변형하여 수행하였으며, 분리한 DNA는 NanoDrop ND-1000 spectrophotometer (NanoDrop Technology, USA)로 흡광도를 측정한 후 A260/A280와 A230/A280이 모두 1.8 이상인 DNA들을 50-60 ng/μl로 희석하여 PCR 반응의 주형으로 이용하였다.
유전자 PCR 산물에 전기영동 판독 후 결정된 insertion 동형접합 자형, deletion 동형접합자형, 삽입-결실 이형접합자형에 해당 하는 PCR 산물을 각각 3 개체씩 선발하고, PCR 산물을 정제하였다. 정제된 PCR 산물을 주형으로 PCR primer를 이용하여 dye-termination 반응을 수행한 후, MegaBase1000 (Amersham Pharmacia, USA)을 이용하여 염기서열을 결정하였고, 다시 BLAST 검색을 통해 GenBank database에 보고된 서열과 비교하였다.
제주흑우와 한우를 포함한 소 6 품종에서 indel marker 9종의 다형성을 PCR 산물에 대한 agarose gel 전기영동으로 확인하였다. 각각의 indel marker에 대한 PCR 증폭산물은 oligo nucleotide의 삽입/결실을 보여주는 두 가지의 동형접합자형들(LL, SS)과 하나의 이형접합자형(LS)으로 구분되었다(Fig.
핵 DNA의 유전정보는 Mendelian inheritance를 따르는 유전양상을 나타냄으로, 대립인자의 유무에 따라 선친과 후대의 직접적인 혈연관계를 추정할 수 있는 매우 중요한 분자적 증거가 된다[2,8,15,26-29]. 축산분야에서 핵 DNA의 유전정보는 다형성이 높은 marker의 조합을 통해 유전자 분석체계는 대규모 축군 내에서 개체식별뿐만 아니라 대부분 부분육으로 유통되는 축산물의 동일성검사를 통한 원산지 추적이 가능한 단계에 접어들었다. 특히 한우의 경우 우리나라에서 전면적인 DNA 기반 생산이력추적제와 도체에 대한 동일성검사의 정착으로 국내산 한우에 대한 유통 질서가 정착하는 데 크게 기여하였으며, 부가적으로 해외에서 수입된 수육과의 구분도 가능해졌다.
대상 데이터
본 연구에 이용한 제주흑우(n=160)와 한우(n=152)는 농촌진흥청 국립축산과학원 난지축산시험장(Subtropical Animal Experiment Station, National Institute of Animal Science, RDA; SAES)과 제주도 축산진흥원(Livestock Promotion Institute, Jeju-do)에서 보관중인 genomic DNA를 제공받거나 말초동맥에서 혈액을 채취하여 DNA를 분리하였다. Holstein (n=54), Angus (n=32), Charolais (n=21), Hereford (n=13) 등은 SAES에서 제공받은 것을 이용하였으며, 한우는 경기도와 제주도에서 수집한 혈액에서 DNA를 분리하였다. 전혈에서 DNA 분리는 Sambrook 등[31]의 방법을 변형하여 수행하였으며, 분리한 DNA는 NanoDrop ND-1000 spectrophotometer (NanoDrop Technology, USA)로 흡광도를 측정한 후 A260/A280와 A230/A280이 모두 1.
cgi)을 이용하여 탐색한 후, 단백질 암호화 영역에서 삽입/결실 돌연변이를 보이는 영역을 탐색하였다. Indel marker는 삽입/결실된 서열의 길이가 5-nt 이상, 50-nt 이하인 것만을 선별하였으며, 사전 연구를 통해 한우집단에서 다형성의 빈도가 높은 9 종의 indel marker들을 최종 선발하였다(Table 1). 선정된 indel marker 의 유전자형 분석을 위해 Primer3 v.
연구에 이용한 indel marker의 고안을 위해 한우의 cDNA library sequencing을 통해 얻은 EST 염기서열을 NCBI database 상에 보고된 Bovine Genome 서열을 대상으로 BLAST 분석을 통해 삽입/결실 다형성을 확인하였다. 다형성을 나타내는 총 958 개의 영역을 검출하였다. 검출된 영역 중 단백질을 암호화하는 영역에 해당되는 것은 총 51 종으로 확인되었고, 이 중 삽입/결실된 단위서열의 길이가 5-nt 이상, 50-nt 이하인 42 종을 다시 선별했다.
본 연구에 이용한 제주흑우(n=160)와 한우(n=152)는 농촌진흥청 국립축산과학원 난지축산시험장(Subtropical Animal Experiment Station, National Institute of Animal Science, RDA; SAES)과 제주도 축산진흥원(Livestock Promotion Institute, Jeju-do)에서 보관중인 genomic DNA를 제공받거나 말초동맥에서 혈액을 채취하여 DNA를 분리하였다. Holstein (n=54), Angus (n=32), Charolais (n=21), Hereford (n=13) 등은 SAES에서 제공받은 것을 이용하였으며, 한우는 경기도와 제주도에서 수집한 혈액에서 DNA를 분리하였다.
선발한 42 종의 marker들은 한우 96 두를 대상으로 PCR 효율과 다형성의 빈도를 사전 평가하였다(자료 미기재). 사전평가를 통해 유전자 marker의 PIC 수준이 0.25 이상인 9 종의 indel marker들을 최종 선발하였다(Table 1).
데이터처리
시험에 이용한 indel marker들의 대립인자형 분석에서 산출된 모든 좌위에 대한 적은 대립인자 빈도(minor allele frequency, MAF)와 관찰이형접합도(observed heterozygosity), 기대이형접합도(expected heterozygosity, He), 다형정보량 (polymorphic information contents, PIC), χ2 value, P-value, Hardy-Weinberg equilibrium (HWE) 등은 CERVUS 3.0.3[14]을 이용하여 분석하였다.
이론/모형
χ2 value는 Yates’ correction을 이용하였고, HWE의 유의성은 Bonferroni correction을 이용하였다.
성능/효과
Indel-15의 경우 BTA5에 위치하는 염기서열로 확인되었으며, 시험에 사용된 품종 중 대표적인 외국산 소 품종인 Holstien과 Charolais에서 결실형 유전자형이 없다는 점은 비록 본 연구에서 사용한 품종별 개체 수가 충분히 많다고 단정할 수는 없으나, Iindel-15 marker의 유전자형 분포가 해당 품종을 검출할 수 있는 분자 표지인자로 활용할 수 있다는 점을 보여준다고 하겠다.
1). 전체 9 종의 marker 중에서 Indel-15를 제외한 8 종의 marker들은 모두 다형성을 나타내었고, Indel-15는 Holstein 과 Charolais 품종에서는 조사에 이용한 모든 시료에서 결실형인 유전자형이 전혀 발견되지 않았다.
Table 2는 각각의 indel marker에 대한 PIC를 나타낸 것이다. 전체적으로는 제주흑우의 PIC가 평균 0.362로 가장 높고, Charolais는 0.246으로 가장 낮은 수준을 나타내었다. 제주흑우에서는 HW_G04 marker의 PIC가 0.
축산분야에서 핵 DNA의 유전정보는 다형성이 높은 marker의 조합을 통해 유전자 분석체계는 대규모 축군 내에서 개체식별뿐만 아니라 대부분 부분육으로 유통되는 축산물의 동일성검사를 통한 원산지 추적이 가능한 단계에 접어들었다. 특히 한우의 경우 우리나라에서 전면적인 DNA 기반 생산이력추적제와 도체에 대한 동일성검사의 정착으로 국내산 한우에 대한 유통 질서가 정착하는 데 크게 기여하였으며, 부가적으로 해외에서 수입된 수육과의 구분도 가능해졌다. 본 연구에서 발견된 Indel_15의 조사결과와 같이 특정 품종에서 어느 한 대립인자가 완전히 상실된 형태의 marker들을 조합한다면, 유전자 분석을 통한 품종의 식별이 훨씬 더 수월해 질 것으로 예상된다.
후속연구
본 연구에서 고안한 indel marker의 경우 제주흑우 집단에서 이형접합율, PIC 등이 상대적으로 높다는 점에서 향후 기존의 MS marker 위주의 유전자 검사 체계를 보완하거나 유전자형 판독에 있어 기술적인 어려움을 나타내는 MS marker를 대처할 수 있는 체계도 가능 하리라 판단된다. MS marker에 비해 indel marker가 비록 대립인자의 수가 한정되어 있어 기본적으로 PIC가 상대적으로 낮은 점은 없지 않지만, 친자감별 등에서 요구되는 명확한 유전자형의 판독 등에는 훨씬 더 유리하며, PCR 산물에 대한 agarose gel 전기영동만으로도 marker의 유전자형을 명확하게 판독할 수 있어, 표지된 형광 분자를 확인하게 위해 이용되는 고가의 검사장비를 갖추지 않아도 된다는 장점이 있다고 하겠다.
특히 한우의 경우 우리나라에서 전면적인 DNA 기반 생산이력추적제와 도체에 대한 동일성검사의 정착으로 국내산 한우에 대한 유통 질서가 정착하는 데 크게 기여하였으며, 부가적으로 해외에서 수입된 수육과의 구분도 가능해졌다. 본 연구에서 발견된 Indel_15의 조사결과와 같이 특정 품종에서 어느 한 대립인자가 완전히 상실된 형태의 marker들을 조합한다면, 유전자 분석을 통한 품종의 식별이 훨씬 더 수월해 질 것으로 예상된다.
MS marker에 비해 indel marker가 비록 대립인자의 수가 한정되어 있어 기본적으로 PIC가 상대적으로 낮은 점은 없지 않지만, 친자감별 등에서 요구되는 명확한 유전자형의 판독 등에는 훨씬 더 유리하며, PCR 산물에 대한 agarose gel 전기영동만으로도 marker의 유전자형을 명확하게 판독할 수 있어, 표지된 형광 분자를 확인하게 위해 이용되는 고가의 검사장비를 갖추지 않아도 된다는 장점이 있다고 하겠다. 향후 본 연구에서 고안된 indel marker들을 단독으로 또는 MS marker들과 조합하여 다량의 시료들을 신속하고 명확하게 분석할 수 있는 multiplex PCR 기법 등이 개발된다면, 친자검정, 개체식별 등 혈통 정립 사업뿐만 아니라, 제주흑우 생산이력추적제나 품종인증 검사체계 등의 기틀을 마련하는 데 기여할 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
9 종의 indel marker의 대립인자별 염기서열을 어떻게 PCR 산물에 대한 sequencing 분석을 통해 결정했는가?
연구에 이용한 9 종의 indel marker의 대립인자별 염기서열은 PCR 산물에 대한 sequencing 분석을 통해 결정하였다. 유전자 PCR 산물에 전기영동 판독 후 결정된 insertion 동형접합 자형, deletion 동형접합자형, 삽입-결실 이형접합자형에 해당 하는 PCR 산물을 각각 3 개체씩 선발하고, PCR 산물을 정제하였다. 정제된 PCR 산물을 주형으로 PCR primer를 이용하여 dye-termination 반응을 수행한 후, MegaBase1000 (Amersham Pharmacia, USA)을 이용하여 염기서열을 결정하였고, 다시 BLAST 검색을 통해 GenBank database에 보고된 서열과 비교하였다.
축산업에서 DNA 분석기법이 어디에 이용되고 있는가?
과거부터 혈액형이나 혈액단백질의 동위효소에 대한 정보뿐만 아니라 최근에는 법의학적 검증에서 DNA 분석기법, 특히 초위성체(microsatellite marker, MS) DNA 표지인자의 반복양상에 따른 유전자형 자료를 기반으로 가축 품종들의 유연관계, 혈통 증명, 집단 식별 및 개체추적과 친자확인 등에 광범위하게 이용되고 있다[1,6,13,16,23,24]. 또한 한우의 황모색, 제주흑우의 흑모색 등 품종 특이적 특성을 반영하는 유전자의 단일염기변이(single nucleotide polymorphism, SNP)와 부계 (Y 염색체)나 모계(mtDNA) 유전을 통해 자손으로 전달되는 유전자의 다형성들은 검증 대상에서 특이적으로 중요한 정보의 보유여부를 판독할 수 있는 자료로써 활용 가능성이 제기되었다[18-20,34-35].
소 품종의 유전자형 결정을 위해 중합효소연쇄반응은 어떻게 준비했는가?
유전자형 결정을 위한 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 반응은 50 ng의 genomic DNA 용액에 1× PCR buffer, 125 mM dNTP, 0.3 unit Taq DNA polymerase (iNtRON Biotechnology, Korea)에 각각의 primer와 멸균 증류수를 첨가하여 최종 20 μl가 되게 하여 준비하였다. 준비된 반응액에 대한 PCR 증폭은 PTC-200 thermal cycler (Bio-Rad, USA) 상에서 95℃에서 3분간 초기변성, 94℃ 45초-primer annealing 온도에서 45초-72℃ 45초로 구성된 cycle을 40회 반복 수행하고 72℃에서 5분간 최종 신장하였다.
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