The importance of biological resources has been gradually increasing, and mollusks have been utilized as main fishery resources in terrestrial ecosystems. But little is known about genomic and transcriptional analysis in mollusks. This is the first report on the transcriptomic profile of Meretrix lu...
The importance of biological resources has been gradually increasing, and mollusks have been utilized as main fishery resources in terrestrial ecosystems. But little is known about genomic and transcriptional analysis in mollusks. This is the first report on the transcriptomic profile of Meretrix lusoria. In this study, we constructed cDNA library and determined 542 of distinct EST sequences composed of 284 singletons and 95 contigs. At first, we identified 180 of EST sequences that have significant hits on protein sequences of the exclusive Mollusks database through BLASTX program and 343 of EST sequences that have significant hits on NCBI NR database. We also found that 211 of putative sequences through local BLAST (blastx, E < e-10) search against KOG database were classified into 16 functional categories. Some kinds of immune response related genes encoding allograft inflammatory factor 1 (AIF-1), B-cell translocation gene 1 (BTG1), C-type lectin A, thioester-containing protein and 26S proteasome regulatory complex were identified. To determine phylogenetic relationship, we identified partial sequences of four genes (COX1, COX2, 12S rRNA and NADH dehydrogenase) that significantly matched with the mitochondrial genomes of 3 species-Ml (Meretrix lusoria), Mp (Meretrix petechialis) and Mm (Meretrix meretrix). As a result, we found that there was a little bit of a difference between sequences of Korean isolates and other known isolates. This study will be useful to develop breeding technology and might also be helpful to establish a classification system.
The importance of biological resources has been gradually increasing, and mollusks have been utilized as main fishery resources in terrestrial ecosystems. But little is known about genomic and transcriptional analysis in mollusks. This is the first report on the transcriptomic profile of Meretrix lusoria. In this study, we constructed cDNA library and determined 542 of distinct EST sequences composed of 284 singletons and 95 contigs. At first, we identified 180 of EST sequences that have significant hits on protein sequences of the exclusive Mollusks database through BLASTX program and 343 of EST sequences that have significant hits on NCBI NR database. We also found that 211 of putative sequences through local BLAST (blastx, E < e-10) search against KOG database were classified into 16 functional categories. Some kinds of immune response related genes encoding allograft inflammatory factor 1 (AIF-1), B-cell translocation gene 1 (BTG1), C-type lectin A, thioester-containing protein and 26S proteasome regulatory complex were identified. To determine phylogenetic relationship, we identified partial sequences of four genes (COX1, COX2, 12S rRNA and NADH dehydrogenase) that significantly matched with the mitochondrial genomes of 3 species-Ml (Meretrix lusoria), Mp (Meretrix petechialis) and Mm (Meretrix meretrix). As a result, we found that there was a little bit of a difference between sequences of Korean isolates and other known isolates. This study will be useful to develop breeding technology and might also be helpful to establish a classification system.
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문제 정의
, 2009). 본 연구는 Meretrix lusoria 의 cDNA 라이브러리를 제작한 후 EST 염기서열을 획득하여, 이를 바탕으로 전사체학적 분석과 계통분류학적인 분석을 통해 각종 유용 유전자를 발굴하고 체계적인 분류 체계를 확립하는데 활용되어질 기초자료를 확보하고자 수행되었다.
제안 방법
Cre-loxP recombination system을 이용한 E. coli 균주에서 lambda linear 형인 pTriplEx2 벡터에서 circular 형인 pTriplEx2 벡터로 변환시킨 후 carbenicillin 이 포함된 LB agar plate에 plating 하여 37℃ 에서 overnight 배양한 후 NucleoGen Plasmid Purification Kit를 사용하여 Plasmid 정제하여 ABI-3730-XL 자동염기서열 분석기(ABI prism)를 사용하여 염기서열을 결정하였다.
05) 이상의 조건으로 base calling 하였다. Cross_match 프로그램을 이용하여 벡터마스킹을 한 후 100 bp 이하의 서열들을 제거하였고, Emboss package (Rice et al., 2000) 의 trimest 소프트웨어를 사용하여 Poly-A 서열 또한 제거 하였다 (http://www.phrap.org). 이러한 과정을 거친 mFASTA 파일은 TGICL (Pertea et al.
M. lusoria 의 cytochrome c oxidase subunit I (COI) 유전자를 가진 클론의 염기서열을 NCBI로부터 BLAST search 한 후, COI로 동정된 서열을 NCBI에서 BLAST search 로 Genbank에 등록된 18종에 대한 mCOI 염기서열을 얻어서 Multi-Fasta format으로 변환한 후 ClustalX 프로그램을 이용하여 다중서열 분석을 실시하였으며 MEGA5를 이용하여 Maximum Parsimony (MP) method 를 통해 phylodendrogram을 도식화함으로서 M. lusoria 의 cytochrome c oxidase subunit I (COI) 서열의 evolutionary history 를 18종의 연체동물 데이터와 비교 분석하였다 (Fig. 4). Maximum parsimony 분석결과 (Fig.
기존에 서열 분석이 완료된 Meretrix lusoria (GQ903339), Meretrix petechialis (EU145977), Meretrix meretrix (GQ463598) 3종의 Mitochondrial Genome 서열과 본 연구에 의해 서열이 밝혀진 Meretrix lusoria EST 서열을 대상으로 하여 BLAST 검색을 통해 추출되어진 서열들을 Tamura-Nei model을 기반으로 한 Maximum Likelihood 방법 (Tamura and Nei, 1993) 을 통해 MEGA 5 프로그램을 이용하여 phylodendrogram 을 작성하였다.
백합 (Meretrix lusoria) 의 cDNA library 로부터 576개의 임의서열을 single-pass sequencing 방식으로 해독한 후 생성된 ab1 파일을 phred score 20 (trim_alt 0.05) 이상 조건으로 base calling 하였다. 만들어진 mFASTA 형식의 파일을 대상으로 cross_match 프로그램을 이용하여 vector masking 한 후 100 bp 이상의 서열만 취한 결과 542개의 서열을 확보하였다.
1). 서열들은 다음과 같은 3종의 데이터베이스; (1) Mollusks amino acid database (Lee et al., 2004); (2) NCBI nr database; (3) NCBI KOG database에 대하여 blast분석을 실시하였으며 E-value 값 1e-10 의 조건으로 분석하였다. 분석되어진 서열들은 DDBJ/EMBL/NCBI (accession numbers; FY999088- FY999629) 의 Genbank 에 등록되었다.
정제된 mRNA를 주형으로 하여 oligo dT 와 reverse transcriptase를 사용하여 cDNA를 합성하였고, 정제 과정이나 합성 과정에서 생길 수 있는 partial cDNA를 제거하기 위해서 Sepharose CL-2B gel filtration medium을 이용하여 size fractionation 단계를 거쳐 길이가 500bp 이상인 cDNA만을 획득하였다. 이 cDNA들을 pBK-CMV vector에 ligation하였고, Gigapack Gold l (Stratagene, LaJolla, CA) packaging system을 사용하여 packaging하였다. ZAP Express cDNA Synthesis Kit 을 이용하여 library를 구축 하였고, 전기영동으로 확인한 결과 평균 insert size는 약 1.
자동염기서열 분석기를 통해 생산되어진 chromatogram 파일은 phred (Ewing and Green, 1998; Ewing et al., 1998) 소프트웨어를 이용하여 Phred score; 20 (trim-alt 0.05) 이상의 조건으로 base calling 하였다. Cross_match 프로그램을 이용하여 벡터마스킹을 한 후 100 bp 이하의 서열들을 제거하였고, Emboss package (Rice et al.
전체조직으로부터 Trizol reagent를 사용하여 total RNA 를 정제한 후, Stratagene Absolutely mRNA Purification Kit (Stratagene, CA, USA) 를 이용하여 mRNA을 정제 하였다. 정제된 mRNA를 주형으로 하여 oligo dT 와 reverse transcriptase를 사용하여 cDNA를 합성하였고, 정제 과정이나 합성 과정에서 생길 수 있는 partial cDNA를 제거하기 위해서 Sepharose CL-2B gel filtration medium을 이용하여 size fractionation 단계를 거쳐 길이가 500bp 이상인 cDNA만을 획득하였다.
전체조직으로부터 Trizol reagent를 사용하여 total RNA 를 정제한 후, Stratagene Absolutely mRNA Purification Kit (Stratagene, CA, USA) 를 이용하여 mRNA을 정제 하였다. 정제된 mRNA를 주형으로 하여 oligo dT 와 reverse transcriptase를 사용하여 cDNA를 합성하였고, 정제 과정이나 합성 과정에서 생길 수 있는 partial cDNA를 제거하기 위해서 Sepharose CL-2B gel filtration medium을 이용하여 size fractionation 단계를 거쳐 길이가 500bp 이상인 cDNA만을 획득하였다. 이 cDNA들을 pBK-CMV vector에 ligation하였고, Gigapack Gold l (Stratagene, LaJolla, CA) packaging system을 사용하여 packaging하였다.
대상 데이터
, 2004); (2) NCBI nr database; (3) NCBI KOG database에 대하여 blast분석을 실시하였으며 E-value 값 1e-10 의 조건으로 분석하였다. 분석되어진 서열들은 DDBJ/EMBL/NCBI (accession numbers; FY999088- FY999629) 의 Genbank 에 등록되었다.
연체동물문 (Phylum Mollusca), 이매패강 (Class Bivalvia), 이치아강 (Subclass Heterodonta), 백합목 (Order Veneroida), 백합과 (Family Veneridae), 백합속 (Genus Meretrix)에 속하는 백합 (Meretrix lusoria) 은 경남 진해시 용원동에서 채취한 개체로 2009년 8월 28일 부산 광역시 자갈치시장에서 구입하여 사용하였다.
, 2004) 의 Mollusks 아미노산 데이터베이스에 매치시킨 결과 180개의 서열을 얻을 수 있었다. 최종적으로는 199개의 unknown 서열이 발굴되었다 (Table 2).
데이터처리
05) 이상 조건으로 base calling 하였다. 만들어진 mFASTA 형식의 파일을 대상으로 cross_match 프로그램을 이용하여 vector masking 한 후 100 bp 이상의 서열만 취한 결과 542개의 서열을 확보하였다. 확보한 서열들의 평균 길이는 731 bp 이었으며 TGICL package (Pertea et al.
이론/모형
lusoria. Phylogenetic analyses were conducted in MEGA5 using the Maximum Parsimony method. The length of trees is 1240 and the consistency index is (0.
The percentage of replicate trees in which the associated taxa clustered together in the bootstrap test (1000 replicates) are shown next to the branches. The MP tree was obtained using the Close-Neighbor-Interchange algorithm.
Molecular Phylogenetic analysis by Maximum Likelihood method. The evolutionary history was inferred by using the Maximum Likelihood method based on the Tamura-Nei model (Tamura et al., 1993). The tree with the highest log likelihood (Ⓐ -1308.
When the number of common sites was < 100 or less than one fourth of the total number of sites, the maximum parsimony method was used; otherwise BIONJ method with MCL distance matrix was used.
org). 이러한 과정을 거친 mFASTA 파일은 TGICL (Pertea et al., 2003) 패키지를 사용하여 클러스트링 및 어셈블리 작업을 한 후 local BLAST (Altschul et al., 1990) 를 통해 분석되었다 (Fig. 1). 서열들은 다음과 같은 3종의 데이터베이스; (1) Mollusks amino acid database (Lee et al.
성능/효과
, 2003). 211개의 서열은 총 16개의 카테고리로 나누어졌는데 Translation, ribosomal structure and biogenesis 관련 유전자 9.48%를 비롯하여 RNA processing and modification 1.42%, Transcription 0.95%, cell cycle control, cell division, chromosome partitioning 0.95%, Signal transduction mechanisms 5.69%, Cell motility 0.47%, Cytoskeleton 9.00%, Extracellular structures 4.74%, Intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport 0.47%, Posttranslational modification, protein turnover, chaperones 8.06%, Energy production and conversion 16.11%, Carbohydrate transport and metabolism 3.32%, Amino acid transport and metabolism 7.58%, Nucleotide transport and metabolism 1.42%, Lipid transport and metabolism 1.42%, Inorganic ion transport and metabolism 1.90%, General function prediction only 15.17% 및 기능을 알 수 없는 Function unknown 유전자는 2.84% 였다 (Fig. 2).
4 종류의 유전자를 대상으로 하여 M. lusoria (Ml), M. petechialis (Mp), M. meretrix (Mm) 3종과 본 실험에 사용되어진 한국산 M. lusoria (MlK) 4종을 대상으로 MEGA5를 이용하여 Maximum Likelihood 방법으로 분자 계통학적 분석을 실시한 결과 MlK 의 서열은 모두 따로 분지 되어 나오는 양상을 띠었다. (Fig.
4). Maximum parsimony 분석결과 (Fig. 4) 를 보면, M. lusoria 와 본 연구에서 분석한 클론 Ml-COI과 동일한 분지가 나올 확률이 100%에 달하고 있으나, 백합 M. petechialis 와 M. meretrix는 98%의 분지도를 나타내고 있다. 또한 특이하게도 M.
이 cDNA들을 pBK-CMV vector에 ligation하였고, Gigapack Gold l (Stratagene, LaJolla, CA) packaging system을 사용하여 packaging하였다. ZAP Express cDNA Synthesis Kit 을 이용하여 library를 구축 하였고, 전기영동으로 확인한 결과 평균 insert size는 약 1.3kb 였다.
, 2009), Meretrix meretrix (unpublished) 3종의 Mitochondrial Genome 서열들을 대상으로 본 연구에 의해 밝혀진 Meretrix lusoria EST 서열들을 BLAST 검색을 통해 추출되어진 서열들을 매치한 결과, 4개의 유전자에 대해 총 14개의 clone (COX1 5 clone, COX2 5 clone, 12S rRNA 3 clone 및 NADH dehydrogenase 1 clone) 이 매치되었다. 각 유전자에 매치된 clone 들을 cap3 소프트웨어를 통해 assembly 한결과 COX1 에 해당하는 clone 들의 평균길이는 695 bp 로 M. lusoria, M. petechialis, M. meretrix 3종의 평균길이인 780 bp 에 대해 89.1% coverage 이었으며 COX2 는 평균길이 1,169 bp 에 비해 1,073 bp 로 91.8% 이었다. 12S ribosomal RNA 의 경우는 68%, NADH dehydrogenase 는 54.
기존에 서열분석이 완료된 Meretrix lusoria (Wang et al., 2010), Meretrix petechialis (Ren et al., 2009), Meretrix meretrix (unpublished) 3종의 Mitochondrial Genome 서열들을 대상으로 본 연구에 의해 밝혀진 Meretrix lusoria EST 서열들을 BLAST 검색을 통해 추출되어진 서열들을 매치한 결과, 4개의 유전자에 대해 총 14개의 clone (COX1 5 clone, COX2 5 clone, 12S rRNA 3 clone 및 NADH dehydrogenase 1 clone) 이 매치되었다. 각 유전자에 매치된 clone 들을 cap3 소프트웨어를 통해 assembly 한결과 COX1 에 해당하는 clone 들의 평균길이는 695 bp 로 M.
, 2010) 현황과 2012년 12월 현재 현황을 비교해 보면 nucleotide 등록 숫자는 246,987개 이었으나 현재 기준으로 681,398개이며 nucleotide EST의 경우에는 1,023,358개에서 1,121,843개로, 그리고 Nucleotide GSS의 경우는 5,665에서 23,112개로 작은 변화가 있음을 알 수가 있다. 백합속 (Genus Meretrix) 의 경우에도 NCBI에 총 11종이 등록되어 있는데 Meretrix meretrix (Asiatic hard clam) 의 nucleotide 35,145개 및 EST 2,111개를 제외하고는 거의 서열분석이 이루어지지 않았음을 볼 수 있었다. 유전체 서열의 경우도 M.
프로젝트의 진행상황 면에서 살펴보면 이 중 현재 진행 중인 프로젝트는 8,025개이며, Draft 서열수준의 프로젝트는 2,855개 이었으며 완성되었지만 아직 논문이 나오지 않은 프로젝트는 41개이었다. 생물군별로 살펴보면 고세균류가 252종, 박테리아가 12,688종 그리고 진핵생물은 2,593종으로 매우 많은 생물군에 대한 서열분석이 이루어지고 있음을 알 수 있었다. 하지만 연체동물문의 경우에는 다른 생물군에 비해 서열분석 관련연구의 진행이 느린 것으로 판단된다.
확보되어진 multi-FASTA 형태의 서열들은 E-value 값 1e-10 의 조건으로 NCBI local BLASTX 를 이용하여 nr 데이터베이스에 매치시킨 결과, 343개의 유효한 결과를 얻을수 있었으며 연체동물 서열데이터베이스 (Lee et al., 2004) 의 Mollusks 아미노산 데이터베이스에 매치시킨 결과 180개의 서열을 얻을 수 있었다. 최종적으로는 199개의 unknown 서열이 발굴되었다 (Table 2).
, 2003)를 이용하여 clustering and assembling한 결과 95개의 cluster, 95개의 contig 및 284개의 singleton 이 형성되었다. 확보된 서열의 평균길이 및 clustering and assembling 결과로 살펴볼 때 양질의 cDNA library 구축에 성공하였으며 서열의 다양성도 확보되었음을 확인할 수 있었다 (Table 2).
만들어진 mFASTA 형식의 파일을 대상으로 cross_match 프로그램을 이용하여 vector masking 한 후 100 bp 이상의 서열만 취한 결과 542개의 서열을 확보하였다. 확보한 서열들의 평균 길이는 731 bp 이었으며 TGICL package (Pertea et al., 2003)를 이용하여 clustering and assembling한 결과 95개의 cluster, 95개의 contig 및 284개의 singleton 이 형성되었다. 확보된 서열의 평균길이 및 clustering and assembling 결과로 살펴볼 때 양질의 cDNA library 구축에 성공하였으며 서열의 다양성도 확보되었음을 확인할 수 있었다 (Table 2).
후속연구
meretrix 과는 100%의 분지도를 나타내고 있다. 이러한 결과는 같은 종일 가능성이 높음을 의미하며 한국산 백합과 중국산 간에 같은 종이 존재한다고 생각해 볼 수도 있겠지만, 다른 종인데 동정이 잘못된 실험재료를 사용하였을 가능성도 배제할 수없으므로 이에 대해 추가적인 연구가 필요할 것으로 보인다. 이와 같이 본 실험에서 M.
이러한 결과는 같은 종일 가능성이 높음을 의미하며 한국산 백합과 중국산 간에 같은 종이 존재한다고 생각해 볼 수도 있겠지만, 다른 종인데 동정이 잘못된 실험재료를 사용하였을 가능성도 배제할 수없으므로 이에 대해 추가적인 연구가 필요할 것으로 보인다. 이와 같이 본 실험에서 M. lusoria의 COI의 유전자를 이용한 계통분류학적 연구를 통해 근연 생물군들과의 상관관계를 확인 할 수 있었으며, 향후 더 많은 새로운 종의 유전자 발굴로 더 많은 다른 종과의 비교 연구 등이 가능하리라 여겨진다.
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