LC-MS/MS를 이용하여 인체 혈장 중 ginsenoside Rg1의 신속하고 정확한 분석법을 개발하고 이 분석법에 대한 검증을 수행하였다. 혈장 분석을 위하여 internal standard인 digoxin을 첨가한 후 acetone과 methanol용액 (80:20)으로 전처리하고, 그 상층액을 진공농축 한 후, LC-MS/MS로 분석하였다. 최적 크로마토그래피 분석은 0.1% formic acid 첨가된 water와 methanol을 이동상으로 하여 Agilent Eclipse XDB-C18 column ($4.6{\times}150mm$, $5{\mu}m$)을 이용하여 0.9 mL/min의 유속으로 gradient mode로 수행하였다. 혈장 중 ginsenoside Rg1의 표준 검량선은 1~500 ng/mL의 농도 범위에서 우수한 직선성($r^2=0.9995$)을 보였으며, 일내, 일간 정밀성은 변동계수 7.53% 이하, 정확성은 98.28% 이상이었다. 결과적으로 본 분석법은 ginsenoside Rg1의 약동학 연구에 적용되기에 충분한 감도와 특이성, 직선성, 정밀성 및 정확성을 가지고 있음을 확인하였다.
LC-MS/MS를 이용하여 인체 혈장 중 ginsenoside Rg1의 신속하고 정확한 분석법을 개발하고 이 분석법에 대한 검증을 수행하였다. 혈장 분석을 위하여 internal standard인 digoxin을 첨가한 후 acetone과 methanol용액 (80:20)으로 전처리하고, 그 상층액을 진공농축 한 후, LC-MS/MS로 분석하였다. 최적 크로마토그래피 분석은 0.1% formic acid 첨가된 water와 methanol을 이동상으로 하여 Agilent Eclipse XDB-C18 column ($4.6{\times}150mm$, $5{\mu}m$)을 이용하여 0.9 mL/min의 유속으로 gradient mode로 수행하였다. 혈장 중 ginsenoside Rg1의 표준 검량선은 1~500 ng/mL의 농도 범위에서 우수한 직선성($r^2=0.9995$)을 보였으며, 일내, 일간 정밀성은 변동계수 7.53% 이하, 정확성은 98.28% 이상이었다. 결과적으로 본 분석법은 ginsenoside Rg1의 약동학 연구에 적용되기에 충분한 감도와 특이성, 직선성, 정밀성 및 정확성을 가지고 있음을 확인하였다.
A sensitive and selective liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) was developed for the investigation of the ginsenoside Rg1 in human plasma. After addition of internal standard (digoxin), plasma was diluted with acetone and methanol (80:20), the supernatant was concentrated and an...
A sensitive and selective liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) was developed for the investigation of the ginsenoside Rg1 in human plasma. After addition of internal standard (digoxin), plasma was diluted with acetone and methanol (80:20), the supernatant was concentrated and analyzed by LC-MS/MS. The optimal chromatographic separation was achieved on an Agilent Eclipse XDB-C18 column ($4.6{\times}150mm$, $5{\mu}m$) with a mobile phase of 0.1% formic acid in water and 0.1% formic acid in methanol at a flow rate of 0.9 mL/min gradient mode. The standard calibration curve for ginsenoside Rg1 was linear ($r^2=0.9995$) over the concentration range 1~500 ng/mL in human plasma. The intra- and inter-day precision over the concentration range of ginsenoside Rg1 was lower than 7.53% (correlation of variance, CV), and accuracy exceeded 98.28%. This LC-MS/MS assay of ginsenoside Rg1 in human plasma is applicable for quantifying in the pharmacokinetic study.
A sensitive and selective liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) was developed for the investigation of the ginsenoside Rg1 in human plasma. After addition of internal standard (digoxin), plasma was diluted with acetone and methanol (80:20), the supernatant was concentrated and analyzed by LC-MS/MS. The optimal chromatographic separation was achieved on an Agilent Eclipse XDB-C18 column ($4.6{\times}150mm$, $5{\mu}m$) with a mobile phase of 0.1% formic acid in water and 0.1% formic acid in methanol at a flow rate of 0.9 mL/min gradient mode. The standard calibration curve for ginsenoside Rg1 was linear ($r^2=0.9995$) over the concentration range 1~500 ng/mL in human plasma. The intra- and inter-day precision over the concentration range of ginsenoside Rg1 was lower than 7.53% (correlation of variance, CV), and accuracy exceeded 98.28%. This LC-MS/MS assay of ginsenoside Rg1 in human plasma is applicable for quantifying in the pharmacokinetic study.
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문제 정의
따라서, 본 연구팀은 LC-MS/MS를 이용하여 인체 혈장에서 ginsenoside Rg1의 빠르고 정확한 분석법을 개발하고, 개발된 분석법의 유효성을 밸리데이션 과정을 통하여 과학적으로 검증하고자 하였다.
본 연구에서는 인삼에 비교적 높은 함량으로 존재하고, 제품의 기준 규격 설정 시 지표성분으로 활용되는 ginsenoside Rg1에 대한 혈중 농도 분석법을 개발하고자 하였다. 혈중 농도 분석에 있어 Sun 등21은 고체상 추출법(solid phase extraction, SPE)으로 전처리 하여 LC-MS를 이용한 rat의 혈장에서 ginsenoside Rg1 분석법을 제시하였고, Song 등22은 dog에서의 분석법을 제시하였다.
제안 방법
진공농축 후 잔 사액에 50% methanol 100 µL를 더하여 넣은 후 1분간 혼합한 후, 4℃ C, 15,000 g에서 10분 동안 원심분리하였다. LC-MS/MS vial에 옮겨 분석하였으며 2, 200, 400 ng/mL 농도의 품질관리(quality control, QC) 시료 또한 혈장시료를 이용하여 상기의 검체 처리방법으로 처리하여 분석하였다. 표준 검량선용 용액의 LC-MS/MS 분석 결과에서 얻은 internal standard인 digoxin의 peak 면적에 대한 ginsenoside Rg1의 peak 면적비를 구하여 검량선을 작성하였다.
이로부터 혈중 ginsenoside Rg1에 대한 상기 LC-MS/MS 분석법은 인체에 대한 생체이용률시험 및 약물상호작용 연구 등 약동학적 특성을 평가하는 임상연구에 이용될 수 있는 충분한 감도, 특이성, 직선성, 정확성 및 정밀성을 갖고 있음을 알 수 있었다. 본 연구팀은 추가적으로 임상시험에서 인삼제품을 복용한 후 혈중 ginsenoside Rg1 분석시에 다른 ginsenoside peak의 방해를 받지 않고 분리가 잘 되는지 확인시험을 실시하였다. 공혈장에 ginsenoside Rg1, ginsenoside Rb1, ginsenoside Rc, ginsenoside Rh2, 그리고 compound K 표준품을 spiking하여 각각 500 ng/ mL로 조제하여 internal standard와 분석하였고, 6개의 ginsenoside 표준품을 혼합하여 동시분석하였다.
분석법 검증을 위한 특이성 시험으로서 6개의 다른 기원의 공혈장을 준비하여 각 시료에 정량한계(limit of quantitation, LOQ)농도의 ginsenoside Rg1을 spiking하 여 분석 시 다른 물질들에 의한 간섭이 없는지 확인하였다. 직선성 실험을 위해서는 얻어진 크로마토그램으로부터 internal standard의 peak 면적에 대한 ginsenoside Rg1의 peak 면적비를 구하고, 검량선은 선형회귀 방법으로 구하였으며 가중치는 1/x을 이용하였다.
대상 데이터
1). 공혈장은 헌혈에 의한 전혈 채혈 후 8시간 이내에 냉장 원심분리기(1차, 2700 rpm, 2차, 4000 rpm)를 사용하여 분리된 혈장으로 급속동결하여 -20 ℃ 이하에 보관된 것으로 대한적십자사 전북혈액원을 통하여 공급받아 사용하였다. 이동상으로 사용한 acetone 은 Wako pure chemical (Osaka, Japan) 제품을 사용하였고, methanol은 Fisher Scientific Co.
또한, HPLC 등급의 water 와 acetonitrile도 Fisher 제품을 사용하였다. 약물분석 기기로는 Agilent HPLC 1200 series (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA), API4000 LC-MS/MS (AB SCIEX, Foster City, CA, USA)와 원심분리기 (MICRO 17TR, Hanil Science Industrial Co, Korea) 등을 사용하였다.
데이터처리
분석법 검증을 위한 특이성 시험으로서 6개의 다른 기원의 공혈장을 준비하여 각 시료에 정량한계(limit of quantitation, LOQ)농도의 ginsenoside Rg1을 spiking하 여 분석 시 다른 물질들에 의한 간섭이 없는지 확인하였다. 직선성 실험을 위해서는 얻어진 크로마토그램으로부터 internal standard의 peak 면적에 대한 ginsenoside Rg1의 peak 면적비를 구하고, 검량선은 선형회귀 방법으로 구하였으며 가중치는 1/x을 이용하였다. QC시료로는 2, 200, 400 ng/mL 농도의 혈장 표준시료를 이용하여 상기의 검체 처리방법으로 처리하여 분석하였다(n=5).
이론/모형
건강한 성인의 공혈장에 internal standard만 spiking 한 것과 ginsenoside Rg1을 함께 spiking한 것에 대해 본 시험 방법에 따라 LC-MS/MS로 분석하였다. Fig.
혈장 중 ginsenoside Rg1 정량을 위하여 질량분석기의 전기분무이온화법 (electrospray ionization (ESI) mode)을 사용하였으며, 50 V의 collision energy (CE) 로 분석하였다. Ginsenoside Rg1의 precursor molecular ion과 product ion의 m/z는 각각 823.
성능/효과
이 분석법은 이미 보고된 분석법에 비교하여 시료 전처리가 간단하고, 낮은 정량한계를 가지며, 생체시료 분석법으로서의 양호한 특이성, 직선성, 정확성 및 정밀성을 나타내었다. 따라서 LC-MS/MS 분석법을 이용한 인체 혈장 내의 ginsenoside Rg1을 정량한 본 시험법은 적합한 시험법임을 검증하였다. 향후 본 연구에서 정립한 ginsenoside Rg1의 생체시료분석법을 약동학 연구에 연구에 적용할 수 있을 것으로 예상되고, 본 분석법은 추후 다른 protopanaxatriol 그룹의 ginsenoside들의 생체시료 내 분석법 확립과 더불어 인삼의 체내 약동학적 메카니즘에 대해 규명에 기반이 될 것이다.
999로 1-500 ng/mL 범위에서 양호한 직선성을 나타내었고 LOQ는 1 ng/mL이었다. 분석법을 검증한 결과 일내 재현성과 일간 재현성의 평균 정밀성과 정확성이 모두 기준값 이내에 들어 이 분석법은 충분한 감도와 정확성 및 정밀성이 있었다. 이 분석법은 이미 보고된 분석법에 비교하여 시료 전처리가 간단하고, 낮은 정량한계를 가지며, 생체시료 분석법으로서의 양호한 특이성, 직선성, 정확성 및 정밀성을 나타내었다.
분석법을 검증한 결과 일내 재현성과 일간 재현성의 평균 정밀성과 정확성이 모두 기준값 이내에 들어 이 분석법은 충분한 감도와 정확성 및 정밀성이 있었다. 이 분석법은 이미 보고된 분석법에 비교하여 시료 전처리가 간단하고, 낮은 정량한계를 가지며, 생체시료 분석법으로서의 양호한 특이성, 직선성, 정확성 및 정밀성을 나타내었다. 따라서 LC-MS/MS 분석법을 이용한 인체 혈장 내의 ginsenoside Rg1을 정량한 본 시험법은 적합한 시험법임을 검증하였다.
이때 본 분석방법의 정밀성은 일내, 일간 모두 10% 이하, LOQ에서의 정밀성은 20% 이하였고, LOQ는 1 ng/mL이었다. 이로부터 혈중 ginsenoside Rg1에 대한 상기 LC-MS/MS 분석법은 인체에 대한 생체이용률시험 및 약물상호작용 연구 등 약동학적 특성을 평가하는 임상연구에 이용될 수 있는 충분한 감도, 특이성, 직선성, 정확성 및 정밀성을 갖고 있음을 알 수 있었다. 본 연구팀은 추가적으로 임상시험에서 인삼제품을 복용한 후 혈중 ginsenoside Rg1 분석시에 다른 ginsenoside peak의 방해를 받지 않고 분리가 잘 되는지 확인시험을 실시하였다.
혈장시료를 전처리하여 LC-MS/MS 크로마토그램으로 분석한 결과 혈장성분 내부에 있는 여러 가지 간섭물질의 방해 없이 ginsenoside Rg1 및 internal standard가 분리되었다. 혈장시료로부터 구한 ginsenoside Rg1의 검량선은 r2 ≥ 0.999로 1-500 ng/mL 범위에서 양호한 직선성을 나타내었고 LOQ는 1 ng/mL이었다. 분석법을 검증한 결과 일내 재현성과 일간 재현성의 평균 정밀성과 정확성이 모두 기준값 이내에 들어 이 분석법은 충분한 감도와 정확성 및 정밀성이 있었다.
Ginsenoside Rg1의 인체 혈장 중의 LC-MS/MS 분석법을 설정하고 이 분석법의 유효성을 검증하는 실험을 하여 다음과 같은 결론을 얻었다. 혈장시료를 전처리하여 LC-MS/MS 크로마토그램으로 분석한 결과 혈장성분 내부에 있는 여러 가지 간섭물질의 방해 없이 ginsenoside Rg1 및 internal standard가 분리되었다. 혈장시료로부터 구한 ginsenoside Rg1의 검량선은 r2 ≥ 0.
후속연구
23 따라서 본 분석법은 기존의 분석법보다 간단하고, 빠르고 정확하게 ginsenoside Rg1을 정량할 수 있는 분석법이다. 본 연구를 바탕으로 다른 ginsenoside들의 동시분석법이 확립된다면 인삼제품 섭취 후 혈중 ginsenoside 농도 측정을 통해 metabolic pathway 연구에 많은 정보를 줄 수 있을 것으로 기대된다.
따라서 LC-MS/MS 분석법을 이용한 인체 혈장 내의 ginsenoside Rg1을 정량한 본 시험법은 적합한 시험법임을 검증하였다. 향후 본 연구에서 정립한 ginsenoside Rg1의 생체시료분석법을 약동학 연구에 연구에 적용할 수 있을 것으로 예상되고, 본 분석법은 추후 다른 protopanaxatriol 그룹의 ginsenoside들의 생체시료 내 분석법 확립과 더불어 인삼의 체내 약동학적 메카니즘에 대해 규명에 기반이 될 것이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
인삼의 가장 중요한 활성성분은 무엇인가?
LC-MS/MS를 이용하여 인체 혈장 중 ginsenoside Rg1의 신속하고 정확한 분석법을 개발하고 이 분석법에 대한 검증을 수행하였다. 혈장 분석을 위하여 internal standard인 digoxin을 첨가한 후 acetone과 methanol용액 (80:20)으로 전처리하고, 그 상층액을 진공농축 한 후, LC-MS/MS로 분석하였다.
인삼의 학술적인 분류는?
A. Meyer)은 오갈피나무과 (Araliaceae)에 속하는 다년생 초본이다. 인삼은 약 2,000년 동안 한국, 중국, 일본과 같은 동아시아지역에서 전통의약품으로 사용되어왔고 최근에는 전세계적으로 주목 받고 있다.
Ginsenoside의 약리적인 효능은?
현재까지 자연상태나 가공상태의 고려인삼에서 분리된 ginsenoside는 31종류 이상이고, 새로운 ginsenoside에 대해서는 계속 연구되고 있다. 2 이러한 ginsenoside의 약리적 활성으로는 항암효과, 3 항당뇨효과, 4 중추신경계 질환 의 예방, 5 항고혈압효과, 6-7 항피로와 항스트레스, 8-9 항염증효과10 등이 있다. Ginsenoside는 배당체의 화학구 조에 따라 protopanaxadiol그룹, protopanaxatriol그룹 및 oleanane그룹으로 분류한다.
참고문헌 (25)
J. T. Baker, R. P. Borris, B. Carte, G. A. Cordell, D. D. Soejarto, G. M. Cragg, M. P. Gupta, M. M. Iwu, D. R. Madulid and V. E. Tyler, J. Nat. Prod., 58(9), 1325-1357 (1995).
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