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문제 정의
- 본 연구팀은 감도 및 정확성, 정밀성이 뛰어난 LC-MS/MS를 이용하여 인체 혈장에서 ginsenoside Rb1의 최저정량 한계 설정 및 빠른 분석 시간, 간단한 전처리 방법을 개발함으로써 이 분석법이 시험목적에 적합함을 과학적으로 입증하고자 하였다.
제안 방법
- Ginsenoside Rb1 특이성 검증으로는 표준용액과 같은 방법으로 인체혈장에서 전처리한 ginsenoside Rb1을 LC-MS/MS로 분석한 후 두 개의 크로마토그램을 비교하여 피크가 간섭물질의 방해 없이 같은 시간대에 분리되어 나오는지 확인하였고, 6개의 기원이 혈장 공시료(여섯 사람에서 채취한 생체시료)를 이용하여 최저정량한계에서 간섭시험을 수행하였다. 10, 20, 40, 80, 100, 200, 400, 500 ng/mL의 ginsenoside Rb1 검량선용 용액을 LCMS/MS로 분석하여 피크의 면적에 대한 농도비 관계를 나타내는 검량선을 작성하여 직선성을 확인하였으며, 검출한계는 검출 중의 불순물 또는 분석물질을 정확한 값으로 정량화할 필요가 없는 최소의 양을 확인하여 신호 대 잡음(S/N, signal-to-noise) 비율 값이 3 이상으로 증명하였다. 또한 정량한계는 적절한 정확도와 정밀도로 검체 중의 불순물 또는 분석물질을 정량적으로 분석할 수 있는 최소의 양으로써 정확도, 정밀도, 특이성, 직선성 시험의 표준곡선으로 얻은 결과를 계산하여 추정하고 검출한계 부근의 3배 농도 이상에서 증명하였다.
- 인체 혈장에 ginsenoside Rb1의 표준원액을 spiking하여 만든 ginsenoside Rb1의 직선성(linearity), 정밀성(intermediate precision), 정확성(accuracy), 특이성(specificity), 검출한계(limit of detection, LOD), 정량한계(limit of quantification, LOQ), 회수율(recovery)을 측정하여 ginsenoside Rb1의 분석법을 검증하였다. Ginsenoside Rb1 특이성 검증으로는 표준용액과 같은 방법으로 인체혈장에서 전처리한 ginsenoside Rb1을 LC-MS/MS로 분석한 후 두 개의 크로마토그램을 비교하여 피크가 간섭물질의 방해 없이 같은 시간대에 분리되어 나오는지 확인하였고, 6개의 기원이 혈장 공시료(여섯 사람에서 채취한 생체시료)를 이용하여 최저정량한계에서 간섭시험을 수행하였다. 10, 20, 40, 80, 100, 200, 400, 500 ng/mL의 ginsenoside Rb1 검량선용 용액을 LCMS/MS로 분석하여 피크의 면적에 대한 농도비 관계를 나타내는 검량선을 작성하여 직선성을 확인하였으며, 검출한계는 검출 중의 불순물 또는 분석물질을 정확한 값으로 정량화할 필요가 없는 최소의 양을 확인하여 신호 대 잡음(S/N, signal-to-noise) 비율 값이 3 이상으로 증명하였다.
- Ginsenoside Rb1 표준품 10 mg을 정확히 측정하여 메탄올 10 mL에 용해시킨 후 최종 농도 10 μg/mL로 만들어 표준 원액을 제조한 후 100, 200, 400, 800, 1,000, 2,000, 4,000, 5,000 ng/mL의 농도가 되도록 표준 검량선용 용액을 만들었다.
- LC-MS/MS를 사용함으로써 인체 혈장에서 ginsenoside Rb1의 분석법을 개발하고 검증하였다. 유속 0.
- 진공농축 후 잔사액에 water : methanol(50:50) 용액 100 μL를 넣고 digoxin(1μg/mL)을 100 μL씩 더하여 넣은 후 2분 동안 혼합한다. LCMS/MS vial에 옮겨 분석하였으며 10, 20, 200, 400 ng/mL 농도의 QC(quality control) 시료 또한 혈장시료를 이용하여 상기의 검체 처리방법으로 처리하여 분석하였다. 표준 검량 선용 용액의 LC-MS/MS 분석 결과에서 얻은 내부표준물질인 digoxin의 피크 면적에 대한 ginsenoside Rb1의 피크 면적비를 구하여 검량선을 작성하였다.
- 회수율은 분석과정의 추출효율로서 기지량의 분석물질에 대해 해당시험법의 시료추출과 처리 과정을 모두 거친 후 얻은 분석치의 기지량에 대한 퍼센트(%)로써 나타내었다. 본 연구는 ginsenoside Rb1의 직선성, 정밀성, 정확성, 특이성, 검출한계, 정량한계, 재현성을 검증하기 위해 일내(intra-day)와 일간(inter-day) 분석으로 나누어 실험을 실시하였으며 일내분석은 1일 5회의 실험을 진행하여 분석법 검증을 실시하였으며, 일간분석은 1일 1회의 실험을 5일 동안 진행하여 직선성, 정밀성, 정확성 등을 확인하였고, QC 시료 또한 일내분석은 1일 5회의 실험을 진행하였으며 일간분석은 1일 2회의 실험을 진행하여 ginsenoside Rb1의 분석법을 검증하였다.
- 유속 0.9 mL/min에 이동상 0.1% formic acid가 첨가된 water와 methanol을 사용하여 기울기 용리 조건으로 설정하였으며 사용한 분석 칼럼은 C 18(4.6 mm×150 mm, particle size 5 μm)을 사용하여 분리하였다.
- 이동상으로는 0.1% formic acid가 첨가되어 있는 water(A)와 methanol(B)을 사용하여 0분: 50%(A), 50%(B), 1분: 0%(A), 100%(B), 4.6분: 0%(A), 100%(B), 6.5분: 50%(A), 50%(B) 기울기 용리 조건으로 설정하여 분석하였고 사용한 분석 칼럼은 C18(Agilent® 4.6 mm×150 mm, particle size 5 μm)이었으며, 0.9 mL/min의 유속으로 시료 10 μL를 주입하여 분석하였다.
- 인체 혈장에 ginsenoside Rb1의 표준원액을 spiking하여 만든 ginsenoside Rb1의 직선성(linearity), 정밀성(intermediate precision), 정확성(accuracy), 특이성(specificity), 검출한계(limit of detection, LOD), 정량한계(limit of quantification, LOQ), 회수율(recovery)을 측정하여 ginsenoside Rb1의 분석법을 검증하였다. Ginsenoside Rb1 특이성 검증으로는 표준용액과 같은 방법으로 인체혈장에서 전처리한 ginsenoside Rb1을 LC-MS/MS로 분석한 후 두 개의 크로마토그램을 비교하여 피크가 간섭물질의 방해 없이 같은 시간대에 분리되어 나오는지 확인하였고, 6개의 기원이 혈장 공시료(여섯 사람에서 채취한 생체시료)를 이용하여 최저정량한계에서 간섭시험을 수행하였다.
- LC-MS/MS 의 분석조건은 Table 1과 같다. 정량은 상기 검량선 작성을 위한 시료 전처리를 통하여 얻어진 LC chromatogram으로 부터 내부표준물질의 피크 면적에 대한 ginsenoside Rb1의 피크 면적비를 구하여 미리 작성된 검량선에 의해 혈장 시료 중 ginsenoside Rb1의 농도를 산출하였다.
- LCMS/MS vial에 옮겨 분석하였으며 10, 20, 200, 400 ng/mL 농도의 QC(quality control) 시료 또한 혈장시료를 이용하여 상기의 검체 처리방법으로 처리하여 분석하였다. 표준 검량 선용 용액의 LC-MS/MS 분석 결과에서 얻은 내부표준물질인 digoxin의 피크 면적에 대한 ginsenoside Rb1의 피크 면적비를 구하여 검량선을 작성하였다.
대상 데이터
- Ginsenoside Rb1의 분석을 위해 사용한 분석기기로는 Agilent HPLC 1200 series(Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA), API4000 LC-MS/MS(AB SCIEX, Foster City, CA, USA)를 사용하였다. 인체 혈장 내에서 ginsenoside Rb1의 분석을 위하여 전기분무이온화법[electrospray ionization(ESI) mode]을 이용하였으며, 질량분석기의 세부 조건은 curtain gas 20, nebulizing gas 50, turbo gas 50, source 온도는 450℃, CAD gas는 10, entrance potential 10 V, MRM(multiple reaction monitoring) ion transfer(m/z) 및 collision energy(CE)는 각각 77 V, 15 V였다.
- 1). 또한 ginsenoside Rb1 분석 시 사용한 이동상의 물질인 formic acid는 Sigma에서 구입하였고 water와 methanol은 Fisher Scientific Korea(Seoul, Korea) 제품으로 HPLC등급을 사용하였으며 전처리 과정 중에 사용된 acetone은(purity 98%) Wako Pure Chemical(Osaka, Japan)에서 구입하였다.
- 이 연구에서 사용된 표준물질인 ginsenoside Rb1은 앰보 연구소(purity 98%, Seoul, Korea)에서 구입하였고 내부표준물질로 사용한 digoxin은 Sigma(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다(Fig. 1). 또한 ginsenoside Rb1 분석 시 사용한 이동상의 물질인 formic acid는 Sigma에서 구입하였고 water와 methanol은 Fisher Scientific Korea(Seoul, Korea) 제품으로 HPLC등급을 사용하였으며 전처리 과정 중에 사용된 acetone은(purity 98%) Wako Pure Chemical(Osaka, Japan)에서 구입하였다.
이론/모형
- 6 mm×150 mm, particle size 5 μm)을 사용하여 분리하였다. MRM(multiple reaction monitoring) 방법의 전기 분무 이온화 이온 분석기로 모니터링 하여 분석하였다. 인체 혈장 샘플은 액체-액체 추출방법에 의해 acetone과 water가 섞인 용액으로 추출하였다.
- Ginsenoside Rb1의 분석을 위해 사용한 분석기기로는 Agilent HPLC 1200 series(Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA), API4000 LC-MS/MS(AB SCIEX, Foster City, CA, USA)를 사용하였다. 인체 혈장 내에서 ginsenoside Rb1의 분석을 위하여 전기분무이온화법[electrospray ionization(ESI) mode]을 이용하였으며, 질량분석기의 세부 조건은 curtain gas 20, nebulizing gas 50, turbo gas 50, source 온도는 450℃, CAD gas는 10, entrance potential 10 V, MRM(multiple reaction monitoring) ion transfer(m/z) 및 collision energy(CE)는 각각 77 V, 15 V였다. 또한, ginsenoside Rb1, digoxin 각각의 precursor molecular ion의 m/z는 1131.
- MRM(multiple reaction monitoring) 방법의 전기 분무 이온화 이온 분석기로 모니터링 하여 분석하였다. 인체 혈장 샘플은 액체-액체 추출방법에 의해 acetone과 water가 섞인 용액으로 추출하였다. 이 분석의 검량선 범위는 10～500 ng/mL이며 상관계수는 0.
성능/효과
- 0%로 분석오차가 10% 이내인 것을 확인할 수 있었다. QC시료의 일내, 일간 분석결과는 Table 4, 5와 같으며 정확성은 일내 94.7～112.2%, 일간 93.8～108.8%, 변동계수는 일내 3.5～7.5%, 일간 5.3～8.6%로 나타났고, 상대오차는 일내 -3.5～12.2%, 일간 -6.2～8.8%, 마지막으로 회수율은 일내 94.8～112.2%, 일간 93.8～108.8 범위의 적합한 결과를 나타내었으며, 혈중 ginsenoside Rb1에 대한 LC-MS/MS 분석법이 충분한 감도, 특이성, 직선성, 정확성, 정밀성을 갖고 있음을 확인함으로써 인체에 미량으로 분석되는 ginsenoside Rb1의 안전성에 대해 과학적이고 신뢰할 수 있는 분석법을 설정하였다.
- 51분으로 ginsenoside Rb1 표준용액의 피크 머무름 시간과 인체혈장에서의 ginsenoside Rb1 피크 머무름 시간이 일치하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 6개의 기원이 다른 혈장을 이용하여 각공시료에 대한 간섭시험을 수행하였을 때 각각 다른 물질의 간섭 없이 분리됨을 확인하였다.
- 9988 값의 유의수준으로 측정되었다. 또한 상대오차(RE, relative error)는 일내-3～4.5%, 일간 -3.1～4.0%로 나타났으며, 회수율 또한 일내 97.0～104.5%, 일간 96.9～104.0%로 분석오차가 10% 이내인 것을 확인할 수 있었다. QC시료의 일내, 일간 분석결과는 Table 4, 5와 같으며 정확성은 일내 94.
- 10, 20, 40, 80, 100, 200, 400, 500 ng/mL의 ginsenoside Rb1 검량선용 용액을 LCMS/MS로 분석하여 피크의 면적에 대한 농도비 관계를 나타내는 검량선을 작성하여 직선성을 확인하였으며, 검출한계는 검출 중의 불순물 또는 분석물질을 정확한 값으로 정량화할 필요가 없는 최소의 양을 확인하여 신호 대 잡음(S/N, signal-to-noise) 비율 값이 3 이상으로 증명하였다. 또한 정량한계는 적절한 정확도와 정밀도로 검체 중의 불순물 또는 분석물질을 정량적으로 분석할 수 있는 최소의 양으로써 정확도, 정밀도, 특이성, 직선성 시험의 표준곡선으로 얻은 결과를 계산하여 추정하고 검출한계 부근의 3배 농도 이상에서 증명하였다. 또한 정밀성, 정확성 및 회수율의 검증방법으로 정밀성은 설정된 조건 하에서 균질화된 동일 시료로부터 수차례 시료를 채취하여 얻은 분석 결과치 사이의 일치(분산) 정도로써 나타내었으며, 정확성은 설정된 조건 하에서 실측된 값이 이론값, 즉 이미 알고 있는 참값에 근접한 정도로써 표현하였다.
- 또한 정량한계는 적절한 정확도와 정밀도로 검체 중의 불순물 또는 분석물질을 정량적으로 분석할 수 있는 최소의 양으로써 정확도, 정밀도, 특이성, 직선성 시험의 표준곡선으로 얻은 결과를 계산하여 추정하고 검출한계 부근의 3배 농도 이상에서 증명하였다. 또한 정밀성, 정확성 및 회수율의 검증방법으로 정밀성은 설정된 조건 하에서 균질화된 동일 시료로부터 수차례 시료를 채취하여 얻은 분석 결과치 사이의 일치(분산) 정도로써 나타내었으며, 정확성은 설정된 조건 하에서 실측된 값이 이론값, 즉 이미 알고 있는 참값에 근접한 정도로써 표현하였다. 회수율은 분석과정의 추출효율로서 기지량의 분석물질에 대해 해당시험법의 시료추출과 처리 과정을 모두 거친 후 얻은 분석치의 기지량에 대한 퍼센트(%)로써 나타내었다.
- 9995를 나타냈다. 일내, 일간의 정밀성 농도범위는 상관계수 5.8% 그리고 정확성은 96.0～104.6%로 나타났다. 이 LC-MS/MS를 이용한 인체 혈장의 ginsenoside Rb1의 연구가 약동학 연구에 적용할 수 있을 거라 생각한다.
-
정확성, 정밀성 검토 및 회수율 측정
정확성은 검량선에 의하여 정량한 농도의 평균값을 기지의 농도로 나눈 비의 백분율(%)로서 구하였고, 정밀성은 설정된 조건 하에서 균질화된 동일 시료로부터 수차례 시료를 채취하여 얻은 분석 결과치 사이의 일치정도를 의미하였을 때의 값을 구하였으며, 정량한계는 크로마토그램 상에서 신호 대 잡음비(S/N)를 10 이상으로 하였고, 판정기준은 변동 계수(CV, coefficient variation)가 10% 이하를 만족하는 지와 정확성(accuracy, %)이 85～115%일 때 만족하는 것으로 판단하였을 때 ginsenoside Rb1의 일내, 일간 실험의 결과는 Table 2, 3과 같이 일내의 정확성이 97.1～104.6%, 일간의 정확성이 97.0～103.7%로 나타났고 변동계수는 일내 1.1～5.4%, 일간 2.9～5.8%로 나타났다. 그리고 Table 2와 3과 같이 상관계수(R)는 일내 0.
- 특이성은 존재할 지도 모르는 구성성분(대사체, 불순물, 분해산물 혹은 생체시료 구성성분)의 존재 하에 분석물질을 측정하고 구별해내는 생체시료 분석법으로 확인할 수 있다. 표준 용액과 인체혈장에서 시료를 전처리한 후 ginsenoside Rb1의 크로마토그램을 비교하여 ginsenoside Rb1 피크가 분리되는 지를 확인한 결과, Fig. 2와 같이 표준용액의 분석 시간은 3.52분, 인체혈장에서의 분석시간은 3.51분으로 ginsenoside Rb1 표준용액의 피크 머무름 시간과 인체혈장에서의 ginsenoside Rb1 피크 머무름 시간이 일치하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 6개의 기원이 다른 혈장을 이용하여 각공시료에 대한 간섭시험을 수행하였을 때 각각 다른 물질의 간섭 없이 분리됨을 확인하였다.
후속연구
- 최근에 고감도 장비인 LC-MS/MS(liquid chromatography mass spectrometry, 액체 크로마토그래피 질량분석기)를 이용한 생체시료 분석법이 개발되면서 인삼성분에 대한 분석법도 적용할 수 있게 되었다. 본 분석법뿐만 아니라 앞으로 다른 ginsenoside들의 생체시료 내 분석법이 확립된다면 전반적인 인삼의 체내 약동학적 특성들에 대해서도 연구할 수 있는 계기가 될 것이다.
- 6%로 나타났다. 이 LC-MS/MS를 이용한 인체 혈장의 ginsenoside Rb1의 연구가 약동학 연구에 적용할 수 있을 거라 생각한다.
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