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문제 정의
- 동의보감 등 기성 한의서에 수재된 한약처방에 해당하는 한약제제의 경우 그 출전을 기재하여 품목허가를 신청할 수 있으며, 이는 안전성, 유효성의 검증 없이 한약제제를 생산 판매할 수 있다는 것을 의미한다12). 이에 본 연구에서는 한약제제의 품질향상 및 저변 확대를 위한 근거를 제시하고자 삼출건비탕을 선정하여 전탕액 추출물과 2종의 시판 한약 제제간의 구성 성분 및 생리 활성을 비교 분석하여 그 결과를 보고하였다.
제안 방법
- 1-1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH, Sigma Chemical Co.) 라디칼을 이용한 항산화능 측정은 96 well plate을 이용하여 실시하였다14). 96 well plate에 0.
- 3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid(ABTS, Sigma Chemical Co. St. Louis, MO) 라디칼을 이용한 항산화능 측정은 ABTS+· cation decol orization assay방법을 96 well plate에 맞게 수정하여 실시하였다13).
- 3가지 삼출건비탕 시료의 항산화능은 ABTS와 DPPH 라디칼 소거활성을 통해 확인하였다. ABTS 라디칼의 소거활성을 비교한 결과 각 시료에 의해 농도의존적으로 라디칼 소거활성이 증가하였고, 대조구의 흡광도를 1/2로 환원시키는데 필요한 시료의 농도인 RC50 값은 각각 양성대조군 vitamin C; 4.
- LPS를 처리하여 염증반응을 유도한 대식세포는 NO, PGE2, IL-6와 같은 염증 매개 물질을 분비하게 된다29). 3가지 삼출건비탕의 항염증 효능을 비교하고자, 각 시료를 농도별로 처리한 후 각 염증 매개 물질의 분비량 변화를 측정하였다. 기존의 삼출건비탕의 항염증 효능 연구결과6)와 동일하게 전탕액 추출물 시료는 NO(Fig.
- CCK-8 용액 10μL를 첨가하여 4시간 동안 배양한 후 450 nm에서 흡광도를 측정하고 대조군과의 비교를 통해 상대적인 세포생존율(% of control)을 계산하였다.
- HPLC 분석을 위하여 본 연구원에서 제조한 시료와 시판 한약제제 2종의 시료를 각각 200 mg씩 정확히 측정한 후 물을 넣어 20 mL로 맞춘 후 0.2μm membrane 여과(Woongki Science, Seoul, Korea) 후 검액으로 하였다.
- 각각의 해당 kit를 이용하여 제조사의 방법에 따라 세포 상등액 내에 존재하는 NO, PGE2, IL-6 양을 측정하였다. LPS군과의 비교를 통해 상대적인 비율(% of LPS)을 계산하였다.
- 0% acetic acid가 함유된 acetonitrile을 기울기 용매 조건으로 하여 35분 이내에 분리하였다. PDA(photodiode array) 검출 파장은 230 nm에서 albiflorin과 paoniflorin, 254 nm에서 glycyrrhizin 및 280 nm에서 naringin, hesperidin, poncirin 및 liquititin을 각각 검출하였다. 검액에서의 peak는 주요 성분 peak의 retention time과 UV 흡수 파장을 비교하여 확인하였으며, 7종의 성분은 8.
- USA)를 사용하여 743 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료의 라디칼 소거활성은 용매인 PBS를 대조군으로 하여 대조군에 대한 라디칼 소거능을 백분율로 나타냈다. 활성비교를 위하여 양성대조군으로 vitamin C를 사용하였다.
- 15 mM의 DPPH 용액과 시료를 혼합하여 실온에서 30분간 반응시킨 후, 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 처방 추출물의 항산화능은 용매인 DMSO를 대조군으로 하여 대조군에 대한 라디칼 소거능을 백분율로 나타내었다. 활성비교를 위하여 양성대조군으로 vitamin C를 사용하였다.
- 5×105 cells/well)에 LPS(1 μg/mL)를 처리하고, 시료를 농도별로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 각각의 해당 kit를 이용하여 제조사의 방법에 따라 세포 상등액 내에 존재하는 NO, PGE2, IL-6 양을 측정하였다. LPS군과의 비교를 통해 상대적인 비율(% of LPS)을 계산하였다.
- 위장관 질환의 예방과 치료에는 항산화22,23) 및 항염증 효능24)이 중요하게 작용하는데, 앞서 언급한 직접적인 위장관 질환의 효과에 대한 연구 결과에 덧붙여, 각각의 지표물질에 대한 항산화, 항염증 효과는 다양한 연구에 통해 보고되어 있다25-28). 따라서 처방의 구성 성분과 효능간의 상관관계를 알아보고자 항산화 및 항염증 효능을 분석하였다.
- 삼출건비탕 내 주요성분인 albiflorin, paeoniflorin, liquiritin, naringin, hesperidin, poncirin 및 glycyrrhizin의 분리를 위하여 Gminin C18(5 μm, 4.6×150 mm, Phenomenex, Torrance, CA, USA) 칼럼을 사용하였고, 칼럼온도는 40℃로 유지하였다.
- 생쥐 대식세포주인 RAW 264.7 세포를 이용한 염증세포 모델을 이용하여 3가지 삼출건비탕 추출물의 항염증 효능을 비교 분석하였다. LPS를 처리하여 염증반응을 유도한 대식세포는 NO, PGE2, IL-6와 같은 염증 매개 물질을 분비하게 된다29).
- 따라서 실험에 사용한 3가지 삼출건비탕의 제조에 사용된 각각의 한약재의 양을 정확하게 확인할 수 없었으며, 추출 방법 또한 다소 차이가 있을 것으로 여겨졌다. 이에 실험에 사용한 세 가지 삼출건비탕의 비교 분석을 위하여 동일한 시료 양을 기준으로 구성 성분 함량 및 생리 활성을 분석하였다.
- 각 시료의 라디칼 소거활성은 용매인 PBS를 대조군으로 하여 대조군에 대한 라디칼 소거능을 백분율로 나타냈다. 활성비교를 위하여 양성대조군으로 vitamin C를 사용하였다.
- 효능분석을 위하여 본 연구원에서 제조한 시료와 시판 한약제제 2종 시료를 각각 100 mg씩 정확히 측정한 후 phosphate buffer saline(PBS, pH 7.4)를 넣어 1 mL로 맞춘 후 0.2 μm membrane 여과(Woongki Science, Seoul, Korea)하여 실험에 이용하였다.
대상 데이터
- 표준물질인 paeoniflorin, liquiritin, naringin, hesperidin 및 glycyrrhizin은 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.(Osaka, Japan) 로부터 구입하였으며, albiflorin과 poncirin은 ChromaDex(Irvine, CA, USA)로부터 구입하였다. 각 표준물질의 순도는 hesperidin(92.
- Dulbecco’s modified eagle’s medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS), penicillin-streptomycin(PS), PBS는 Gibco(USA) 제품, Cell counting kit-8(CCK-8)은 Dojindo 제품(Japan), lipopolysaccharide(LPS), indomethacin, NG-methyl-L-arginine(L-NMMA)은 Sigma(USA) 제품, Griess reagent는 Promega(USA) 제품, PGE2 EIA kit는 Cayman(USA) 제품, IL-6 ELISA kit은 Invitrogen(USA) 제품을 구입하여 사용하였다.
- The cells were stimulated with LPS(1 μg/mL) in the presence and absence of SKT extract(125, 250, 500, 1000μg/mL) for 24 h. Extracts of SKT from decoction(SKT1), manufacturer A(SKT2) and manufacturer B(SKT3) were used. The amount of NO in the medium was measured using a Griess reagent.
- 본 실험에 사용된 삼출건비탕은 본 연구실에서 제조한 1종(SKT1)과 시판 한약제제 2종(SKT2, SKT3)을 구입하여 사용하였다. Table 1에는 한 첩에 해당하는 삼출건비탕의 구성 한약재의 양과 시판 한약제제의 제품정보에 표시된 1회 용량의 구성 한약재의 양 혹은 각각의 한약재에 해당하는 추출물의 양을 나타냈다.
- Table 1에는 한 첩에 해당하는 삼출건비탕의 구성 한약재의 양과 시판 한약제제의 제품정보에 표시된 1회 용량의 구성 한약재의 양 혹은 각각의 한약재에 해당하는 추출물의 양을 나타냈다. 삼출건비탕 추출물의 제조를 위하여 Omniherb(Yeongcheon, Korea)와 HMAX(Jecheon, Korea)에서 구성 한약재를 각각 구입하여 이제현 교수(Dongguk University, Gyeongju, Korea)와 서영배 교수(Daejeon University, Daejeon, Korea) 2인의 전문가 감별 후 사용하였다. 각각의 구성 한약재들의 표본(2008-KE06-1∼2008-KE06-14)은 한국한의학연구원 한약기초연구그룹에 보관하였다.
- 삼출건비탕의 구성 약재 중 작약의 주요성분인 알비플로린(albiflorin)과 페오니플로린(paeoniflorin), 감초의 주요성분인 리퀴리틴(liquiritin)과 글리시리진(glycyrrhizin), 지실의 주요성분인 나린진(naringin)과 폰시린(poncirin) 및 진피의 주요성분인 헤스페리딘(hesperidin)을 분석대상으로 1.0% acetic acid가 함유된 water와 1.0% acetic acid가 함유된 acetonitrile을 기울기 용매 조건으로 하여 35분 이내에 분리하였다. PDA(photodiode array) 검출 파장은 230 nm에서 albiflorin과 paoniflorin, 254 nm에서 glycyrrhizin 및 280 nm에서 naringin, hesperidin, poncirin 및 liquititin을 각각 검출하였다.
- 생쥐 대식세포주인 RAW 264.7 세포는 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA)에서 분양 받아 사용하였다. RAW 264.
- 5% fetal bovine serum(FBS), 1% penicillin-streptomycin이 첨가된 Dulbecco’s modified eagle’s medium(DMEM) 배지로 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 세포 배양에 사용된 모든 시약은 Gibco Laboratories(Grand Island, NY) 제품을 사용하였다.
- 0% 이상이었다. 시료전처리 및 HPLC 분석을 위한 methanol, acetonitrile 및 water는 J.T. Baker(Phillipsburg, NJ, USA)에서 구입하였으며, acetic acid는 Merck KGaA (Darmstadt, Germany)에서 구입하여 사용하였다. 함량분석을 위한 HPLC는 LC-20A 시스템(Shimadzu Co.
- 배합한 약재에 10배의 물을 가한 후 100℃에서 2시간 동안 무압 환류 추출법(추출기: 경서메디텍 COSMOS660)을 이용하여 추출하였다. 추출액은 약전표준체를 사용하여 거르고 동결건조기(일신 동결건조기, PVTFD100R)를 사용하여 처방 추출물 2.45 kg(수율 24.5%)을 얻었다(Table 1).
- Baker(Phillipsburg, NJ, USA)에서 구입하였으며, acetic acid는 Merck KGaA (Darmstadt, Germany)에서 구입하여 사용하였다. 함량분석을 위한 HPLC는 LC-20A 시스템(Shimadzu Co., Kyoto, Japan)은 LC-20AT pump, DGU-20A3 on-line degasser, CTO-20A column oven, SIL-20AC auto-sampler 및 SPD-M20A PDA detector로 구성되어 있다. 분석 data는 LC solution software(Version 1.
데이터처리
- 실험결과에 대한 통계학적 유의성 검정은 ANOVA검정을 적용하였으며, Dunnet’s multiple comparison test를 이용하여 p-value가 0.05 미만일 경우 유의한 것으로 판정하였다.
이론/모형
- 각각의 구성 한약재들의 표본(2008-KE06-1∼2008-KE06-14)은 한국한의학연구원 한약기초연구그룹에 보관하였다. 배합한 약재에 10배의 물을 가한 후 100℃에서 2시간 동안 무압 환류 추출법(추출기: 경서메디텍 COSMOS660)을 이용하여 추출하였다. 추출액은 약전표준체를 사용하여 거르고 동결건조기(일신 동결건조기, PVTFD100R)를 사용하여 처방 추출물 2.
- 시료의 세포 독성을 알아보기 위해 Cell Counting Kit-8(CCK-8; Dojindo, Japan)을 제조사의 사용법에 따라 사용하였다. 96 well plate에 분주한 RAW 264.
성능/효과
- 1. 3가지 삼출건비탕의 7종의 지표 성분에 대한 HPLC 분석 결과, SKT2에서 가장 많은 함량을 나타낸 알비플로빈을 제외한, 페오니플로빈, 리퀴리틴, 나린진, 헤스페리딘, 폰시린, 글리시리진은 시판 한약제제에 비해 전탕액 추출물에서 높은 함량으로 측정되었다.
- 따라서 구성 성분 함량과 생리 활성은 밀접한 상관관계가 있음을 알 수 있다. 1회 용량을 고려하여 성분 및 효능을 비교한다면, 전탕액의 경우 1첩을 1회 용량으로 간주하였을 때 10.66 g을 섭취하여야 하며, 시판 한약제제 A와 B의 경우 각각 10.75 g, 15.91 g을 1회 용량으로 제시하고 있어(Table 1), 각각의 1회 용량을 복용하였을 때 전탕액 추출물이 시판 한약제제를 복용했을 때 보다 더 강한 항산화 항염증효능을 나타낼 것으로 여겨진다.
- 2. ABTS와 DPPH 라디칼의 소거활성을 비교한 결과, 3가지 삼출건비탕 모두 농도의존적인 활성을 나타냈으나, 시판 한약제제에 비해 전탕액 추출물에서 높은 항산화 활성을 나타냈다.
- 3. 3가지 삼출건비탕의 항염증 효능을 비교한 결과, 전탕액 추출물은 LPS 처리에 의해 증가된 PGE2와 IL-6 생성을 농도의존적으로 억제하였으나, 시판 한약제제의 경우 한 종류(SKT3)에서만 유의적인 PGE2 억제 효능을 확인하였다.
- 3가지 삼출건비탕의 7종의 지표 성분에 대한 HPLC 분석 결과(Fig. 1), 전탕액 추출물, 시판 한약제제 A 및 B에서 7종의 성분이 1.40-6.80 mg/g, ND-4.75 mg/g 및 0.03-1.46 mg/g으로 각각 나타났다(Table 2). 알비플로빈은 시판 한약제제 A에서 1.
- 65 mg/mL로 각각 나타났다(data not shown). 7종 성분의 피크 면적과 머무름 시간에 대한 재현성은 상대표준편차가 1.5%와 0.1% 이내로 양호한 재현성을 나타내었다.
- ABTS 라디칼의 소거활성을 비교한 결과 각 시료에 의해 농도의존적으로 라디칼 소거활성이 증가하였고, 대조구의 흡광도를 1/2로 환원시키는데 필요한 시료의 농도인 RC50 값은 각각 양성대조군 vitamin C; 4.57±0.01 μg/mL, 전탕액 추출물; 42.38±1.00 μg/mL, 시판 한약제제 A; 233.23±1.08 μg/mL, 시판 한약 제제 B; 317.40±2.63 μg/mL로 측정되었다(Fig. 2).
- DPPH 라디칼의 소거활성 역시 추출물의 농도가 증가함에 따라 점차적으로 증가하는 경향을 보였으며, 추출물의 농도 500 μg/mL에서 전탕액 추출물; 85.28%, 시판 한약제제 A; 44.32%, 시판 한약제제 B; 30.05%의 라디칼 소거활성을 보였다(Fig. 3).
- (Osaka, Japan) 로부터 구입하였으며, albiflorin과 poncirin은 ChromaDex(Irvine, CA, USA)로부터 구입하였다. 각 표준물질의 순도는 hesperidin(92.0%)을 제외한 6종 모두 98.0% 이상이었다. 시료전처리 및 HPLC 분석을 위한 methanol, acetonitrile 및 water는 J.
- PDA(photodiode array) 검출 파장은 230 nm에서 albiflorin과 paoniflorin, 254 nm에서 glycyrrhizin 및 280 nm에서 naringin, hesperidin, poncirin 및 liquititin을 각각 검출하였다. 검액에서의 peak는 주요 성분 peak의 retention time과 UV 흡수 파장을 비교하여 확인하였으며, 7종의 성분은 8.774, 9.657, 11.495, 13.465, 13.977, 19.127 및 30.295분에 각각 검출되었다(Fig. 1). 삼출건비탕의 함량분석을 위한 검량선은 상관계수 값이 0.
- 46 mg/g으로 상대적으로 적은 양이 검출되었다. 그외 리퀴리틴, 나린진, 헤스페리딘, 폰크린과 글리시리진은 시판 한약제제 추출물에서는 모두 1.00 mg/g 이하의 함량으로 검출된 데 비해, 전탕액 추출물에서는 1.60, 5.00, 6.80, 5.45, 2.80 mg/g으로 비교적 높은 함량으로 검출되었다.
- 동일한 양을 기준으로 구성 성분과 생리 활성을 비교 분석한 결과를 종합하면, 삼출건비탕 전탕액 추출물의 구성 성분 함량이 가장 높게 검출되었으며, 항산화 효능과 항염증 효능 역시 전탕액 추출물을 처리한 군에서 높게 관찰되었다. 따라서 구성 성분 함량과 생리 활성은 밀접한 상관관계가 있음을 알 수 있다.
- 시판 한약제제는 각각의 약재를 추출한 단미엑스제를 혼합 제조하여 공급되는 한약 제제로 시판 한약제제 A(SKT2)의 경우 단미엑스제의 양과 그에 해당하는 한약재의 양까지 각각 표시하고 있으나, 시판 한약제제 B(SKT3)는 구성 단미엑스제의 양만을 표시하고 있다. 따라서 실험에 사용한 3가지 삼출건비탕의 제조에 사용된 각각의 한약재의 양을 정확하게 확인할 수 없었으며, 추출 방법 또한 다소 차이가 있을 것으로 여겨졌다. 이에 실험에 사용한 세 가지 삼출건비탕의 비교 분석을 위하여 동일한 시료 양을 기준으로 구성 성분 함량 및 생리 활성을 분석하였다.
- 이상의 결과로 삼출건비탕 전탕액 추출물이 시판 한약제제에 비해 지료 성분 함량이 더 높았으며, 항산화 항염증 효과 역시 더 우수한 것으로 확인되었다.
- 이상의 결과를 종합해보았을 때, 본 연구를 통해 삼출건비탕의 경우 전탕액 추출물이 단미혼합 제제인 시판 한약제제보다 지료 성분 함량이 더 많았으며, 항산화 항염증 효능이 더 우수한 것으로 확인되었다.
- 전탕액 추출물과 시판 한약제제간의 이러한 차이는 아마도 추출방법의 차이에서 기인할 것으로 여겨진다. 즉, 처방의 구성 한약재를 모두 혼합하여 추출한 전탕액 추출물과 각각의 한약재 추출물을 혼합한 시판 한약제제의 지표물질 함량 및 효능 간에는 유의적인 차이가 있음을 알 수 있었다. 이는 전탕액 추출물과 단미혼합제제의 효능을 비교한 기존의 연구 결과에서도 비슷한 양상으로 관찰되었다.
- 11 mg/g)에 비해 높게 검출되었다. 페오니플로린은 전탕액 추출물과 시판 한약제제 A에서 각각 5.60, 4.75 mg/g으로 비슷한 함량으로 검출되었으나 시판 한약제제 B에서는 1.46 mg/g으로 상대적으로 적은 양이 검출되었다. 그외 리퀴리틴, 나린진, 헤스페리딘, 폰크린과 글리시리진은 시판 한약제제 추출물에서는 모두 1.
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