[논문]크레아틴의 방해영향을 줄인 크레아티닌 바이오센서

구현우; 권기학; 임은혜; 신재호

doi:10.5229/jkes.2012.15.4.249

[국내논문] 크레아틴의 방해영향을 줄인 크레아티닌 바이오센서
A Creatinine Biosensor with Reduced Interference from Creatine 원문보기

전기화학회지 = Journal of the Korean Electrochemical Society, v.15 no.4, 2012년, pp.249 - 255

구현우 (광운대학교 자연과학대학 화학과) , 권기학 (광운대학교 자연과학대학 화학과) , 임은혜 (광운대학교 자연과학대학 화학과) , 신재호 (광운대학교 자연과학대학 화학과)

초록
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크레아티닌 센서의 생체시료 측정 시 가장 심각한 방해 작용을 발생하는 물질인 크레아틴을 효과적으로 제거하기 위하여 creatine kinase와 adenosine triphosphate를 사용한 두 번째 효소층을 도입하여 크레아틴에 대한 방해작용을 현저히 감소시켰다. 또한 평면형 소형 크레아티닌 센서를 개발하기 위해 탄소전극 표면에 Pt black(Pt-B)을 도입하여 표면적을 증가시킴으로써 전기화학적 감응 특성을 증가시킨 스크린 프린팅 방식의 Pt-B/C 전극을 제작하였다. 최적화된 소형 크레아티닌 센서를 흐름계 카트리지에 장착하여 미지시료를 측정한 결과 5% 이내의 오차 범위 내에서 우수한 측정 정확성과 재현성을 보임을 확인하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

The planar-type amperometric creatinine biosensor employing an additional enzyme layer containing creatine kinase and adenosine triphosphate was developed to eliminate severe interference from creatine. In the additional enzyme layer, an interfering substance, creatine is converted to noninterfering product, phosphocreatine. Furthermore, the carbon electrode electroplated with Pt black(Pt-B) was employed to fabricate creatinine biosensors with improved sensor performance(e.g., sensitivity, reliability, and reproducibility). The creatinine levels in an unknown sample were determined within less than 5% errors using creatinine microsensors equipped in a flow-cell cartridge.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

이와 같은 결과로 임상시료 내 크레아티닌과 비슷한 농도로 존재하는 크레아틴은 더 이상 심각한 방해작용을 하지 않음을 확인할 수 있었다. 또한 아스코르브산과 요산에 대한 방해작용은 음이온 폴리머 Nafion을 도입함으로써 개선하고자 하였다. 이를 확인하기 위해 300 μM 크레아티닌의 농도를 측정할 때 음이온성 방해종인 아스코르브산과 요산이 각각 50 μM과 200 μM 존재(혈액 내 정상농도범위) 할 때와 존재하지 않을 때의 센서신호 크기를 비교하였다.
전류법을 이용한 바이오센서는 센서의 감응도는 전극면적에 직접적인 영향을 받는다. 또한 측정하고자 하는 크레아티닌은 혈중 농도범위가 mM 정도로 낮은 농도이므로 센서의 감도를 향상시켜주기 위해 탄소전극 표면에 나노 크기의 미세 3차원 구조를 형성하고자 Pt-B을 도입하고자 하였다. 이를 위해 염화백금산 0.
특히 친수성 폴리우레탄(hydrophilic polyurethane; HPU)은 사용된 sofe-segment의 비율과 성질에 따라 물을 흡수하는 능력과 막 자체의 공극률(porosity)이 다르고, 다양한 고체상 전극과의 우수한 접착력을 제공하며, 생체 적합성이 우수하고, 센서에 도입되었을 경우 안정화 시간이 비교적 짧다는 장점이 있다. 본 연구에서는 이러한 친수성 폴리우레탄의 장점을 이용하여 방향족 계열의 친수성 폴리우레탄을 외부 보호막으로 도입하여 크레아티닌 센서에 대한 연구를 수행하였다.
본 연구에서는 임상시료 내 크레아티닌 측정 시 가장 심각한 방해작용을 하는 크레아틴의 영향을 줄이기 위해 추가적인 효소층을 도입하였다. 즉, 시료 중 크레아틴은 식 (1)과 같이 크레아틴 인산화효소(creatine kinase; CK)에 의해 센서 신호에 영향을 주지 않는 크레아틴인산(phosphocreatine)으로 변형된다.
크레아티닌 바이오센서의 실제 임상 적용성을 향상시키기 위해 흐름계를 이용한 시료 주입법을 사용하고자 하였다. 이를 위해 개발된 평면형 소형 크레아티닌 센서를 흐름계 카트리지에 장착하고 시료주입구에 주사기를 연결하여 미지 시료를 측정하였다.

가설 설정

7. (A) Dynamic response and (B) calibration curves of creatinine biosensor towards (a) creatinine and (b) creatine.
2. The concept of an amperometric creatinine biosensor with reduced interference from creatine: CK, creatine kinase; ATP, adenosine triphosphate; CA, creatininase; CI, creatinase; SO, sarcosine oxidase.

제안 방법

2분 후 검정용액 2(Cal II, 크레아티닌 100 μM이 포함된 바탕용액) 700 μL를 주사기로 주입하고 2분 간 기다려 신호를 얻었다.
3. A schematic drawing of a planar-type amperometric microsensor used in this study.
Pt black(Pt-B)의 도입을 통한 센서의 감응성 증가 효과를 평가하기 위해 Pt-B을 도입한 탄소전극과 도입하지 않은 탄소전극의 효소반응의 최종 산물인 과산화수소에 대한 감응성을 비교하였다. Fig.
그 위에 다른 방해종들의 효과를 줄이기 위해 polyethyleneimine(50 wt%) 용액과 Nafion(5 wt%) 용액을 각각 3 μL씩 도포하여 anion과 cation exchanger 막을 도입하였다.
기존 크레아티닌 바이오센서에서 가장 심각한 방해 물질로 작용하는 크레아틴을 효과적으로 제거하기 위하여 creatine kinase(CK)와 adenosine triphosphate(ATP)를 사용한 효소층을 도입하였다. 제작된 크레아티닌 센서의 크레아티닌과 크레아틴의 감응성을 각각 0-1,000 μM 농도 범위에서 비교하였다(Fig.
지지체로 사용된 폴리에스테르 필름 위에 탄소 반죽(carbon paste)을 사용하여 작동전극(working electrode, 지름 4mm)과 보조전극(counter electrode)을, 은 반죽(silver paste)를 사용하여 기준전극(reference electrode)을 성형하고, 그 위에 절연층을 도입하여 제작하였다. 기준전극 부분인 Ag 전극은 0.1 M FeCl₃ 용액으로 10분간 처리하여 Ag/AgCl 전극으로 제조하였다. 전류법을 이용한 바이오센서는 센서의 감응도는 전극면적에 직접적인 영향을 받는다.
즉, 시료 중 크레아틴은 식 (1)과 같이 크레아틴 인산화효소(creatine kinase; CK)에 의해 센서 신호에 영향을 주지 않는 크레아틴인산(phosphocreatine)으로 변형된다. 따라서 센서 전극막의 상층에 CK와 adenosine triphosphate(ATP) 층을 도입하여 혈액 내 크레아틴이 효소층에 도달하기 전에 제거하는 원리를 도입하였다(Fig. 2).
크레아티닌 센서의 생체시료 측정 시 가장 심각한 방해 작용을 발생하는 물질인 크레아틴을 효과적으로 제거하기 위하여 creatine kinase(CK)와 adenosine triphosphate(ATP)를 사용한 두 번째 효소층을 도입하여 크레아틴에 대한 방해작용을 현저히 감소시켰다. 또한 평면형 소형 크레아티닌 센서를 개발하기 위해 탄소전극 표면에 Pt black(Pt-B)을 도입하여 표면적을 증가시킴으로써 전기화학적 감응 특성을 증가시킨 스크린 프린팅 방식의 Pt-B/C 전극을 제작하였다. 최적화된 소형 크레아티닌 센서를 흐름계 카트리지에 장착하여 미지시료를 측정한 결과 5% 이내의 오차 범위 내에서 우수한 정확성과 재현성을 확인하였다.
먼저 이와 같이 넓은 범위에서 센서 감응 특성을 조사하기 위해 0-1,000 μM의 크레아티닌 농도범위에서 감응성을 확인하였으며, 정상 구간에서도 좀 더 정확한 측정이 가능한지 확인하기 위하여 0-100 μM 구간에 해당하는 크레아티닌 감응을 확인하였다(Fig. 6).
2). 백금이 도금된 탄소전극 위에 비이온성 계면활성제인 Triton-X100 0.5% 용액을 전극위에 떨어뜨려 10분 간 전처리 하였다. 효소층의 도입을 위해 0.
센서가 안정화 된 후 검정용액 1(Cal I, 크레아티닌 500 μM이 포함된 바탕용액) 700 μL를 주사기로 주입하였고, 2분 간 신호를 얻었다.
크레아티닌 바이오센서의 실제 임상 적용성을 향상시키기 위해 흐름계를 이용한 시료 주입법을 사용하고자 하였다. 이를 위해 개발된 평면형 소형 크레아티닌 센서를 흐름계 카트리지에 장착하고 시료주입구에 주사기를 연결하여 미지 시료를 측정하였다. 카트리지의 주입구를 통해 바탕용액으로 사용한 50 mM NaCl이 첨가된 0.
이를 위해 염화백금산 0.3 g과 아세트산 납 0.029 g을 물 9.7 g에 녹인 용액에 탄소 전극을 담그고 Ag/AgCl 기준전극 대비 인가 전위 −0.1~0.5 V에서 주사 속도(scan rate) 50 mV/s로 처리하였다.
이를 확인하기 위해 300 μM 크레아티닌의 농도를 측정할 때 음이온성 방해종인 아스코르브산과 요산이 각각 50 μM과 200 μM 존재(혈액 내 정상농도범위) 할 때와 존재하지 않을 때의 센서신호 크기를 비교하였다.
제작된 크레아티닌 센서의 크레아티닌과 크레아틴의 감응성을 각각 0-1,000 μM 농도 범위에서 비교하였다(Fig. 7).
제조된 효소 수화겔 2 μL를 분취하여 전극 위에 떨어뜨린 후 40oC 오븐에서 20분 간 건조시켜 첫 번째 효소층(1st enzyme layer)를 고정하였다.
종래 크레아티닌 바이오센서에서 가장 심각한 방해 작용을 발생하는 물질인 크레아틴을 효과적으로 제거하기 위하여 creatine kinase(CK)와 아데노신 3인산(adenosine triphosphate; ATP) 각각 10 units과 20 mM 혼합한 수화겔 용액을 일정량(3 μL)을 도포 후 건조하여 두번째 효소층(2nd enzyme layer)을 형성하였다.
제작과정을 간단히 설명하면, 폴리에스터(polyester; PE) 기판 위에 스크린 프린팅(screen printing) 법을 이용하여 제작하였다. 지지체로 사용된 폴리에스테르 필름 위에 탄소 반죽(carbon paste)을 사용하여 작동전극(working electrode, 지름 4mm)과 보조전극(counter electrode)을, 은 반죽(silver paste)를 사용하여 기준전극(reference electrode)을 성형하고, 그 위에 절연층을 도입하여 제작하였다. 기준전극 부분인 Ag 전극은 0.
최종적으로 크레아티닌의 농도를 알고 있는 시료용액(Sample, 크레아티닌 300 μM과 크레아틴 100 μM이 포함된 바탕용액) 700 μL를 주사기로 주입한 후 2분 간 신호를 얻었고 이를 처리하여 측정값을 계산하였다(Fig. 8).
카트리지의 주입구를 통해 바탕용액으로 사용한 50 mM NaCl이 첨가된 0.05 M phosphate(pH 7.6) 완충용액 500 μL를 주사기로 주입하여 센서가 충분히 안정화 되도록 30분간 일정 전위를 유지하였다.
크레아티닌 센서의 생체시료 측정 시 가장 심각한 방해 작용을 발생하는 물질인 크레아틴을 효과적으로 제거하기 위하여 creatine kinase(CK)와 adenosine triphosphate(ATP)를 사용한 두 번째 효소층을 도입하여 크레아틴에 대한 방해작용을 현저히 감소시켰다. 또한 평면형 소형 크레아티닌 센서를 개발하기 위해 탄소전극 표면에 Pt black(Pt-B)을 도입하여 표면적을 증가시킴으로써 전기화학적 감응 특성을 증가시킨 스크린 프린팅 방식의 Pt-B/C 전극을 제작하였다.
4 참고), 다층구조 센서막이 도입된 평면형 소형 크레아티닌 바이오센서 위에 아크릴로 제작된 유로를 도입하였다. 평면형 전극체와 아크릴 유로가 완전히 접착되도록 아크릴 유로를 에폭시로 접착한 후, 12시간 이상 압착하여 센서 카트리지를 제작하였다.
효소층의 도입을 위해 0.05 M NaCl이 첨가된 0.05 M phosphate(pH 7.6) 용액 300 μL에 PVA 12 mg을 첨가하여 수화겔 용액을 제조한 후 이 용액에 creatininase(CA), creatinase(CI), sarcosine oxidase(SO)를 각각 1,500 unit을 넣어 효소 혼합 용액을 제조하였다.

대상 데이터

탄소 전극 표면에 Pt-B을 도입하기 위해 사용한 염화백금산(chloroplatinic acid; H₂PtCl₆)과 아세트산 납(lead acetate; Pb(CH₃CO₂)₂)은 Aldrich사(Milwaukee, WI, USA)의 제품을, 효소를 안정적으로 고정시키기 위한 고정막으로 사용된 친수성 폴리우레탄은 Thermedics사(Woburn, MA, USA)의 제품(AR-25-80A)을 사용하였다. Poly(vinyl alcohol)(PVA, MW. 8000-9000)과 anion exchanger인 polyethyleneimine(50 wt% solution in water), cation exchanger인 Nafion(5 wt% solution in lower aliphatic alcohols/water mixture, contains 15-20% water)은 Aldrich사의 제품을 사용하였다. 이외에 실험에 사용된 시약은 분석등급에 준하는 것을 사용하였으며, 모든 용액의 제조에는 탈이온수(18 MW·cm)를 사용하였다.
유로가 형성된 센서 카트리지(cartridge)의 제작을 위해(Fig. 4 참고), 다층구조 센서막이 도입된 평면형 소형 크레아티닌 바이오센서 위에 아크릴로 제작된 유로를 도입하였다. 평면형 전극체와 아크릴 유로가 완전히 접착되도록 아크릴 유로를 에폭시로 접착한 후, 12시간 이상 압착하여 센서 카트리지를 제작하였다.
크레아티닌 가수분해효소(creatinine amidohydrolase; creatininase, EC 3.5.2.10., 600 units/mg), 크레아틴 가수분해효소(creatine amidinohyrolase; creatinase, EC 3.5.3.3., 14.2 units/mg), 사코신 산화효소(sarcosine oxidase, EC 1.5.3.1., 31.6 units/mg), 크레아틴 인산화효소(creatine kinase), 크레아티닌(creatinine), 크레아틴(creatine), 아스코르브산(ascorbic acid), 요산(uric acid), 아세트아미노펜(acetaminophen), 아데노신 3인산(adenosine triphosphate; ATP)는 Sigma사(St. Louis, MO, USA)의 제품을 사용하였다. 탄소 전극 표면에 Pt-B을 도입하기 위해 사용한 염화백금산(chloroplatinic acid; H₂PtCl₆)과 아세트산 납(lead acetate; Pb(CH₃CO₂)₂)은 Aldrich사(Milwaukee, WI, USA)의 제품을, 효소를 안정적으로 고정시키기 위한 고정막으로 사용된 친수성 폴리우레탄은 Thermedics사(Woburn, MA, USA)의 제품(AR-25-80A)을 사용하였다.
Louis, MO, USA)의 제품을 사용하였다. 탄소 전극 표면에 Pt-B을 도입하기 위해 사용한 염화백금산(chloroplatinic acid; H₂PtCl₆)과 아세트산 납(lead acetate; Pb(CH₃CO₂)₂)은 Aldrich사(Milwaukee, WI, USA)의 제품을, 효소를 안정적으로 고정시키기 위한 고정막으로 사용된 친수성 폴리우레탄은 Thermedics사(Woburn, MA, USA)의 제품(AR-25-80A)을 사용하였다. Poly(vinyl alcohol)(PVA, MW.
탄소와 은 전극 제작을 위한 스크린 프린터(screen printer)는 Marubeni사(Tokyo, Japan)의 제품(LS-150)를 사용하였다. 전극 위에 효소층, 효소 보호층 등 용액 상의 도입에는 EFD사(East Providence, RI, USA)의 air fluid dispenser(Model 2000XL)를 사용하였다.
효소층 보호를 위해 도입되는 보호막(protecting layer)은 친수성 폴리우레탄(AR-25-80A) 20 mg을 cyclohexanone 500 μL에 녹인 용액을 6 μL 분취하여 전극 위에 떨뜨린 후 40oC 오븐에서 20분 간 건조시켜 제작하였다.

이론/모형

전극 위에 효소층, 효소 보호층 등 용액 상의 도입에는 EFD사(East Providence, RI, USA)의 air fluid dispenser(Model 2000XL)를 사용하였다. 전압전류법(voltammetry), 전류법(amperometry)을 이용한 센서의 전기화학적 특성은 CH Instruments사(Austin, TX, USA)의 Potentiostat/Galvanostat(Model 600B)를 사용하여 측정하였다.
3에 나타내었다. 제작과정을 간단히 설명하면, 폴리에스터(polyester; PE) 기판 위에 스크린 프린팅(screen printing) 법을 이용하여 제작하였다. 지지체로 사용된 폴리에스테르 필름 위에 탄소 반죽(carbon paste)을 사용하여 작동전극(working electrode, 지름 4mm)과 보조전극(counter electrode)을, 은 반죽(silver paste)를 사용하여 기준전극(reference electrode)을 성형하고, 그 위에 절연층을 도입하여 제작하였다.

성능/효과

여기서 생물학적 요소는 센서들이 일반적으로 요구하는 선택성을 위한 분자 인식 능력을 제공할 뿐 만 아니라 분석하고자 하는 대상이 전기적으로 비활성인 경우 이와 반응을 통하여 전기 화학적으로 측정이 가능한 화합물을 생성하는 역할을 수행한다.⁵⁾ 선택적인 분자 특이 인식력을 가지고 있는 생물학적 요소는 효소, 항체, 세포기관, 미생물 균체 등으로 이를 이용하여 원하는 분석 대상에 적합한 다양한 종류의 바이오센서를 쉽게 제작할 수 있다. 또한 생물학적 요소의 다양한 고정방법이나 전자전달 중간체의 사용, 혹은 화학적 촉매의 사용을 통해 보다 우수한 감응 특성과 선택성을 지니면서 방해작용 없이 분석이 가능한 전기화학적 바이오센서를 제작할 수 있다.
Fig. 5는 0.05 M phosphate(pH 7.5) 전해질에서 0-1,000 μM 농도 범위에서 과산화수소에 대한 감응성을 측정한 결과로, Pt-B을 도입한 탄소전극과 도입하지 않은 탄소전극의 감응기울기가 각각 39.29과 0.01 nA/μM로 Pt-B을 도입한 전극이 약 4000배의 과산화수소 감응성이 증가함을 관찰 할 수 있었다.
크레아티닌 센서의 감응원리에서도 알 수 있듯이 크레아틴은 크레아티닌 분해과정 중 생성되며, 시료 중에 존재하는 크레아틴과 분리 구분하여 감지하는 것이 불가능하게 된다. 결과적으로 일회용 바이오센서칩 및 스트립을 사용하여 혈중 크레아티닌 수치를 수시로 측정하고자 할 때 크레아틴의 방해작용에 의한 영향은 매우 심각한 측정상의 오차를 유발할 수 있다.
또한 크레아티닌의 정상 농도범위인 100 μM 이하의 농도범위에서도 우수한 감응특성(기울기 = −2.28 nA/μM, R2 = 0.9962)을 보였다.
이를 확인하기 위해 300 μM 크레아티닌의 농도를 측정할 때 음이온성 방해종인 아스코르브산과 요산이 각각 50 μM과 200 μM 존재(혈액 내 정상농도범위) 할 때와 존재하지 않을 때의 센서신호 크기를 비교하였다. 방해종이 존재하였을 때의 센서신호 크기가 약 6% 정도 증가하는 것을 확인하였으나, 이는 허용 오차범위 내에서의 증가라고 판단하였다.
센서는 −1.70 nA/ μM의 감응기울기를 나타냈었고, 이를 통한 계산 결과, 미지 시료의 크레아티닌 농도는 292.8 μM로 결정되었다.
이는 참값인 300 μM과 비교하여 3% 이내의 오차 범위 내에서 측정이 가능함을 나타내며, 십 여 번의 100-500 μM 크레아티닌 농도범위 내에서 반복실험에서도 5% 이내 오차의 우수한 정확성을 나타내었다.
이때 크레아티닌과 크레아틴에 대한 감응기울기는 각각 −1.85과 −0.24 nA/μM로 크레아티닌에 대한 감응성이 크레아틴에 대한 감응성 보다 7.7배 정도 더 우수함을 알 수 있었다.
7배 정도 더 우수함을 알 수 있었다. 이와 같은 결과로 임상시료 내 크레아티닌과 비슷한 농도로 존재하는 크레아틴은 더 이상 심각한 방해작용을 하지 않음을 확인할 수 있었다. 또한 아스코르브산과 요산에 대한 방해작용은 음이온 폴리머 Nafion을 도입함으로써 개선하고자 하였다.
또한 평면형 소형 크레아티닌 센서를 개발하기 위해 탄소전극 표면에 Pt black(Pt-B)을 도입하여 표면적을 증가시킴으로써 전기화학적 감응 특성을 증가시킨 스크린 프린팅 방식의 Pt-B/C 전극을 제작하였다. 최적화된 소형 크레아티닌 센서를 흐름계 카트리지에 장착하여 미지시료를 측정한 결과 5% 이내의 오차 범위 내에서 우수한 정확성과 재현성을 확인하였다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	전기화학적 바이오센서는 무엇인가?	전기화학적 바이오센서는 생물학적인 요소를 사용하여 분석대상들로부터의 분석적 정보를 전기적 신호로 알려주는 장치이다. 여기서 생물학적 요소는 센서들이 일반적으로 요구하는 선택성을 위한 분자 인식 능력을 제공할 뿐 만 아니라 분석하고자 하는 대상이 전기적으로 비활성인 경우 이와 반응을 통하여 전기 화학적으로 측정이 가능한 화합물을 생성하는 역할을 수행한다.
	크레아틴에 대한 방해작용을 감소시키기 위하여 시행한 방법은?	크레아티닌 센서의 생체시료 측정 시 가장 심각한 방해 작용을 발생하는 물질인 크레아틴을 효과적으로 제거하기 위하여 creatine kinase와 adenosine triphosphate를 사용한 두 번째 효소층을 도입하여 크레아틴에 대한 방해작용을 현저히 감소시켰다. 또한 평면형 소형 크레아티닌 센서를 개발하기 위해 탄소전극 표면에 Pt black(Pt-B)을 도입하여 표면적을 증가시킴으로써 전기화학적 감응 특성을 증가시킨 스크린 프린팅 방식의 Pt-B/C 전극을 제작하였다.
	산화효소를 이용한 전기화학적 바이오센서에서 중요한 요소는 무엇인가?	산화효소를 이용한 전류법 바이오센서에 있어서 효소반응의 최종산물인 과산화수소(hydrogen peroxide; H2O2)의 측정은 매우 중요한 요소이다. 이는 과산화수소가 많은 경우의 생화학적인 물질 분석 시 이에 사용되는 산화효소 반응의 최종 생성물이기 때문이며, 이러한 이유로 과산화수소를 생성하는 산화효소를 사용한 전류법 센서는 가장 널리 사용되고 있다.

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J. H. Shin, Y. S. Choi, H. J. Lee, S. H. Choi, J. Ha, I. J. Yoon, H. Nam, and G. S. Cha, 'A Planar Amperometric Creatinine Biosensor Employing an Insoluble Oxidizing Agent for Removing Redox-Active Interferences' Anal. Chem., 73, 5965 (2001).

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T. Tsuchida and K. Yoda, 'Multi-Enzyme Membrane Electrodes for Determination of Creatinine and Creatine in Serum' Clin. Chem., 29, 51 (1983).

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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