9 종류의 종자 중 대식세포를 자극하여 NO 생성능이 높은 메밀, 민들레, 봉선화, 해바라기 4종의 종자를 선별하였다. 선별된 4종의 종자 추출물이 RAW 264.7 세포를 활성화시켜 면역을 증진시키는 효과를 알아보기 위해 RAW 264.7 세포와 T세포를 이용하여 면역 활성능 관련 지표를 조사하였다. 4종의 종자를 대식세포에 처리하였을 때 면역 활성의 지표가 되는 NO, cytokine(TNF-${\alpha}$, IL-$1{\beta}$, IL-6, IL-10)의 생성이 추출물을 처리하지 않은 대조군에 비해 증가되었고, Molt-4 세포에 처리하였을 때 대조군에 비해 세포가 증식되었다. 이와 같은 결과는 종자 추출물을 섭취하였을 때 외부로부터의 어떠한 자극이 있기 이전에 체내의 모든 조직에 분포하면서 1차적으로 이물질을 제거하는 대식세포를 자극하여 cytokine 등의 면역매개물질을 생성하여 인체의 비특이적 면역반응을 증가시킴으로써 항원을 공격, 제거하는 등의 작용을 통해 자연 면역반응에 있어 중요한 역할을 할 수 있을 것으로 판단된다.
9 종류의 종자 중 대식세포를 자극하여 NO 생성능이 높은 메밀, 민들레, 봉선화, 해바라기 4종의 종자를 선별하였다. 선별된 4종의 종자 추출물이 RAW 264.7 세포를 활성화시켜 면역을 증진시키는 효과를 알아보기 위해 RAW 264.7 세포와 T세포를 이용하여 면역 활성능 관련 지표를 조사하였다. 4종의 종자를 대식세포에 처리하였을 때 면역 활성의 지표가 되는 NO, cytokine(TNF-${\alpha}$, IL-$1{\beta}$, IL-6, IL-10)의 생성이 추출물을 처리하지 않은 대조군에 비해 증가되었고, Molt-4 세포에 처리하였을 때 대조군에 비해 세포가 증식되었다. 이와 같은 결과는 종자 추출물을 섭취하였을 때 외부로부터의 어떠한 자극이 있기 이전에 체내의 모든 조직에 분포하면서 1차적으로 이물질을 제거하는 대식세포를 자극하여 cytokine 등의 면역매개물질을 생성하여 인체의 비특이적 면역반응을 증가시킴으로써 항원을 공격, 제거하는 등의 작용을 통해 자연 면역반응에 있어 중요한 역할을 할 수 있을 것으로 판단된다.
In this study, the immuno-enhancing activity of seed extracts were studied on the macrophage cell lines. We examined the effect of nine seed extracts on nitric oxide (NO) production in RAW 264.7 cells and selected four highly-effective seed candidates (Fagopyrum esculentum, Taraxacum platycarpum, Im...
In this study, the immuno-enhancing activity of seed extracts were studied on the macrophage cell lines. We examined the effect of nine seed extracts on nitric oxide (NO) production in RAW 264.7 cells and selected four highly-effective seed candidates (Fagopyrum esculentum, Taraxacum platycarpum, Impatiens balsamina, Helianthus annuus) for further immune-related studies. The effects of the four seed extracts on the production of immune-related cytokines in the RAW 264.7 macrophage cell line and proliferation of Molt-4 as a T cell line were investigated. The secretion of NO from the RAW 264.7 cells was increased up to 39 ${\mu}M$ by adding the seed extracts (25 ${\mu}g/mL$) compared to the control. Also, the secretion of tumor necrosis factor-alpha (TNF-${\alpha}$) was also increased up to 32 times by adding the seed extracts (25 ${\mu}g/mL$). Secretion of cytokines such as interleukin-1 beta (IL-$1{\beta}$), interleukin-6 (IL-6), and interleukin-10 (IL-10) was also increased and induced the proliferation of T cells compared to the control. In conclusion, these results suggest that four seed extracts provide beneficial immuno-enhancing effects for human health.
In this study, the immuno-enhancing activity of seed extracts were studied on the macrophage cell lines. We examined the effect of nine seed extracts on nitric oxide (NO) production in RAW 264.7 cells and selected four highly-effective seed candidates (Fagopyrum esculentum, Taraxacum platycarpum, Impatiens balsamina, Helianthus annuus) for further immune-related studies. The effects of the four seed extracts on the production of immune-related cytokines in the RAW 264.7 macrophage cell line and proliferation of Molt-4 as a T cell line were investigated. The secretion of NO from the RAW 264.7 cells was increased up to 39 ${\mu}M$ by adding the seed extracts (25 ${\mu}g/mL$) compared to the control. Also, the secretion of tumor necrosis factor-alpha (TNF-${\alpha}$) was also increased up to 32 times by adding the seed extracts (25 ${\mu}g/mL$). Secretion of cytokines such as interleukin-1 beta (IL-$1{\beta}$), interleukin-6 (IL-6), and interleukin-10 (IL-10) was also increased and induced the proliferation of T cells compared to the control. In conclusion, these results suggest that four seed extracts provide beneficial immuno-enhancing effects for human health.
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문제 정의
본 연구에서는 4종의 종자 추출물이 대식세포를 활성화시켜 NO 생성에 어떠한 영향을 끼치는지 알아보기 위하여 RAW 264.7 세포에 종자 추출물을 12, 25 μg/mL의 농도로 처리한 결과, 대조군에 비하여 최대 19.9배 많은 NO를 생성하였고 25 μg/mL의 농도에서는 양성 대조군인 LPS를 처리한 것과 비슷한 수준으로 NO를 생성하였다(Fig. 2).
본 연구에서는 9가지 종자 추출물 중 NO 생성능이 높은 4가지 종자를 선별한 후 이들의 면역 관련 활성 능력을 알아보았다. 종자 추출물을 대식세포주인 RAW 264.
제안 방법
Cytokine인 TNF-α와 IL-1β, IL-6, IL-10의 생성량 측정은 RAW 264.7 세포를 96 well plate에 2×105 cell/well의 농도로 분주 24시간 후 종자 추출물을 12, 25 μg/mL로 처리하고, 24시간 배양 후 세포의 상층액을 모아서 각각의 ELISA kit(Enzo Inc., Ann Arbor, MI, USA)를 이용하여 측정하였다 (13).
0)에 용해하고, polyvinylpyrrolidone 5 g을 첨가하여 10℃에서 16시간 교반 후 원심분리 하였다. 상등액을 여과하여 불순물을 제거하고, 80% ammonium sulfate로 4시간 동안 처리한 후 원심 분리 하여 얻은 pellet은 20 mM tris-HCl buffer(pH 7.4)에 녹여 투석막(spectra/por dialysis membrane MWCO: 6,000～8,000, Spectrum Laboratories, Inc., Rancho dominguez, CA, USA)을 이용하여 10℃에서 48시간 동안 투석하였다. 투석된 용액은 동결건조 하였고, 얻어진 추출 건조분말은-20℃ 이하에 보관하면서 실험에 사용하였다.
9 종류의 종자 중 대식세포를 자극하여 NO 생성능이 높은 메밀, 민들레, 봉선화, 해바라기 4종의 종자를 선별하였다. 선별된 4종의 종자 추출물이 RAW 264.7 세포를 활성화시켜 면역을 증진시키는 효과를 알아보기 위해 RAW 264.7 세포와 T세포를 이용하여 면역 활성능 관련 지표를 조사하였다. 4종의 종자를 대식세포에 처리하였을 때 면역 활성의 지표가 되는 NO, cytokine(TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10)의 생성이 추출물을 처리하지 않은 대조군에 비해 증가되었고, Molt4 세포에 처리하였을 때 대조군에 비해 세포가 증식되었다.
종자 추출물을 대식세포주인 RAW 264.7 세포에 처리한 다음 대식세포가 생성하는 NO 및 이와 관련된 cytokine들인 tumor necrosis factor-alpha(TNF-α), interleukin-1beta(IL-1β), interleukin-6(IL-6), interleukin-10(IL-10)의 생성량을 측정하였고, T세포주인 Molt-4 세포에 처리하여 면역세포 증식능을 확인하여 종자 추출물의 면역증진 기능성식품 소재로서 응용 가능성을 검토하고자 하였다.
종자 추출물의 RAW 264.7 세포에 대한 독성 측정은 생존 세포의 효소작용에 의해 자줏빛 formazan 생성물로 변하는 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherland) 환원을 이용하는 방법으로 측정하였다(12).
종자 추출물의 T세포에 대한 증식능을 확인하기 위하여 Molt-4 세포를 96 well plate에 1×105 cell/well 농도로 분주후 양성대조군으로 concanavalin A(Con A) 5 μg/mL와 종자 추출물을 12, 25 μg/mL로 각각 처리한 후 96시간 배양하여 MTT assay를 실시하였다(14).
종자의 면역증강 능력을 확인하기 위하여 microplate assay를 이용하여 RAW 264.7 세포의 배양 상등액 중의 NO의 생성 농도를 정량함으로써 측정하였다. 즉 RAW 264.
즉 RAW 264.7 세포를 2×105 cell/well의 농도로 96 well plate에 분주 24시간후 또는 종자 추출물을 12, 25 μg/mL로 처리하고, 양성대조군으로는 1 μg/mL의 lipopolysaccharide(LPS)를 처리하여 24시간 배양하였다.
대상 데이터
9 종류의 종자 중 대식세포를 자극하여 NO 생성능이 높은 메밀, 민들레, 봉선화, 해바라기 4종의 종자를 선별하였다. 선별된 4종의 종자 추출물이 RAW 264.
21582) 세포는 한국세포주은행(KTCC, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용 하였다. RAW 264.7 세포는 10% FBS를 함유한 DMEM 배지(Gibco, Grand Island, NY, USA)를 이용하였고, Molt-4세포는 10% FBS를 함유한 RPMI 1640 배지(Gibco)를 이용하여 37℃, 5% CO2로 조절된 incubator에서 배양하였다.
고추(Capsicum annuum), 달맞이(Oenothera odorata), 메밀(Fagopyrum esculentum), 민들레(Taraxacum platycarpum), 봉선화(Impatiens balsamina), 비수리(Lespedeza cuneata), 쑥(Artemisia princeps), 채송화(P ortulaca grandiflora), 해바라기(Helianthus annuus) 등의 종자는 (주)서 종꽃씨(Yangpyeong, Korea)에서 구입하여 사용하였다. Bae 등의 방법(11)에 따라 n-hexane을 이용하여 탈지한 분말 종자 50 g을 1 L의 20 mM tris-HCl buffer(pH 8.
실험에 사용한 대식세포주인 RAW 264.7(KTCC No. 40071) 세포와 T세포주인 Molt-4(KTCC No. 21582) 세포는 한국세포주은행(KTCC, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용 하였다. RAW 264.
데이터처리
Values with the different letters are significantly different by one-way ANOVA test (p< 0.05).
본 실험에서 측정한 분석결과는 평균±표준편차로 표기하였으며, 실험군 간의 통계학적 분석은 analysis of variance(ANOVA) 분석을 실시하였고, Duncan's multiple range test로 p<0.05의 수준에서 통계학적 유의성을 검정하였다.
성능/효과
4종의 종자를 대식세포에 처리하였을 때 면역 활성의 지표가 되는 NO, cytokine(TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10)의 생성이 추출물을 처리하지 않은 대조군에 비해 증가되었고, Molt4 세포에 처리하였을 때 대조군에 비해 세포가 증식되었다.
IL-1β는 T세포의 활성화, B세포의 성숙 및 NK세포의 활성을 증가시키는 것에 관여하는 것으로 볼 때(23) 본 실험의 종자 추출물이 1차적으로 대식세포를 활성화시켜 IL-1β의 생성을 증가시키고 증가된 IL-1β가 2차적으로 T 세포와 B세포를 자극하여 면역 체계를 활성화시켜 체내 면역증강에 도움을 줄 수 있을 것으로 사료된다.
IL-10의 경우 본 연구에서 4종의 종자 추출물을 12, 25μg/mL의 농도별로 대식세포에 처리 시 IL-10의 생성이 대조군에 비해 유의적으로 증가하였으며, 특히 메밀 종자의경우 25 μg/mL의 농도에서 양성대조군인 LPS를 처리한 것과 유사하게 IL-10이 생성되었음을 확인하였다(Fig. 3D).
대식세포를 활성화시키는 면역증강 소재를 선정하기 위하여 민들레, 메밀 등 9종의 종자 추출물을 대식세포에 처리한 후 NO 생성량을 측정한 결과, Table 1에서 보는 바와 같이 9종의 종자 추출물 중 메밀, 민들레, 봉선화, 해바라기 종자가 각각 35.93, 35.69, 36.64, 39.59 μM의 NO를 생성하여 다른 종자들과 비교하였을 때 유의적으로 높은 NO를 생성하였고, 이는 대식세포를 활성화시켜 면역증강에 영향을 줄 것으로 사료되어 면역관련 지표를 분석하였다.
Majdalawieh와 Carr(24)는 후추 종자 추출물을 대식세포에 농도별로 처리 시 대조군에 비해 유의적으로 높은 IL-6를 생성하였다고 보고한 바 있다. 따라서 본 연구 실험 결과 4종의 종자 추출물에 의해 활성화된 대식세포에서 면역매개인자인 IL-6의 생성을 촉진함으로써 면역 활성을 증진시키는 효능이 있는 것으로 보이며, 생성이 증가된 IL-6는 단일클론항체의 생성에 관여하는 cytokine으로(23) 특정한 외부 물질 침입 시에 항체를 생성하는 B세포를 자극함으로써 체내 면역을 증가시킬 수 있을 것으로 사료된다.
따라서 본 연구결과 대식세포에 종자 추출물만을 처리하였을 때 25 μg/mL의 농도에서 LPS를 처리한 것과 비슷한 수준으로 NO를 생성한 것으로 볼 때 외부로부터의 자극이 있기 전에 4종의 종자 추출물이 면역세포를 스스로 자극시켜 외부 물질 칩입 등의 감염에 대한 1차 방어를 하여 면역반응이 일어나는 초기에 생체 방어에 유리한 작용을 할 수 있을 것으로 보인다.
IL-6는 조혈작용과 면역반응을 조절하는데 관여하는 다양한 기능을 가진 cytokine으로서 B세포의 항체생성 세포인 plasma cell의 최종 분화를 유도하는 활성을 가진 B세포 자극 인자로 면역글로불린의 합성을 증진하고, 다른 cytokine 과 협동하여 상승작용을 나타내는 등 다양한 작용을 한다 (22). 본 실험 결과 4종의 종자 추출물을 농도별로 처리 시 양성 대조군인 LPS를 단독으로 처리한 것보다는 낮았지만, 대조군보다는 유의적으로 높은 IL-6를 생성하였다(Fig. 3C). Majdalawieh와 Carr(24)는 후추 종자 추출물을 대식세포에 농도별로 처리 시 대조군에 비해 유의적으로 높은 IL-6를 생성하였다고 보고한 바 있다.
본 연구 결과 4종의 종자를 대식세포에 처리 시 대조군에 비해 유의적으로 높은 IL-1β를 생성하였으며, 특히 민들레 씨의 경우 25 μg/mL의 농도 처리시 대조군에 비해 18배 높은 IL-1β가 생성되었다 (Fig. 3B).
본 연구 결과 LPS를 처리한 경우 대조군에 비하여 유의적으로 높은 TNF-α를 생성하였고, 4종의 종자 추출물을 처리한 경우 TNF-α의 생성이 대조군보다 유의적으로 높았으며, 25 μg/mL의 농도에서는 양성대조군인 LPS를 처리한 것과 비슷한 수준으로 TNF-α가 생성되어 종자 추출물이 LPS 수준으로 대식세포를 활성화시키는 것으로 나타났다(Fig. 3A).
본 연구 결과 메밀 등의 종자 추출물은 대식세포를 자극하여 활성화시키는 면역 활성인자로 작용하는 것으로 판단된다. 특히 메밀과 해바라기 종자는 식용가능한 원료이기 때문에 면역증진 소재 개발에 유용한 자원으로 활용될 수 있으며, 향후 정제과정을 통하여 활성성분을 분리하고 구조 특성및 기타 생리활성을 규명함으로써 고부가가치 식품 소재로서의 이용가능성을 검토할 필요가 있을 것으로 사료된다.
Majdalawieh와 Carr(24)는 cardamon 종자 추출물을 비장 세포에 처리 시 IL-10의 생성이 1, 10 μg/mL의 농도에서는대조군과 유의적인 차이가 없었으나 50, 100 μg/mL의 농도로 처리 시 대조군에 비해 유의적으로 IL-10의 생성이 증가하였다고 보고하였고, Wang 등(25)은 파파야 종자에서 추출한 lectin을 monocyte에 농도별로 처리 시 농도별로 IL-10의 생성이 증가하였으나 대조군과 유의적인 차이가 없다고 보고하였다. 본 연구 결과 종자 추출물은 대식세포를 자극하여 활성화시켜 IL-10의 생성을 증가시킴으로써 B세포를 조절하여 항체 생성에 영향을 주어 체액성 면역증강 효과에 도움을 줄 수 있을 것으로 사료된다.
본 연구에서는 T세포주인 Molt-4 세포에 4종의 종자 추출물을 12, 25 μg/mL의 농도로 처리하여 증식능을 측정한 결과(Fig. 4), 25 μg/mL의 농도 처리 시 대조군에 비해 최대 1.4배 증가하였고, 특히 메밀, 봉선화, 해바라기 종자의 경우 25 μg/mL의 농도에서는 양성대조군인 Con A를 처리한 것보다 유의적으로 높은 세포 증식이 일어났다.
종자 추출물의 세포독성 여부를 확인하기 위하여 미토콘드리아의 활성을 이용한 MTT assay를 이용하여 세포독성능을 측정하였고, 그 결과는 Fig. 1에서 보는 바와 같이 4종의 종자 추출물은 12, 25 μg/mL의 농도에서 모두 90% 이상의 세포 생존율을 나타내어 세포독성에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
후속연구
4종의 종자를 대식세포에 처리하였을 때 면역 활성의 지표가 되는 NO, cytokine(TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10)의 생성이 추출물을 처리하지 않은 대조군에 비해 증가되었고, Molt4 세포에 처리하였을 때 대조군에 비해 세포가 증식되었다. 이와 같은 결과는 종자 추출물을 섭취하였을 때 외부로부터의 어떠한 자극이 있기 이전에 체내의 모든 조직에 분포하면서 1차적으로 이물질을 제거하는 대식세포를 자극하여 cytokine 등의 면역매개물질을 생성하여 인체의 비특이적 면역반응을 증가시킴으로써 항원을 공격, 제거하는 등의 작용을 통해 자연 면역반응에 있어 중요한 역할을 할 수 있을 것으로 판단된다.
본 연구 결과 메밀 등의 종자 추출물은 대식세포를 자극하여 활성화시키는 면역 활성인자로 작용하는 것으로 판단된다. 특히 메밀과 해바라기 종자는 식용가능한 원료이기 때문에 면역증진 소재 개발에 유용한 자원으로 활용될 수 있으며, 향후 정제과정을 통하여 활성성분을 분리하고 구조 특성및 기타 생리활성을 규명함으로써 고부가가치 식품 소재로서의 이용가능성을 검토할 필요가 있을 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
국내의 식물소재의 생리활성 성분에 대한 연구는 어떤 것들이 있는가?
일반적으로 유지를 많이 함유한 식물종자에는 항산화 물질이 함유되어 있다고 알려져 있어 항산화 활성과 관련된 연구는 많이 행해지고 있지만 면역증강 및 조절과 관련된 연구는 미흡한 실정이다. 지금까지 국내에서 보고된 종자에 관한 연구로는 비자 추출물의 생리활성(5), 호박 부위별 항산화효과(6), 고추씨의 생리활성(7), 녹차 종자의 생리활성(8), 홍화씨의 생리활성(9), 참외 씨의 항산화 활성(10) 등이 있다.
면역이란?
면역은 생체가 자기 성분 이외의 물질이 생체의 항상성을 깨드리거나 자기를 위협하는 것을 배제하기 위해 일어나는 일련의 생체방어반응을 의미하며, 대식세포가 관련된 비특이적 면역과 T림프구 및 B림프구가 관련된 특이적 면역으로 분류할 수 있다(1). 비특이적 면역은 자연 면역이라고도하며, 대식세포 및 백혈구 등으로 구성되어 있다.
비특이적 면역의 구성은?
면역은 생체가 자기 성분 이외의 물질이 생체의 항상성을 깨드리거나 자기를 위협하는 것을 배제하기 위해 일어나는 일련의 생체방어반응을 의미하며, 대식세포가 관련된 비특이적 면역과 T림프구 및 B림프구가 관련된 특이적 면역으로 분류할 수 있다(1). 비특이적 면역은 자연 면역이라고도하며, 대식세포 및 백혈구 등으로 구성되어 있다. 대식세포는 체내의 모든 조직에 분포하면서 1차적으로 bacteria, virus 등의 감염성 병원체뿐만 아니라 노화된 정상세포와 암세포 등에 대해 탐식작용(phagocytosis)을 일으켜 제거하는 방어능력을 가지며, 항원제시작용 및 interleukin 계열, TNFα 등의 다양한 cytokine과 생리활성물질을 분비하여 면역반응을 극대화시키는 중요 매개체 역할을 한다.
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