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문제 정의
- 또한 지표 (기능)성분과 유기오염물질을 효과적인 분석하기 위해서는 경제적인 측면과 효율성 측면을 고려했을 때 동시분석방법을 개발하여 관리할 필요가 있다. 따라서 본 연구에서는 Association of Official Analytical Chemist s(AOAC) 가이드라인 [10]에 따라 크레아틴과 유기오염물질(디시안디아마이드, 디하이드로트리아진)의 분석방법을 개발하고 분석법에 대하여 타당성을 평가함으로서 개별인정형 원료를 고시형으로 전환시 본 연구결과를 참고자료로 활용하고자 하였다.
제안 방법
- 기능 (지표)성분인 크레아틴와 유기 오염물질인 디시안디아마이드 및 디하이드로트리아진을 분석하기 위해 PDA (Photo diode array)가 장착된 Nanospace SI-2 HPLC 기기 (Shiseido Co., Japan)를 사용했으며, 양이온교환 컬럼인 Nucleosil 100-5 SA (4.6 × 250 mm, 5 µm, Bischoff, Leonberg, Germany)을 이용하여 분리하였다.
- 이동상은 2.3% 인산2수소암모늄을 1N 수산화나트륨용액으로 pH 5.5로 맞춘 후 0.5 mL/min 의 유속으로 분석했으며, 시료 주입량은 10 µL로 오븐온도는 35°C로 설정하였다.
- 서로 다른 기질의 표본시료에 대하여 최적의 분리능을 결정하기 위해서 AOAC 가이드라인 [10]의 신뢰도 특성 (reliability characteristics)에서 제안하고 있는 정확성, 반복정밀성, 측정불확도, 재현정밀성, 중간 정밀성, 정량한계, 검출한계 등을 제시하여 표현하였다.
- 또한 디하이드로트리아진의 농도범위는 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1.6, 3.2, 6.4 µg/mL 농도가 되도록 조제하였다.
- 그래서 크레아틴의 농도범위는 40.0, 60.0, 80.0, 100.0, 120.0, 250.0, 500.0 µg/mL로 했으며, 디시안디아마이드는 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1.6, 3.2, 6.4, 12.8 µg/mL로 정하였다.
- 선정된 표본시료에서 잔존하는 방해물질 (interference)을 제거함과 동시에 지표 (기능)성분을 효과적으로 추출할 수 있는 방법을 제시하며, HPLC을 이용하여 최적의 상태로 정량화 할 수 있는 정도, 즉, 분리능으로 선택성을 평가하였다.
- 표준용액을 이용하여 표본시료가 포함 될 수 있는 농도 범위를 선정하고 농도와 기기반응 시그널간의 함수 관계를 그래프로 나타내었다. 선형성의 적절성을 판단하기 위해서 결정계수 (coefficient of determination)를 나타내는데 본 연구에서는 AOAC 가이드라인 [10]에서 제안하고 있는 결정계수가 0.
- 표준용액을 이용하여 표본시료가 포함 될 수 있는 농도 범위를 선정하고 농도와 기기반응 시그널간의 함수 관계를 그래프로 나타내었다. 선형성의 적절성을 판단하기 위해서 결정계수 (coefficient of determination)를 나타내는데 본 연구에서는 AOAC 가이드라인 [10]에서 제안하고 있는 결정계수가 0.99 이상인지 확인하였다.
- 시료가 전체 시험법을 거쳐 회수되는 백분율을 보았으며, 표준물질을 시료에 첨가하여 단일 분석용액에 대해 측정하고 같은 수준 및 원래 수준의 2배 또는 3배의 표준분석물을 추가하여 확인하였다.
- 짧은 시간 내에 동일한 분석자, 시약, 장비, 기구 등 조건이 동일하게 유지되는 상태에서 서로 다른 메트릭스 (matrix), 농도, 시간에서 동시 반복을 수행하였다. 5번의 반복실험을 통해 얻어진 값으로 다양한 반복 표준 편차를 구하고 허용범위 결정은 질량백분율 (mass fraction, C)을 RSDr = C-0.
- 15의 식 [10]에 따라 결정하였다 . 이로부터 계산된 값을 측정된 반복성의 RSDr 값과 HORRATr 공식 [10]에 의해 비교하여 0.5~2.0 사이에 존재할 경우 동일한 조건에서의 반복실험에 문제가 없는지를 확인하였다.
- 분석법 검증실험의 선택성을 확인하기 위하여 표준용액과 시료용액에서의 분리도 및 머무름시간(retention time)을 확인하였다. Fig.
- 시료에 함유하거나, 존재할 것으로 예상되는 크레아틴, 디시안디아마이드 및 디하이드로트리아진의 함량이 포함될 수 있는 각각의 성분에 대하여 7개 농도의 직선성을 검토하였다. 그래서 크레아틴의 농도범위는 40.
- 4 µg/mL 농도가 되도록 조제하였다. 시험 시 나타날 수 있는 오차범위를 확인하기 위하여 각 농도에 대해서 3회 반복 실험을 수행하였다. 그 결과 결정계수(r2)가 크레아틴에서는 0.
- 전체 시료를 대표로 하는 표본시료 3개(CrM1, CrM2, CrM3)에 대하여 spiking/recovery 방법으로 회수되는 백분율을 통해 매트릭스 영향을 검토하였다. AOAC 가이드라인에서 제안하고 있는 대로 표준물질을 시료에 첨가하여 단일 분석용액에 대해 측정하고 같은 수준 및 원래 수준의 2배 및 3배의 표준 분석물을 추가하는 방법을 사용하였다 [10].
- 전체 시료를 대표로 하는 표본시료 3개(CrM1, CrM2, CrM3)에 대하여 spiking/recovery 방법으로 회수되는 백분율을 통해 매트릭스 영향을 검토하였다. AOAC 가이드라인에서 제안하고 있는 대로 표준물질을 시료에 첨가하여 단일 분석용액에 대해 측정하고 같은 수준 및 원래 수준의 2배 및 3배의 표준 분석물을 추가하는 방법을 사용하였다 [10]. 즉, 3개의 표본 시료(CrM1, CrM2, CrM3) 각각에 대하여 일정량의 시료를 채취하고 표준용액을 첨가하였을 때 최종 농도가 시료에 존재하는 함량측정값의 근사값이 되도록 첨가하였다.
- AOAC 가이드라인에서 제안하고 있는 대로 표준물질을 시료에 첨가하여 단일 분석용액에 대해 측정하고 같은 수준 및 원래 수준의 2배 및 3배의 표준 분석물을 추가하는 방법을 사용하였다 [10]. 즉, 3개의 표본 시료(CrM1, CrM2, CrM3) 각각에 대하여 일정량의 시료를 채취하고 표준용액을 첨가하였을 때 최종 농도가 시료에 존재하는 함량측정값의 근사값이 되도록 첨가하였다. 그래서 Table 1에서 보는 바와 같이 크레아틴의 경우에는 100.
- 즉, 검체 채취량을 그레아틴의 경우 962.0 mg/g×1배, 2배 및 3배로 검체를 취했으며, 디시안디아마이드 및 디하이드로트리아진은 디시안디아마이드 농도로서 0.014 mg/g×1배, 2배 및 3배를 취하여 5회 반복 수행하였다.
- 시료의 기질변화에 대한 반복 정밀성을 확인하기 위하여 다른 기질을 가지고 있는 표본시료 3개(CrM1, CrM2, CrM3)에 대하여 각각 동일한 양을 채취하고 5회 반복 측정하였다. Table 3에서 보여주고 있는 바와 같이, 그 결과 크레아틴의 경우 CrM1 시료에서는 96.
- 분석시간의 변화에 대한 반복정밀성을 확인하기 위하여 표본시료 CrM1에 대하여 0h, 24h, 48h마다 시험조작 5회 반복 측정하였다. Table 4에서 보여주고 있는 바와 같이, 그 결과 크레아틴은 0h에서는 96.
- 본 연구에서는 개별인정형 건강기능식품인 크레아틴 보충제로부터 지표성분인 크레아틴과 유기오염물질인 디시안디아마이드 및 디하이드로트리아진을 HPLC로 분석하는 방법을 마련하였고, 동 시험방법에 대하여 AOAC 가이드라인에서 제안하는 성능특성을 검증하였다 [10]. 그 결과 각각의 검출한계와 정량한계는 크레아틴의 경우 1.
대상 데이터
- 표준물질인 크레아틴 모노하이드레이트 (creatine monohydrate, CrM)와 유기오염물질인 디시안디아마이드 (dicyandiamide)는 Sigma-Aldrich사 (St. Louis, MO, USA)에서 구입했으며, 디하이드로트리아진 (dihydrotriazine)은 Alz-Chem사(Trostberg, Germany)로부터 구입하였다. 그 밖에 인산2수소암모늄 (ammonium dihydrogen phosphate)은 Merck사 (Darmstadt, Germany)로부터 구입하여 사용하였다.
- Louis, MO, USA)에서 구입했으며, 디하이드로트리아진 (dihydrotriazine)은 Alz-Chem사(Trostberg, Germany)로부터 구입하였다. 그 밖에 인산2수소암모늄 (ammonium dihydrogen phosphate)은 Merck사 (Darmstadt, Germany)로부터 구입하여 사용하였다. 본 연구에서 사용한 시료는 국내 대형마트에서 직접 구입했으며, 제형과 원산지에 따라 CrM1, CrM2 및 CrM3 로 구분하여 사용하였다.
- 그 밖에 인산2수소암모늄 (ammonium dihydrogen phosphate)은 Merck사 (Darmstadt, Germany)로부터 구입하여 사용하였다. 본 연구에서 사용한 시료는 국내 대형마트에서 직접 구입했으며, 제형과 원산지에 따라 CrM1, CrM2 및 CrM3 로 구분하여 사용하였다.
- 5 mL/min 의 유속으로 분석했으며, 시료 주입량은 10 µL로 오븐온도는 35°C로 설정하였다. 측정파장은 크레아틴은 224 nm, 디시안디아마이드는 212 nm, 다이하이드로트리아진은 237 nm로 설정하였다.
- 국내 유통·판매 중인 크레아틴 보충제에 대하여 시료를 대표할 수 있는 서로 다른 속성(제형, 원료특성 등)의 3개 제품(CrM1, CrM2, CrM3)을 선정, 구매하여 분석법 검증 실험을 수행하였다.
- 국내 유통·판매 중인 크레아틴 보충제에 대하여 시료를 대표할 수 있는 서로 다른 속성(제형, 원료특성 등)의 3개 제품(CrM1, CrM2, CrM3)을 선정, 구매하여 분석법 검증 실험을 수행하였다. 본 연구에서 사용한 시료는 모두 100% 크레아틴 모노하이드레이트로 함유된 제제로 CrM1은 국내에서 제조한 분말형태의 제품이며, CrM2는 독일에서 제조하여 분말형태를 캡슐기제로 피포 성형하여 만든 제품이고, CrM3은 국내에서 제조한 분말형태를 캡슐로 성형한 제품을 사용하였다.
- 검체량의 변화에 대한 반복 정밀성을 확인하기 위하여 표본시료 CrM1을 3개의 농도로 검체를 채취하였다. 즉, 검체 채취량을 그레아틴의 경우 962.
데이터처리
- 표본시료를 분석한 크로마토그램에서 기능 (지표)성분이 위치하는 곳의 노이즈(nosie) 값을 10회 측정값으로부터 표준편차를 구하고 그 값의 3배를 더한 값을 검출한계, 10배를 더한 값을 정량한계로 하였다. 그 결과 크레아틴의 검출한계는 1.
성능/효과
- 크레아틴을 섭취하면 체내에서 인산기(phosphate)가 붙은 인산 크레아틴(phospho-creatine)이 되는데 인산 크레아틴은 우리 몸에서 에너지를 내는 ATP의 생성에 사용되어 에너지 생성을 도와준다. 동물실험 및 인체적용연구에서 크레아틴 섭취 후, 혈액과 근육에 인산크레아틴이 증가되는 것이 확인되었으며, 실제로 운동선수를 대상으로 크레아틴의 보충효과를 비교한 연구에서 크레아틴이 숄더프레스(shoulder press), 인클라인프레스(incline press) 등의 근력운동 수행능력을 향상시키는 것이 확인되었다. 식품의약품안전처(이하 식약처)에서는 2007년 “근력 운동 시에 운동수행능력 향상에 도움을 줄 수 있습니다.
- 1에서 표준용액과 시료를 각각의 최적의 파장에서 분석한 결과 지표성분 머무름시간과 UV 스펙트럼(spectrum)이 서로 일치함을 알 수 있다. 또한 분리능(resolution, Rs) 을 확인하기 위하여 시료용액 중의 두 개의 피크의 머무름시간 t1과 t2의 분리시간차와 두 개의 피크 폭 W1과 W2를 조사한 결과 크레아틴은 1.4, 디시안디아마이드는 1.7, 디하이드로트리아진은 3.5로 나타남으로서 AOAC 가이드라인 [10]에서 제시하는 최소 1.0 이상의 분리능을 가짐을 확인하였다.
- 시험 시 나타날 수 있는 오차범위를 확인하기 위하여 각 농도에 대해서 3회 반복 실험을 수행하였다. 그 결과 결정계수(r2)가 크레아틴에서는 0.9994, 디시안디아마이드는 0.9997, 디하이드로트라아진은 0.9999 이상으로 AOAC 가이드라인 [10]에서 요구하는 결정계수 0.95 이상을 만족함을 확인하였다(Fig. 2).
- 3(3배) µg/mL가 나올 수 있도록 처리하였다. 그 결과 크레아틴의 경우 3개의 표본시료에서의 회수율이 각각 97.2~100.3%, 99.0~100.5% 및 99.2~100.9%로 나왔으며, 상대표준편차는 0.9~1.8%, 0.4~1.2%, 0.3~2.2%로 나타났다(Table 1의 상단). 디시안디아마이드의 경우는 회수율이 각각 99.
- 그리고 디시안디아마이드의 경우는 0.014 mg/g×1배 채취 시 2.4%, 2배 채취 시 1.2%, 3배 채취 시 3.7%로 모두 허용범위에 포함되는 것으로 보아 검체량 변화로 인한 반복정밀성의 영향은 크지 않다는 것을 확인하였다.
- 결국 시료 농도의 변화에 따른 반복정밀성은 960.0 mg/g×1배와 2배로 검체량을 늘리더라도 동일한 조건에서의 반복정밀실험에 문제가 없다는 것을 확인했으나, 3배로 검체량을 늘렸을 경우에는 동일한 조건에서 반복정밀실험에 문제가 있다는 것을 확인할 수 있었다.
- 7%로 나타났다(Table 1의 중간). 또한 디하이드로트리아진의 경우는 회수율이 각각 100.4~105.5%, 98.2~102.9% 및 97.2~102.1%로 나타났으며, 상대표준편차는 각각 0.8~1.4%, 0.3~2.0% 및 1.0%로 확인되었다(Table 1의 하단). 앞에서 얻은 분석결과들은 모두 높은 신뢰성을 주며 AOAC의 가이드라인에 적합한 것으로 나타났다 [10].
- 014 mg/g×1배, 2배 및 3배를 취하여 5회 반복 수행하였다. Table 2에서 보여주고 있는 바와 같이, 그 결과 크레아틴 1배 채취 시 96.2%, 2배 채취 시 97.0%, 3배 채취 시에는 97.6%로 산출되어 표본시료 중 크레아틴의 평균 함량은 96.6%가 함유되어있는 것을 확인하였다. 또한 디시안아미드는 1배 채취 시 0.
- 6%가 함유되어있는 것을 확인하였다. 또한 디시안아미드는 1배 채취 시 0.0014%, 2배 및 3배에서는 0.0013%로 산출되어 평균 0.0014%의 농도로 존재하는 것을 확인했으며, 디하이드로트리아진은 3개의 농도에서 모두 검출되지 않았다. 시료에서 측정한 함량 %를 이용하여, RSDr = C-0.
- 0014%의 농도로 존재하는 것을 확인했으며, 디하이드로트리아진은 3개의 농도에서 모두 검출되지 않았다. 시료에서 측정한 함량 %를 이용하여, RSDr = C-0.15의 공식에 따라 측정값의 1/2~2배를 산출했을 경우 AOAC 가이드라인[10]에서 제안하고 있는 허용범위는 크레아틴의 경우 0.3~1.0%, 디시안아미드는 1.3~5.4%이였다. 산출된 허용범위를 이용하여 각 농도의 상대표준편차가 허용범위에 포함되는지를 확인한 결과, 크레아틴의 경우 1배 채취 시 0.
- 4%이였다. 산출된 허용범위를 이용하여 각 농도의 상대표준편차가 허용범위에 포함되는지를 확인한 결과, 크레아틴의 경우 1배 채취 시 0.8%, 2배 채취 시 1.0%로 허용범위에 포함되었으나 3배에서는 상대표준편차 값이 허용범위를 넘는 1.9%가 나왔다. 결국 시료 농도의 변화에 따른 반복정밀성은 960.
- 그 결과 크레아틴의 검출한계는 1.09 µg/mL이고, 정량한계는 3.62 µ g/mL이였다.
- 그리고 검량선 결정계수는 크레아틴의 경우 40.0~500.0 µg/mL의 농도범위에서 0.9994이며, 디시안디아마이드는 0.1~12.8 µg/mL의 농도범위에서 0.9997, 디하이드로트리아진은 0.05~6.4 µg/mL의 범위에서 0.9999 이상의 매우 높은 상관성을 보였다.
- 그 결과 각각의 검출한계와 정량한계는 크레아틴의 경우 1.09 µg/mL, 3.62 µg/mL이며, 디시안디아마이드는 0.01 µg/mL, 0.03 µg/mL, 디하이드로트리아진은 0.08 µg/mL, 0.25 µg/mL였다.
- 0%이었다. 각 농도의 상대표준편차가 허용범위에 포함되는지를 확인한 결과 0h에서는 0.8%, 24h에서는 0.6%이었으며 , 48h에서는 0.8%로 모두 포함되며 intra-day RSD%를 확인한 결과 0.4%로 나타났다. 또한 디시안디아마이드는 0h, 24h 및 48h에서 0.
- 3%이였다. 상대표준편차가 허용범위에 포함되는지를 확인한 결과 0h~48h에서는 1.6~2.4%로 나타남으로써 모두 허용범위 내에 포함되는 것을 확인하였다.
- 9999 이상의 매우 높은 상관성을 보였다. 정확성을 확인하기 위하여 3개의 표본시료(CrM1, CrM2, CrM3)를 대상으로 함량 측정한 결과값에 동일 수준 (1배)과 2배, 3배 수준으로 크레아틴과 디시안아마이드를 첨가하였고, 디하이드로트리아진은 검출한계 수준(1배)과, 2배, 3배 수준으로 첨가하여 회수율을 측정한 결과 각각 97.2~100.9%, 95.6~106.5% 및 97.2~105.5%로 확인되었다. 또한 시료채취량, 시료기질 및 분석일의 변경에 따른 반복정밀성을 확인한 결과, AOAC 가이드라인 [10]에서 제안하는 허용범위에 모두 만족하였으나, 크레아틴의 경우 시료 채취량을 960.
- 5%로 확인되었다. 또한 시료채취량, 시료기질 및 분석일의 변경에 따른 반복정밀성을 확인한 결과, AOAC 가이드라인 [10]에서 제안하는 허용범위에 모두 만족하였으나, 크레아틴의 경우 시료 채취량을 960.0 mg/g×3배로 늘렸을 때 허용범위를 초과함으로써 시험에 사용하는 검체량은 960.0 mg/g×2배가 넘지 않는 범위에서 시험을 수행할 때 반복정밀성에 문제가 없다는 것을 확인할 수 있었다.
- 시료의 기질변화에 대한 반복 정밀성을 확인하기 위하여 다른 기질을 가지고 있는 표본시료 3개(CrM1, CrM2, CrM3)에 대하여 각각 동일한 양을 채취하고 5회 반복 측정하였다. Table 3에서 보여주고 있는 바와 같이, 그 결과 크레아틴의 경우 CrM1 시료에서는 96.2%, CrM2 시료에서는 98.6%, CrM3 시료에서는 97.9%가 산출되었고 이러한 결과 값을 이용하여 3개의 표본시료 허용범위를 확인한 결과 모두 0.3~1.0%이었다. 각 시료의 상대표준편차가 허용범위에 포함되는지를 확인한 결과, CrM1 시료는 0.
- 0%이었다. 각 시료의 상대표준편차가 허용범위에 포함되는지를 확인한 결과, CrM1 시료는 0.8%, CrM2 시료는 0.6%, CrM3 시료는 0.9%로 허용범위에 모두 포함되었다. 디시안디아마이드의 경우는 CrM1 시료에서 0.
- 4이였다. 각 시료의 상대표준편차가 허용범위에 포함되는지를 확인한 결과 CrM1 시료는 2.4%, CrM2 시료는 4.8%, CrM3 시료는 2.5%로 모두 허용범위 내에 포함되었다. 따라서 크레아틴와 디시안디아마이드분석은 서로 다른 기질을 가지고 있는 시료의 반복정밀성 측정을 했을 때 동일한 조건에서의 반복실험에 문제가 없다는 것을 확인할 수 있었다.
- 5%로 모두 허용범위 내에 포함되었다. 따라서 크레아틴와 디시안디아마이드분석은 서로 다른 기질을 가지고 있는 시료의 반복정밀성 측정을 했을 때 동일한 조건에서의 반복실험에 문제가 없다는 것을 확인할 수 있었다.
후속연구
- Alekha 등은 시중에 유통 판매중인 크레아틴 제품을 대상으로 내부표준물질 첨가법을 이용하여 고성능액체크로마토그래피 (HPLC)로 분석하는 방법을 제시했으며 [8], Moret 등은 HPLC를 이용하여 크레아틴과 유기오염물질들을 동시 분석할 수 있는 방법을 개발하였고 만족할 만한 결과 얻었다고 보고하였다[9]. 그러나 이러한 검증은 시험자, 시험환경, 시험과정 설계 등의 내외부 요인에서 발생하는 시험방법의 불완전성을 보완하기는 한계가 있다. 즉, 시험방법의 적합성 및 타당성 검토를 거침에도 불구하고 시료 기질 (matrix), 전처리 및 시험전 과정에서의 오차로 인한 결과의 차이가 발생하는 것이 불가피하다.
- 즉, 시험방법의 적합성 및 타당성 검토를 거침에도 불구하고 시료 기질 (matrix), 전처리 및 시험전 과정에서의 오차로 인한 결과의 차이가 발생하는 것이 불가피하다. 또한 지표 (기능)성분과 유기오염물질을 효과적인 분석하기 위해서는 경제적인 측면과 효율성 측면을 고려했을 때 동시분석방법을 개발하여 관리할 필요가 있다. 따라서 본 연구에서는 Association of Official Analytical Chemist s(AOAC) 가이드라인 [10]에 따라 크레아틴과 유기오염물질(디시안디아마이드, 디하이드로트리아진)의 분석방법을 개발하고 분석법에 대하여 타당성을 평가함으로서 개별인정형 원료를 고시형으로 전환시 본 연구결과를 참고자료로 활용하고자 하였다.
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