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문제 정의
- 그러므로 본 연구에서는 흰점박이꽃무지의 기능성식품 재료 활용 가능성을 검증하기 위해 상용되고 있는 배 즙, 알로에 즙, 돼지감자 즙에 흰점박이꽃무지 첨가 시 그 생리 활성 규명 및 급성경구독성시험을 통해 흰점박이꽃무지 함유 즙의 항산화활성 및 안전성 검증을 실시하고자 하였다.
- 본 연구에서는 흰점박이꽃무지 함유 음료의 총폴리페놀 함량과 항산화활성(DPPH 라디칼 소거능, TRAP, ORAC assay, comet assay) 및 사용에 대한 안전성을 검증하기 위하여 ICR mouse를 사용하여 흰점박이꽃무지 무첨가군과 첨가군 단회 투여(2 g/kg) 시 나타나는 치사율, 체중, 생리적 증상, 장기무게, 생화학적 분석(triglyceride, total cholesterol, HDL-cholesterol, LDL-cholesterol, aspartate transaminase, alanine transaminase)을 통해 급성독성시험을 실시하였다. 흰점박이꽃무지를 함유한 호박, 알로에, 돼지감자 음료 1 pack의 총 페놀함량은 66.
제안 방법
- 한국 식품의약품안전청 기준과 OECD 실험기준에 의거하여, 설치류 최고 한계투여용량인 2 g/㎏을 최고 용량으로 설정하였다. 18시간 절식 후 존데(sonde)가 부착된 1 mL 주사기를 이용하여 경구 투여하였다. 식이와 음수에 따른 약물의 흡수 변화를 최소화하기 위해, 투여 후 대략 3시간 동안 사료와 음수 공급을 제한하였다.
- 20 μg/mL 농도의 ethidium bromide로 핵을 염색하여 커버글래스로 덮은 뒤 형광현미경(Leica, Wetzlar, Germany) 상에서 관찰하였다.
- 20 μg/mL 농도의 ethidium bromide로 핵을 염색하여 커버글래스로 덮은 뒤 형광현미경(Leica, Wetzlar, Germany) 상에서 관찰하였다. CCD camera(Nikon, Tokyo, Japan)를 통해 보내진 각각의 세포핵 이미지는 comet image analyzing system(Komet 5.0, Kinetic Imaging, Liverpool, UK)이 설치된 컴퓨터 상에서 분석하였다. 백혈구의 H2O2에 의한 DNA 손상 및 각 시료에 의한 손상억제 정도는 핵으로부터 이동해서 꼬리 부분으로 떨어져 나간 꼬리 부분 내 DNA %함량(tail intensity)을 측정하여 나타내었다.
- Lysis가 끝난 후, 슬라이드를 전기영동 수조에 배열하고 4℃의 전기영동 buffer(300 mM NaOH, 10 mM Na2EDTA, pH>13)를 채워 20분 동안 unwinding 시켜 DNA의 alkali labile sites가 드러나게 한 후 25 V/300±3 mA의 전압을 걸어 20분간 전기영동을 실시하였다.
- 백혈구의 H2O2에 의한 DNA 손상 및 각 시료에 의한 손상억제 정도는 핵으로부터 이동해서 꼬리 부분으로 떨어져 나간 꼬리 부분 내 DNA %함량(tail intensity)을 측정하여 나타내었다. 각각의 처리구에서 2개의 슬라이드를 만들어 각각 100개 세포의 DNA 손상 정도를 측정하고 각 처리구는 최소 3회 반복 실험하였다.
- 결과는 vitamin E 수용성 유도체인 trolox(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroma-2- carbonyl acid) 1 μM에 의해 보호된 curve area와 비교하여, 그 값은 μM Trolox equivalents(TE)로 표현하였다.
- 모든 음료에는 건표고버섯 500 g, 헛개절편 900 g, 인진쑥 2단, 생강 300 g, 대추 300 g을 기본으로 하고 여기에 각각 호박, 알로에, 돼지감자 15 kg을 첨가한 것을 대조군으로 하였다. 그리고 각각 대조군 음료에 흰점박이꽃무지(엔토리서치, 3령유충) 2 kg 첨가한 것을 실험군으로 하여 원적외선 바이오 증탕기(대조산업, 경기도)로 12시간 증탕한 후 레토르트 파우치(1 pack, 120 mL)로 포장한 후 냉장보관하면서 분석시료로 사용하였다.
- 대조구는 백혈구에 PBS만을 처리하였으며, 양성대조군은 추출물 대신 PBS를 사용하여 반응시킨 후 200 μM H2O2를 처리하였다.
- 모든 실험동물은 육안부검 소견을 관찰 기록한 후 폐, 심장, 신장, 비장, 간, 뇌에 대한 절대 중량을 각각 측정하였다.
- 암수 각각 70마리의 ICR 마우스(5 weeks old upon receipt, SLC, Japan)를 7일간의 순화과정을 거쳐 실험에 사용하였으며, 순화과정 및 실험 전 기간 동안 온도(20~25℃)와 습도(50%)가 조절된 사육실에서 마우스용 polycarbonate 사육 상자에 5마리씩 수용하여 사육하였고, 명암 주기(light : dark cycle)는 12시간 주기로 조절하였으며, 사료(Halan, Madison, WI, USA)와 음수는 자유롭게 공급하였다. 모든 실험동물은 투여일 및 최종 부검일 18시간 전 절식을 실시하였다.
- 모든 실험동물의 임상증상을 투여 전후에 각각 동물의 행동, 자극에 대한 반응성, 각성도 및 경계성, 자세 및 보행 이상 등에 관한 일반 증상을 관찰 기록하였으며, 투여일 이후에도 하루에 최소한 2번씩 모든 실험동물의 임상증상을 관찰 기록하였다.
- 모든 실험동물의 체중을 투여 전 1일, 투여직전, 투여 후 2일 간격으로 각각 측정하여 체중증가량인 증체량을 각각의 체중을 이용하여 산출하였다.
- 모든 음료에는 건표고버섯 500 g, 헛개절편 900 g, 인진쑥 2단, 생강 300 g, 대추 300 g을 기본으로 하고 여기에 각각 호박, 알로에, 돼지감자 15 kg을 첨가한 것을 대조군으로 하였다. 그리고 각각 대조군 음료에 흰점박이꽃무지(엔토리서치, 3령유충) 2 kg 첨가한 것을 실험군으로 하여 원적외선 바이오 증탕기(대조산업, 경기도)로 12시간 증탕한 후 레토르트 파우치(1 pack, 120 mL)로 포장한 후 냉장보관하면서 분석시료로 사용하였다.
- 0, Kinetic Imaging, Liverpool, UK)이 설치된 컴퓨터 상에서 분석하였다. 백혈구의 H2O2에 의한 DNA 손상 및 각 시료에 의한 손상억제 정도는 핵으로부터 이동해서 꼬리 부분으로 떨어져 나간 꼬리 부분 내 DNA %함량(tail intensity)을 측정하여 나타내었다. 각각의 처리구에서 2개의 슬라이드를 만들어 각각 100개 세포의 DNA 손상 정도를 측정하고 각 처리구는 최소 3회 반복 실험하였다.
- Lysis가 끝난 후, 슬라이드를 전기영동 수조에 배열하고 4℃의 전기영동 buffer(300 mM NaOH, 10 mM Na2EDTA, pH>13)를 채워 20분 동안 unwinding 시켜 DNA의 alkali labile sites가 드러나게 한 후 25 V/300±3 mA의 전압을 걸어 20분간 전기영동을 실시하였다. 빛에 의해 DNA가 부가적으로 손상되는 것을 방지하기 위해 위의 과정은 전기영동 수조를 어두운 천으로 덮은 채 실시하였다. 전기영동이 끝난 후 0.
- 실험동물은 각 시료마다 암수 5마리씩 급성독성 평가를 실시하고자 하였다. 한국 식품의약품안전청 기준과 OECD 실험기준에 의거하여, 설치류 최고 한계투여용량인 2 g/㎏을 최고 용량으로 설정하였다.
- 본 연구는 K대학교의 동물윤리심의위원회(IACUC)의 승인을 받아(인증번호 KUICA_11_02) 수행되었으며, 연구기간은 2011년 7월 8일~29일에 시행되었다. 암수 각각 70마리의 ICR 마우스(5 weeks old upon receipt, SLC, Japan)를 7일간의 순화과정을 거쳐 실험에 사용하였으며, 순화과정 및 실험 전 기간 동안 온도(20~25℃)와 습도(50%)가 조절된 사육실에서 마우스용 polycarbonate 사육 상자에 5마리씩 수용하여 사육하였고, 명암 주기(light : dark cycle)는 12시간 주기로 조절하였으며, 사료(Halan, Madison, WI, USA)와 음수는 자유롭게 공급하였다. 모든 실험동물은 투여일 및 최종 부검일 18시간 전 절식을 실시하였다.
- 투여 14일 후 모든 실험동물은 18시간 절식을 실시하였으며, isoflurane(4 mL/kg)을 적신 수건을 넣고 쥐를 넣은 후 밀폐시켜 흡입마취 시켰다. 폐, 심장, 신장, 비장, 간, 뇌를 위주로 이상 육안소견을 각각 관찰 기록하였다.
- 실험동물은 각 시료마다 암수 5마리씩 급성독성 평가를 실시하고자 하였다. 한국 식품의약품안전청 기준과 OECD 실험기준에 의거하여, 설치류 최고 한계투여용량인 2 g/㎏을 최고 용량으로 설정하였다. 18시간 절식 후 존데(sonde)가 부착된 1 mL 주사기를 이용하여 경구 투여하였다.
- 시료를 6분 동안 30℃에서 배양한 후 UV/VIS spectrometer로 740 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 혈장의 TRAP 농도는 trolox의 표준곡선을 이용하여 계산하였으며, TEAC(trolox equivalent antioxidant capacity, mM)로 표현하였다.
- 호박, 알로에, 돼지감자 음료에 흰점박이꽃무지 첨가 또는 무첨가군을 각각 1, 5, 10, 50 μg/mL의 농도로 백혈구에 처리하고 37℃에서 30분간 반응시킨 후 백혈구에 산화적 손상을 주기 위해 200 μM의 hydrogen peroxide(H2O2)를 4℃에서 5분간 처리한 뒤 PBS로 세척하였다.
대상 데이터
- Peroxy radical의 생성을 위해 20 mM 2,2'-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride(AAPH)를 사용하였고, 형광표준용액은 40 nM fluorescent를 제조하여 GENios fluorescence plate reader(Tecan, Salzburg, Austria)로 excitation wavelength 485 nm, emission wavelength 535 nm에서 측정하였다.
- 신선한 전혈 5 mL을 Histopaque 1077을 이용해 백혈구만을 분리해 낸 후 본 실험에 사용하였다. 호박, 알로에, 돼지감자 음료에 흰점박이꽃무지 첨가 또는 무첨가군을 각각 1, 5, 10, 50 μg/mL의 농도로 백혈구에 처리하고 37℃에서 30분간 반응시킨 후 백혈구에 산화적 손상을 주기 위해 200 μM의 hydrogen peroxide(H2O2)를 4℃에서 5분간 처리한 뒤 PBS로 세척하였다.
데이터처리
- 각 항목에 따라 백분율과 평균치±표준편차(standard deviation, SD) 또는 표준편차(standard error, SE)를 구하고 각 군별로 유의성 검증을 위해서 one-way 분산분석(ANOVA)을 시행하여 F 값을 구하고 Duncan's multiple range test를 이용하여 각 군 간의 유의성 차이를 검증하였다.
- 변수들 간의 관계를 검증하기 위해 Pearson's correlation coefficients인 r 계수로 검증하였다.
이론/모형
- LDL-콜레스테롤은 Friedewald 등(17)에 의한 계산법[총콜레스테롤–(HDL 콜레스테롤–중성지방/5)]으로 산출하였다.
- Peroxy radical의 생성과 소멸에 의한 형광의 감소율 변화에 대한 흰점박이꽃무지 함유 음료의 항산화활성은 peroxy radical scavenging capacity(ORACROO·) 분석법(14)을 이용하여 측정하였다.
- 혈장 총 콜레스테롤과 HDL-콜레스테롤 농도는 Allain 등의 방법(15)과 중성지방 농도는 lipase-glycerol phosphate oxidase 방법(16)에 따라 비씨에스 진단 키트(Bioclinical system, Korea)를 사용하여 측정하였으며, Aspartate transaminase(AST) 및 alanine transaminase(ALT) 역시 같은 키트를 사용하였다. LDL-콜레스테롤은 Friedewald 등(17)에 의한 계산법[총콜레스테롤–(HDL 콜레스테롤–중성지방/5)]으로 산출하였다.
성능/효과
- ORAC assay는 산화물질에서 유도된 peroxy radical이 형광 probe와 반응하여 비형광의 생성물을 형성하는데, 항산화활성은 시간에 따른 비형광생성물의 양과 감소율을 평가하여 항산화활성을 측정한다(22). ORAC assay의 결과를 보면 특히 돼지감자＋흰점박이꽃무지 첨가/무첨가군은 약 3000에 가까운 ORAC 값을 나타내었다(Fig. 2). 이는 Wolfe 등(23)의 연구결과와 비교 시 오렌지 100 g 섭취 시 나타나는 ORAC 값 2887과 거의 유사하며, 호박＋흰점박이꽃무지 첨가군(2196)은 복숭아(2235) 100 g 섭취 시 나타나는 ORAC value와 유사한 값을 나타내었다.
- 건강한 성인의 백혈구에 산화적 스트레스를 유도하는 200 μM H2O2 처리 시 DNA 손상은 유의적으로 증가한 반면, 흰점박이꽃무지 함유 유무와 관계없이 모든 음료에서 그 손상은 유의적으로 감소되었다.
- 흰점박이꽃무지 첨가/무첨가 음료의 ICR mouse 암수 각각에 경구투여(2 g/kg) 후 14일까지 치사된 실험동물은 관찰되지 않았으며, 체중, 생리적, 병리적 및 생화학적 분석에서 대조군과 비교 시 그룹들 간의 유의한 변화는 관찰되지 않았다. 그러므로 2 g/kg의 흰점박이꽃무지 첨가/무첨가 음료를 ICR mouse에 단일 경구투여시 독성이 없는 것으로 판명되었다. 본 연구에서 규명된 흰점박이꽃무지 함유 음료의 항산화활성과 안전성은 산업적 측면에서 약용 및 식용 자원으로 적극적인 활용을 기대할 수 있을 것으로 사료된다.
- 시료 투여 후 14일 동안 체중을 측정한 결과 시료들 간의 유의적 차이도 나타나지 않았다(Table 1). 대조군 및 시료 투여군의 모든 장기에서 육안적 소견상 특이할만한 병적소견 또한 관찰되지 않았으며, 각 그룹별 장기무게 역시 유의적 차이는 나타나지 않았다(Table 2).
- 혈액의 생화학적 검사(중성지질, 총콜레스테롤, HDL-콜레스테롤, LDL-콜레스테롤, AST, ALT)에서도 대조군과 비교 시 모든 음료 군에서 유의적인 변화가 관찰되지 않았다(Table 3). 따라서 본 연구결과에서 흰점박이꽃무지 함유 음료는 체중 kg당 2 g까지의 용량 내에서는 독성이 없는 것으로 사료된다.
- 54 μM/trolox equivalent(TE)를 보였으며, 모든 음료의 ORAC 값은 1500보다 높았다. 모든 음료는 인체 임파구에서 세포독성을 보이지 않았으며, H2O2에 대한 DNA 손상에 대한 보호효과는 유의적이었다. 흰점박이꽃무지 첨가/무첨가 음료의 ICR mouse 암수 각각에 경구투여(2 g/kg) 후 14일까지 치사된 실험동물은 관찰되지 않았으며, 체중, 생리적, 병리적 및 생화학적 분석에서 대조군과 비교 시 그룹들 간의 유의한 변화는 관찰되지 않았다.
- 모든 음료의 DPPH 라디칼 소거능은 67.1~90.0%/pack 범위로 이는 비타민 C 50~1000 μg/mL 농도에서 DPPH 라디칼 소거능 73.8~81.7%와 유사하거나 다소 높은 활성을 가지는 것으로 나타났으며, DPPH 라디칼 소거능은 알로에＋흰점박이꽃무지(90.02%)에서 가장 높았다(Fig. 2).
- TRAP assay는 2,2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphnate) 양이온(ABTSㆍ+)에 대한 항산화제의 소거능을 측정하는 방법이다(20). 모든 음료의 TRAP 값은 1.46～1.54 mM/trolox equvalent(TE)에 포함되며, 모든 음료군에서 유의적인 차이는 나타나지 않았다(Fig. 2). Jeon 등(21)은 녹즙의 재료로 들어가는 케일의 TRAP 값을 1.
- 건강한 성인의 백혈구에 산화적 스트레스를 유도하는 200 μM H2O2 처리 시 DNA 손상은 유의적으로 증가한 반면, 흰점박이꽃무지 함유 유무와 관계없이 모든 음료에서 그 손상은 유의적으로 감소되었다. 백혈구에 모든 시료들을 각각 처리하여 cell viability를 측정해본 결과 90% 이상을 나타내어 대조군 음료와 흰점박이꽃무지 함유 음료군 모두에서 세포 독성은 나타나지 않았다.
- 본 연구에서 in vitro 항산화 측정 방법(총 폴리페놀 함량, DPPH 라디칼 소거능, TRAP assay, ORAC assay)들 간의 상관관계를 분석해 본 결과 총 폴리페놀 함량과 ORAC assay에서 양의 상관관계(r=0.72, p<0.01)를 확인할 수 있었다.
- 또한 설사, 구토, 활동상태 등의 일반증상 및 임상증상에서도 대조군에 비해 특이적인 변화는 관찰되지 않았다. 시료 투여 후 14일 동안 체중을 측정한 결과 시료들 간의 유의적 차이도 나타나지 않았다(Table 1). 대조군 및 시료 투여군의 모든 장기에서 육안적 소견상 특이할만한 병적소견 또한 관찰되지 않았으며, 각 그룹별 장기무게 역시 유의적 차이는 나타나지 않았다(Table 2).
- 음료들 중에서는 돼지감자＋흰점박이꽃무지군에서 100.98 mg/pack으로 유의적으로 가장 높았으며, 그 다음은 돼지감자> 알로에＋흰점박이꽃무지> 호박＋흰점박이꽃무지> 알로에, 호박 순으로 나타났다.
- 혈액의 생화학적 검사(중성지질, 총콜레스테롤, HDL-콜레스테롤, LDL-콜레스테롤, AST, ALT)에서도 대조군과 비교 시 모든 음료 군에서 유의적인 변화가 관찰되지 않았다(Table 3). 따라서 본 연구결과에서 흰점박이꽃무지 함유 음료는 체중 kg당 2 g까지의 용량 내에서는 독성이 없는 것으로 사료된다.
- 모든 음료는 인체 임파구에서 세포독성을 보이지 않았으며, H2O2에 대한 DNA 손상에 대한 보호효과는 유의적이었다. 흰점박이꽃무지 첨가/무첨가 음료의 ICR mouse 암수 각각에 경구투여(2 g/kg) 후 14일까지 치사된 실험동물은 관찰되지 않았으며, 체중, 생리적, 병리적 및 생화학적 분석에서 대조군과 비교 시 그룹들 간의 유의한 변화는 관찰되지 않았다. 그러므로 2 g/kg의 흰점박이꽃무지 첨가/무첨가 음료를 ICR mouse에 단일 경구투여시 독성이 없는 것으로 판명되었다.
- 흰점박이꽃무지를 함유한 호박, 알로에, 돼지감자 음료 1 pack의 총 페놀함량은 66.35～100.98 mg/pack, DPPH 라디칼 소거능은 67.1～90.0%/1 pack, TRAP 값은 1.46～1.54 μM/trolox equivalent(TE)를 보였으며, 모든 음료의 ORAC 값은 1500보다 높았다.
후속연구
- 그러나 식품 내 항산화성분은 지질과산화를 통한 세포막의 변화, DNA 손상과 돌연변이를 차단하여 이들 질병 발생을 억제하게 된다. 따라서 산화적 스트레스에 의한 DNA 손상 보호효과는 각각의 음료와 여기에 첨가된 흰점박이꽃무지에 함유되어 있는 총 폴리페놀을 포함한 다양한 생리활성 성분들에 의한 것으로 사료되어지며, 흰점박이꽃무지에 함유된 생리활성 성분 규명에 관한 연구가 조속히 이루어져야 할 것으로 생각된다.
- 그러므로 2 g/kg의 흰점박이꽃무지 첨가/무첨가 음료를 ICR mouse에 단일 경구투여시 독성이 없는 것으로 판명되었다. 본 연구에서 규명된 흰점박이꽃무지 함유 음료의 항산화활성과 안전성은 산업적 측면에서 약용 및 식용 자원으로 적극적인 활용을 기대할 수 있을 것으로 사료된다.
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