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문제 정의
- 본 연구에서는 12가지 생약추출물 중 NO 생성능이 높은 5가지 생약재를 선별한 후 이들의 면역 관련 활성 능력을 알아보았다. 생약추출물을 대식세포주인 RAW 264.
제안 방법
- 12가지 생약재 중 NO 생성능이 가장 높게 나타난 5종의 생약재는 감초, 건지황, 당귀, 도라지, 목천료 추출물로 각각 33.9, 39.3, 37.4, 35.5, 38.5 μM의 NO를 생성하였고, 이는 다른 생약재와 비교하였을 때 대식세포를 활성화시켜 cytokine 등의 생성을 증가시켜 면역 반응을 증진시킬 가능성이 있는 것으로 사료되어 5종의 생약재를 선별한 후 면역관련 지표를 분석하였다.
- Cytokine인 TNF-α와 IL-1β, IL-6, IL-10의 생성량 측정은 RAW 264.7 세포를 96 well plate에 2×105 cell/well의 농도로 분주 24시간 후 생약추출물을 12, 25 μg/mL로 처리하고, 24시간 배양 후 세포의 상층액을 모아서 각각의 ELISA kit(Enzo Inc., Ann Arbor, MI, USA)를 이용하여 측정하였다(7).
- 2 mL(1 mg/mL)와 혼합 후 실온에서 20분간 반응시킨 후 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. Glucose를 표준당으로 하여 총당 함량을 계산하였다.
- 본 연구에서는 T세포주인 Molt-4 세포에 5종의 생약추출물을 12, 25 μg/mL의 농도로 처리하여 48시간 배양 후 증식능을 측정하였고 그 결과를 Fig. 4에 나타내었다.
- 0)에 용해하고 polyvinylpyrrolidone 5 g을 첨가하여 10℃에서 16시간 교반 후 원심분리 하였다. 상등액을 여과하여 불순물을 제거하고, 80% ammonium sulfate로 4시간 동안 처리한 후 원심분리 하여 얻은 pellet은 20 mM tris-HCl buffer(pH 7.4)에 녹여 투석막 (spectra/por dialysis membrane, MWCO: 6,000～8,000, Spectrum Laboratories, Inc., Rancho Dominguez, CA, USA)을 이용하여 10℃에서 48시간 동안 투석하였다. 투석된 용액은 동결건조 하였고, 얻어진 추출 건조분말은 -20℃ 이하에 보관하면서 실험에 사용하였다.
- 생약재의 면역 증강능력을 확인하기 위하여 microplate assay를 이용하여 RAW 264.7 세포의 배양 상등액 중의 NO2-의 생성 농도를 정량함으로써 측정하였다. 즉, RAW 264.
- 생약추출물내 단백질 함량은 Bicincchoninic acid protein assay kit(BCA, Thermo, Rockford, IL, USA)를 이용하여 분석하였다. Bovine serum albumin을 표준물질로 사용하여 각각의 시료 25 μL를 96 well plate에 분주하고 BCA assay reagent 200 μL를 가하여 37℃에서 30분간 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 생약추출물을 대식세포주인 RAW 264.7 세포에 처리한 다음 대식세포가 생성하는 NO 및 이와 관련된 cytokine들인 tumor necrosis factor-alpha(TNF-α), interleukin-1beta(IL-1β), interleukin-6(IL-6), interleukin-10(IL-10)의 생성량을 측정하였고, T세포주인 Molt-4 세포에 처리하여 면역세포 증식능을 확인하여 생약추출물의 면역 증진 기능성식품 소재로서 응용 가능성을 검토하고자 하였다.
- 생약추출물의 T세포에 대한 증식능을 확인하기 위하여 Molt-4 세포를 96 well plate에 1×105 cell/well 농도로 분주 후 양성대조군으로 concanavalin A(Con A) 5 μg/mL와 생약추출물을 12, 25 μg/mL로 각각 처리한 후 96시간 배양하여 MTT assay를 실시하였다(8).
- 생약추출물의 면역 증강 효과를 확인하기 위해서는 생약재로 자극한 대식세포에 의해 TNF-α 외에 더 다양한 종류의 cytokine 분비를 알아보기 위하여 IL-1β, IL-6, IL-10을 측정하여 확인하였다.
- 생약추출물의 세포 독성 여부를 확인하기 위하여 미토콘드리아의 활성을 이용한 MTT assay를 이용하여 세포 독성능을 측정하였고, 결과를 Fig. 1에 나타내었다. 5종의 생약추출물은 12, 25 μg/mL의 농도에서 모두 90% 이상의 세포 생존율을 나타내어 세포 독성에 큰 영향을 주지 않는 것으로 보인다.
- 즉, RAW 264.7 세포를 2×105 cell/well의 농도로 96 well plate에 분주 24시간 후 생약추출물을 12, 25 μg/mL로 처리하고, 양성대조군으로는 1 μg/mL의 lipopolysaccharide(LPS)를 처리하여 24시간 배양하였다.
대상 데이터
- 21582) 세포는 한국세포주은행(KTCC, Seoul)에서 분양받아 사용하였다. RAW 264.7 세포는 10% FBS를 함유한 DMEM 배지를 이용하였고, Molt-4 세포는 10% FBS를 함유한 RPMI 1640 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2로 조절된 incubator에서 배양하였다.
- 본 연구에 사용한 생약재, 즉 가시오가피(Acanthopanax senticosus), 우슬(Achyranthes japonica), 목천료(Actinidia polygama), 당귀(Angelica gigas), 인진쑥(Artemisia capillaris), 천궁(Cnidium officinale), 산약(Disocorea batatas), 감초(Glycyrrhiza glabra), 어성초(Houttuynia cordata), 송엽(Lampranthus spectabilis), 도라지(Platycodon grandiflorum), 지황(Rehmannia glutinosa) 등은 2011년 10월 경동시장에서 구입하였다. Bae 등의 방법(4)에 따라 n-hexane을 이용하여 탈지한 건조분말 생약재 50 g을 1 L의 20 mM tris-HCl buffer(pH 8.
- 본 연구에서 12종류의 생약재 중 대식세포를 활성화시켜 NO 생성능이 높은 감초, 건지황, 당귀, 도라지, 목천료 5종의 생약재를 선별하였다. 선별된 5종의 생약추출물의 성분을 실험한 결과 단백질, 다당 물질의 함유량이 감초(58.
- 실험에 사용한 대식세포주인 RAW 264.7(KTCC No.40071) 세포와 T세포주인 Molt-4(KTCC No.21582) 세포는 한국세포주은행(KTCC, Seoul)에서 분양받아 사용하였다. RAW 264.
데이터처리
- 본 실험에서 측정한 분석결과는 평균±표준편차로 표기하였으며, 실험군간의 통계학적 분석은 analysis of variance(ANOVA) 분석을 실시하였고, Duncan's multiple range test로 p<0.05의 수준에서 통계학적 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- 생약추출물의 RAW 264.7 세포에 대한 독성 측정은 생존 세포의 효소작용에 의해 자줏빛 formazan 생성물로 변하는 MTT 환원을 이용하는 방법(6)으로 측정하였다.
- 총당 함량 분석은 phenol-sulfuric acid법(5)으로 실시하였다. 0.
성능/효과
- 5종의 생약재를 농도별로 대식세포에 처리 시 대조군에 비해 높은 IL-10을 생성하였으며, 특히 목천료(25 μg/mL)의경우 LPS를 단독으로 1 μg/mL으로 처리한 것과 비교할 때 1.7배 높은 IL-10이 생성되었다(Fig. 3D).
- 5종의 생약추출물은 12, 25 μg/mL의 농도에서 모두 90% 이상의 세포 생존율을 나타내어 세포 독성에 큰 영향을 주지 않는 것으로 보인다.
- 5종의 생약추출물은 LPS 수준으로 대식세포를 활성화시켜 TNF-α 생성 증가로 인해 미성숙 수지상세포(dendritic cell)의 표면에 단백질 혹은 보조자극인자(costimulatory molecule)의 발현을 촉진하여 성숙된 형태의 수지상세포로 전환시켜 T림프구와 상호 작용하여 T림프구의 활성과 동시에 T세포의 증식을 유도하는데 도움을 줄 수 있었던 것으로 보인다(2).
- 4에 나타내었다. 5종의 생약추출물은 아무것도 첨가하지 않은 대조군에 비해 세포증식이 최대 1.29배 증가하였다. 이는 Ryu 등(8)의 연구에서 혼합식품 추출물의 증식능을 관찰한 결과 대조군에 비해 증가를 나타내었다는 보고와 Ryu 등(23)의 연구에서 함초추출물을 T세포에 96시간 배양하여증식능을 관찰한 결과 대조군보다 유의적으로 상승하였다는 결과와 일치하였다.
- Bachiega와 Sforcin(21)의 연구에서 lemongrass 추출물을 macrophage에 처리한 결과 낮은 농도인 5, 10 μg/mL에서는 IL-1β의 생성량이 증가하였으나 25, 50, 100 μg/mL의 농도에서는 IL-1β 생성에 영향을 주지 않았다고 보고한 것과는 달리, 본 실험에서는 생약추출물을 처리하였을 때 모든 농도에서 IL-1β가 생성된 것으로 볼 때 5종의 생약재가 농도의존적으로 체내의 면역세포인 대식세포를 활성화시켜 IL-1β의 생성 증가에 영향을 줄 수 있을 것으로 보인다.
- 생약재 5종의 추출 수율, 단백질과 당 함량은 Table 2에 나타내었다. 감초, 건지황, 당귀, 도라지, 목천료의 추출 수율은 각각 1.2, 0.7, 1.2, 1.5, 0.8%로 나타났다. 단백질 함량은 목천료가 65.
- 8%로 나타났다. 단백질 함량은 목천료가 65.6%로 가장 높았고, 당귀(21.5%), 감초(20.2%), 건지황(9.9%), 도라지(0.8%) 순으로 나타났고, 총당 함량은 건지황이 80.5%로 가장 높았고, 당귀(65.9%), 도라지(40.5%), 감초(37.9%), 목천료(20.1%) 순으로 나타났다. 생약재에는 alkaloids, flavonoids 및 terpenoids와 같은 저분자 물질과 다당류, 단백질, tannin 등과 같은 고분자 물질이 다양하게 혼재되어 있는 것으로 볼 때(3), 본 연구의 생약추출물에는 고분자인 단백질과 다당이 대부분을 차지하고 있는 것으로 판단된다.
- 대식세포는 숙주의 방어기구의 일부로서 면역계에 매우 중요한 역할을 수행하여 외부물질 침입을 가장 먼저 인지하여 대식세포가 활성화되면 대식능력의 증강, NO 및 cytokine 생성의 향상을 수반하여 종국적으로 암세포와 각종 유해균의 성장을 억제시킬 수 있는 것으로 여겨진다(3). 따라서 감초, 건지황, 당귀, 도라지, 목천료 5종의 생약추출물은 대식세포를 스스로 활성화시킴으로써 NO 생성을 증가시켜 외부 항원으로부터 자극받지 않아도 체내에서 면역반응이 일어나는 초기에 생체 방어에 유리한 작용을 해서 면역 기능을 높일 것으로 생각된다.
- 9배 높은 IL-6생성량을 보였다고 보고한 바가 있고, Lee 등(22)의 연구에서 국화과 약용식물의 IL-6 생성량이 대조군보다 높았으며, 물 추출물보다는 에탄올추출물에서 더 높은 IL-6가 생성되었다고 보고하였다. 따라서 본 실험에 사용된 5종의 생약재도 다른 약용식물처럼 IL-6의 생성량을 증가시켜 B림프구를 분화시킴으로써 면역반응에 중요한 역할을 할 수 있을 것으로 여겨진다.
- 본 실험에서는 5종의 생약추출물을 농도별로 처리 시 양성 대조군인 LPS를 단독으로 처리한 것보다는 낮았지만, 25 μg/mL의 농도에서 대조군보다 각각 3.2, 3.9, 4.8, 5.3, 7.6배 높게 나타났다 (Fig. 3C).
- 본 연구 결과 5종의 생약재 모두 12 μg/mL의 낮은 농도에서도 대조군에 비해 유의적으로 높은 IL-1β를 생성하였으며, 양성 대조군인 LPS를 처리한 것보다도 높은 IL-1β가 생성되었고, 농도의존적으로 증가하였다(Fig. 3B).
- 본 연구 결과 LPS를 처리한 경우 대조군에 비하여 유의적으로 높은 TNF-α를 생성하였으며, 5종의 생약추출물을 12, 25 μg/mL의 농도로 처리한 경우 농도 의존적으로 TNF-α의 생성이 증가하였으며(Fig. 3A), 특히 목천료의 경우 낮은 농도에서도 양성대조군인 LPS를 처리한 것과 비슷한 수준으로 생성하였다.
- 본 연구에서는 5종의 생약재를 12, 25μg/mL의 농도로 대식세포에 처리 시 농도 증가에 따라 NO 생성이 증가되었으며, 특히 25 μg/mL 농도의 경우 대식세포에서 NO 생성을 유도하는 물질인 LPS를 1 μg/mL 처리하였을 때 생성된 NO 함량과 비슷한 수준으로 생성되었다(Fig. 2).
- 1%) 순으로 나타났다. 생약재에는 alkaloids, flavonoids 및 terpenoids와 같은 저분자 물질과 다당류, 단백질, tannin 등과 같은 고분자 물질이 다양하게 혼재되어 있는 것으로 볼 때(3), 본 연구의 생약추출물에는 고분자인 단백질과 다당이 대부분을 차지하고 있는 것으로 판단된다. Aranha 등(11)의 연구에서 guduchi 줄기에서 추출한 단백질을 대식세포에 처리 시 NO가 대조군에 비해 유의적으로 증가하였다고 보고하였고, Yu 등(12)의 연구에서는 영지버섯에서 추출한 다당을 RAW 264.
- 생약추출물이 대식세포를 활성화시켜 면역을 증진시키는 효과를 알아보기 위해 RAW 264.7세포와 T세포를 이용하여 면역활성능 관련 지표를 측정한 결과 5종의 생약재를 RAW 264.7 세포에 처리하였을 때 면역 활성의 지표가 되는 NO, cytokine(TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10)의 생성이 추출물을 처리하지 않은 대조군에 비해 증가되었고, Molt-4 세포에 처리하였을 때 대조군에 비해 세포가 증식되었다.
- 본 연구에서 12종류의 생약재 중 대식세포를 활성화시켜 NO 생성능이 높은 감초, 건지황, 당귀, 도라지, 목천료 5종의 생약재를 선별하였다. 선별된 5종의 생약추출물의 성분을 실험한 결과 단백질, 다당 물질의 함유량이 감초(58.1%), 건지황(90.4%), 당귀(87.4%), 도라지(41.3%), 목천료(85.7%)로 대부분 고분자 물질이 함유되어 있는 것으로 나타났다. 생약추출물이 대식세포를 활성화시켜 면역을 증진시키는 효과를 알아보기 위해 RAW 264.
- 8배 이상 증가하였다고 보고하였다. 이와 같이 단백질과 당은 단일로 존재하거나 서로 결합된 형태일 때 모두 대식세포를 자극하여 cytokine 생성을 증가시켜 면역 증강에 효과가 있다는 결과와 같이, 본 연구에서도 5종의 생약추출물은 고분자 물질인 당과 단백질의 함량이 건지황, 당귀, 목천료의 경우 85% 이상, 감초, 도라지의 경우 41% 이상 함유되어 있어 대식세포를 활성화시켜 면역 증강에 영향을 줄 것으로 생각된다.
후속연구
- 이는 Ryu 등(8)의 연구에서 혼합식품 추출물의 증식능을 관찰한 결과 대조군에 비해 증가를 나타내었다는 보고와 Ryu 등(23)의 연구에서 함초추출물을 T세포에 96시간 배양하여증식능을 관찰한 결과 대조군보다 유의적으로 상승하였다는 결과와 일치하였다. 따라서 생약추출물이 면역세포인 T 세포의 활성을 촉진시켜 체내 면역능을 증진시킬 가능성이 있을 것으로 사료된다.
- 7 세포에 처리하였을 때 면역 활성의 지표가 되는 NO, cytokine(TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10)의 생성이 추출물을 처리하지 않은 대조군에 비해 증가되었고, Molt-4 세포에 처리하였을 때 대조군에 비해 세포가 증식되었다. 이와 같은 결과는 고분자 물질인 단백질과 다당으로 이루어진 생약추출물을 섭취 시 외부로부터 침입한 항원이 들어오기 이전에 면역세포를 자극하여 활성을 증가시켜 면역매개물질을 생성하여 인체의 비특이적 면역반응을 증가시킴으로써 항원을 공격, 제거하는 등의 작용을 통해 자연 면역반응에 있어 중요한 역할을 할 수 있을 것으로 보인다.
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