면실박으로부터 단백질을 추출한 후 단백질 가수분해효소인 Flavourzyme으로 가수분해를 실시하여 면실박 단백질 가수분해물을 얻었고, 가수분해 정도는 trinitrobenzenesulfonic acid 방법과 Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis를 통해 측정하였다. 면실박 단백질 가수분해물은 한외여과에 의하여 3 kDa 이하로 cut-off하였고, Q-Sepharos fast flow, Sephadex G-15, reversed-phase high performance liquid chromatography를 이용하여 Fe, Ca-binding 펩타이드를 분리하였다. 그 결과 철분과 칼슘 결합력이 가장 높은 분획 51을 얻을 수 있었고, 이렇게 얻어진 Fe, Ca-binding 펩타이드는 향후 기능성 식품 소재로써 활용될 수 있다고 판단된다.
면실박으로부터 단백질을 추출한 후 단백질 가수분해효소인 Flavourzyme으로 가수분해를 실시하여 면실박 단백질 가수분해물을 얻었고, 가수분해 정도는 trinitrobenzenesulfonic acid 방법과 Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis를 통해 측정하였다. 면실박 단백질 가수분해물은 한외여과에 의하여 3 kDa 이하로 cut-off하였고, Q-Sepharos fast flow, Sephadex G-15, reversed-phase high performance liquid chromatography를 이용하여 Fe, Ca-binding 펩타이드를 분리하였다. 그 결과 철분과 칼슘 결합력이 가장 높은 분획 51을 얻을 수 있었고, 이렇게 얻어진 Fe, Ca-binding 펩타이드는 향후 기능성 식품 소재로써 활용될 수 있다고 판단된다.
Isolation of iron and calcium-binding peptides derived from cottonseed meal protein (CMP) hydrolysates was investigated. The degree of hydrolysis of CMP by Flavourzyme was monitored using trinitrobenzenesulfonic acid method and sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. Enzymatic hyd...
Isolation of iron and calcium-binding peptides derived from cottonseed meal protein (CMP) hydrolysates was investigated. The degree of hydrolysis of CMP by Flavourzyme was monitored using trinitrobenzenesulfonic acid method and sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. Enzymatic hydrolysis of CMP for 12 h was sufficient for the preparation of CMP hydrolysates, and the hydrolysates were membrane-filtered under 3 kDa as a molecular weight. The filtered solution was fractionated using Q-Sepharose fast flow, Sephadex G-15, and reversed phase-high performance liquid chromatography for iron and calcium-binding peptides. As a result, F51 fraction was obtained as the best candidate for calcium and iron chelation, and the isolated iron and calcium-binding peptides can be used as functional food additives, similar to iron and calcium supplements.
Isolation of iron and calcium-binding peptides derived from cottonseed meal protein (CMP) hydrolysates was investigated. The degree of hydrolysis of CMP by Flavourzyme was monitored using trinitrobenzenesulfonic acid method and sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. Enzymatic hydrolysis of CMP for 12 h was sufficient for the preparation of CMP hydrolysates, and the hydrolysates were membrane-filtered under 3 kDa as a molecular weight. The filtered solution was fractionated using Q-Sepharose fast flow, Sephadex G-15, and reversed phase-high performance liquid chromatography for iron and calcium-binding peptides. As a result, F51 fraction was obtained as the best candidate for calcium and iron chelation, and the isolated iron and calcium-binding peptides can be used as functional food additives, similar to iron and calcium supplements.
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문제 정의
그러므로 본 연구에서는 저활용되고 있는 면실의 부산물인 면실박 단백질을 이용하여 철분과 칼슘을 chelate하는 bioactive 펩타이드를 분리하여 철분, 칼슘 제재 같은 새로운 기능성 식품 소재로 활용하고자 한다.
제안 방법
한외여과된 면실박 단백질 가수분해물은 음이온 컬럼(2.5 cm×20 cm, Q-Sepharose, Amersham Pharmacia, Sweden)를 이용하여 1.5 mL/min의 유속으로 분획하였다.
용매 B를 0–60%까지 15분 동안 상승시켜 0.5 mL/min의 유속으로 분획하였고, 214 nm에서 흡광도를 측정하여 펩타이드 분획물을 검출 하였다.
분리된 분획 중 철분과 칼슘 결합력이 가장 높은 분획을 선택하여 동결건조 하였고, Sephadex G-15 column (1.5 cm×100 cm)을 이용하여 염을 제거하였는데 이동상으로는 증류수를 사용하였고 0.8 mL/min의 유속으로 desalting하였다.
(Denmark)에서 구입하였다. 실험에 사용된 모든 시약은 analytical grade를 사용하였고, chromatography를 위한 용매는 HPLC grade를 사용하였다.
면실박 고시폴 제거 및 단백질 추출. 면실박에 함유된 고시폴의 제거는 Kuk 등(2005)의 방법을 변형하여 수행하였다. 헥산과 아세톤을 3:1(v/v)의 비율로 혼합한 용액에 면실박을 4시간 동안 교반시킨 후 상등액을 제거하였다.
헥산과 아세톤을 3:1(v/v)의 비율로 혼합한 용액에 면실박을 4시간 동안 교반시킨 후 상등액을 제거하였다. 면실박 단백질 추출은 Liadakis 등(1993)의 방법을 변형하여 수행하였다. 면실박을 증류수에 용해시킨 후, ultrasonicator (Model-GE 750, Sonics & Materials, USA)를 사용하여 단백질을 분리하였고, 3 N NaOH 로 용액을 pH 10으로 조정하여 1시간 동안 교반한 후 4,000×g 에서 20분간 원심분리하였다.
2)를 첨가한 후, 5 mM TNBS와 혼합하여 30분 반응시킨 후, 반응을 정지시키기 위하여 18 mM sodium sulfite (Na2SO4)와 2M monobasic sodium phosphate (NaH2PO4)를 첨가시켰다. Spectrophotometer를 사용하여 420 nm에서 흡광도를 측정함으로써 펩타이드 함량을 측정하였다.
, USA)을 이용하여 한외여과를 하였다. 분자량 3 kDa 이하를 취하기 위하여 ultrafiltration disc로는 Ultracel PL-3 (Millipore Co.)을 사용하였고, 얻어진 가수분해물은 동결건조하였다. 한외여과된 면실박 단백질 가수분해물은 음이온 컬럼(2.
8 mL/min의 유속으로 desalting하였다. 얻어진 펩타이드를 더 분리하기 위하여 HPLC (Waters, USA)를 사용하였다. HPLC column은 reversed-phase column (4.
단백분해 효소를 이용한 단백질의 가수분해는 효과적으로 펩타이드를 생산하는데, 이렇게 얻어진 펩타이드는 mineral-binding activity를 가진다(Korhonen 와 Pihlanto, 2006; Tessier 등, 2006). 단백질을 in vitro 가수 분해를 실시하면 bioactivity를 갖는 펩타이드를 생산하는데(Shahidi와 Zhong, 2008), 면실박 단백질로부터 생리활성 펩타이드를 얻기 위해 상업적 단백질 가수분해 효소인 Flavourzyme 의 최적 효소 활성 조건에서 12시간 동안 가수분해하였다. 시간에 따른 가수분해 정도를 측정하기 위해 2시간마다 가수분해물을 취하여 TNBS assay로 available amino group 함량 변화를 측정하였고, 또한 SDS-PAGE를 통해 가수분해 정도를 측정 하였다(Fig.
단백질을 in vitro 가수 분해를 실시하면 bioactivity를 갖는 펩타이드를 생산하는데(Shahidi와 Zhong, 2008), 면실박 단백질로부터 생리활성 펩타이드를 얻기 위해 상업적 단백질 가수분해 효소인 Flavourzyme 의 최적 효소 활성 조건에서 12시간 동안 가수분해하였다. 시간에 따른 가수분해 정도를 측정하기 위해 2시간마다 가수분해물을 취하여 TNBS assay로 available amino group 함량 변화를 측정하였고, 또한 SDS-PAGE를 통해 가수분해 정도를 측정 하였다(Fig. 1B). 그 결과, 가수분해 전에 비하여 가수분해 2시간 지난 후, available amino group 농도가 5배 증가되었고, 그후 지속적으로 농도가 증가했지만, 12시간 후에는 증가 폭이 거의 줄어들었기 때문에 반응이 종료된 것으로 판단하였다(Fig.
면실박 단백질 가수분해물로부터 철분, 칼슘 결합 펩타이드 분리. Flavourzyme에 의해 가수분해된 면실박 단백질 가수분해물을 Fe, Ca과 결합된 펩타이드 소재로 활용하기 위해서, 먼저 가수분해물의 한외여과를 통하여 분자량이 일정 크기 이하가 되도록 하였다. 한외여과로부터 단백질 가수분해물에 존재하는 고분자 물질이나 남아있는 효소들로부터 분리시켜 작은 분자량의 펩타이드를 얻을 수 있는데, 기존 연구에 따르면 금속 결합 펩타이드의 경우 3–20개의 아미노산으로 이루어진 작은 크기의 펩타이드가 체내에서 흡수율과 이용률이 높다고 보고되었기 때문에, 3 kDa 이하로 한외여과를 하였다(Korhonen과 Pihlanto, 2003; Megias 등, 2007).
012 mM). 따라서 분획 5를 동결건조 한 후 Sephadex G-15를 이용하여 염을 제거한 후, reversed-phase HPLC를 이용하여 펩타이드를 더 분획하였다(Fig. 3). 그 결과, 2개의 major peak로 분리되었고 Fe, Ca의 chelate 결합력을 측정하였더니 F51이 더높은 값을 나타내었다(Table 1).
대상 데이터
실험재료. 본 실험에 사용된 면실박은 경기도 농업기술원에서 제공 받아 사용하였다. Flavourzyme은 Novo Nordisk Co.
본 실험에 사용된 면실박은 경기도 농업기술원에서 제공 받아 사용하였다. Flavourzyme은 Novo Nordisk Co. (Denmark)에서 구입하였다. 실험에 사용된 모든 시약은 analytical grade를 사용하였고, chromatography를 위한 용매는 HPLC grade를 사용하였다.
, USA)을 이용하였다. 이동상 용매 A는 water (0.1% trifluoroacetic acid), 용매 B는 acetonitrile (0.1% trifluoroacetic acid)를 사용하였다. 용매 B를 0–60%까지 15분 동안 상승시켜 0.
한외여과로부터 단백질 가수분해물에 존재하는 고분자 물질이나 남아있는 효소들로부터 분리시켜 작은 분자량의 펩타이드를 얻을 수 있는데, 기존 연구에 따르면 금속 결합 펩타이드의 경우 3–20개의 아미노산으로 이루어진 작은 크기의 펩타이드가 체내에서 흡수율과 이용률이 높다고 보고되었기 때문에, 3 kDa 이하로 한외여과를 하였다(Korhonen과 Pihlanto, 2003; Megias 등, 2007). 한외여과 된 면실박 단백질 가수분해물은 이온교환크로마토그래피를 사용하여 분획하였다. Fe와 Ca을 결합시키기 위해서는 음전하를 띄는 펩타이드가 더 결합하기 쉽기 때문에 anion exchanger로 분리하였다(Vegarud 등, 2000).
이론/모형
침전물을 제거하기 위해 4,000×g에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻은 후 Fe 함량은 ortho-phenanthroline을 이용한 발색법(Harris, 1996)으로 측정하였고, Ca 함량은 orthocresolphthalein complexone을 이용한 발색법(Gitelman, 1967)으로 측정하였다.
펩타이드 함량 측정. 가수분해시간에 따른 펩타이드 함량을 측정하기 위하여 trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) 방법을 사용 하였다(Eklund, 1976). 시료에 0.
Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). SDS-PAGE는 Laemmli (1970)의 방법에 따라 실시하였다. 12% separating gel과 5% stacking gel을 사용하였다.
성능/효과
면실박 단백질 분자량 특성. 면실박으로부터 고시폴을 제거한후 추출된 단백질의 분자량이 주로 52 kDa 부근 2개의 주요 band로 나타났는데(Fig. 1), 기존 문헌에서도 면실박 단백질은 주로 52 kDa의 globulin으로 이루어져 있다고 보고되어서 (Tukhtaboeva 등, 2006; Sadeghi와 Shawrang, 2007), 본 연구에서 추출된 면실박 단백질의 분자량과 일치함을 확인할 수 있 었다.
1B). 그 결과, 가수분해 전에 비하여 가수분해 2시간 지난 후, available amino group 농도가 5배 증가되었고, 그후 지속적으로 농도가 증가했지만, 12시간 후에는 증가 폭이 거의 줄어들었기 때문에 반응이 종료된 것으로 판단하였다(Fig. 1A). 이러한 가수분해 결과는 기존 연구 결과들과 비교해 보았을 때 비슷한 경향을 보임을 확인할 수 있었다(Jeon 등, 2010; Lee 등 2010).
이러한 가수분해 결과는 기존 연구 결과들과 비교해 보았을 때 비슷한 경향을 보임을 확인할 수 있었다(Jeon 등, 2010; Lee 등 2010). 또한, 면실박 단백질의 가수분해 정도를 분석하기 위해서 SDS-PAGE를 실시하였는데(Fig. 1B), 가수분해 시간이 증가하면서 주요 단백질인 52 kDa의 밴드가 점차적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었는데, 이것은 면실박 단백질이 가수분해 시간이 경과함에 따라 저분자량의 펩타이드로 분해되는 것을 나타낸다.
Fe와 Ca을 결합시키기 위해서는 음전하를 띄는 펩타이드가 더 결합하기 쉽기 때문에 anion exchanger로 분리하였다(Vegarud 등, 2000). 용출 결과 5개의 major peak를 얻었고(Fig. 2), 각 분획의 peptide 양에 대한 Fe와 Ca이 결합된 정도를 비교한 결과, Fe와 Ca 모두 분획 5에서 가장 높았다(Fe, 0.002 mM; Ca, 0.012 mM). 따라서 분획 5를 동결건조 한 후 Sephadex G-15를 이용하여 염을 제거한 후, reversed-phase HPLC를 이용하여 펩타이드를 더 분획하였다(Fig.
3). 그 결과, 2개의 major peak로 분리되었고 Fe, Ca의 chelate 결합력을 측정하였더니 F51이 더높은 값을 나타내었다(Table 1).
후속연구
면실박 단백질의 구성 아미노산은 품종에 따라 근소한 차이를 보이지만, 주로 Asp, Glu, Arg의 함량이 많은 경향을 나타내는 것을 확인할 수 있다(Martinez 등, 1970; O’Mara FP 등,1997). 그러므로 면실박 단백질 가수분해물로부터 분리된 fraction 51은 Fe과 Ca 결합력이 높기에, Glu와 Asp를 포함하는 펩타이드로 추정되고, 향후 이와 관련한 연구가 더 진행되어야 한다고 판단된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
면실박의 영양학적 특징은 무엇인가?
면실박은 높은 함량의 단백질을 함유하고 있고 또한 우수한 아미노산 구성을 가지고 있어 영양학적 가치가 높다(Zhang 등, 2009). 면실은 70개국 이상에서 약 3300만 톤 정도 생산되고 있고, 대두 단백질에 이어 2번째로 중요한 식물성 단백질로 알려져 있다(Marquie와 Guilbert, 2002).
철분이 결핍되면 어떤 문제가 발생하는가?
철분은 전 세계 인구의 약 1/5이 결핍증을 가지고 있어 영양학적으로 매우 중요한 미네랄이다(Lee와 Song, 2009a). 철분이 결핍되면 빈혈을 초래할 수 있고, 또한 iron deficiency anemia 와 같은 결핍증이 발생하여 피로, 두통, 현기증, 학습능력 저하가 발생할 수 있다(Schumann 등, 2007). 그리고 칼슘은 성장기 어린이의 골격 형성과 중년층의 골다공증과 관련이 있고, 심기능, 근수축, 신경계 등에도 영향을 미친다(Jin 등, 2011).
철분과 칼슘 제재는 정제형태인 무기염류로 섭취되고 있어 체내에서 흡수가 낮은 단점이 있다. 이를 해결하기 위해 어떤 방법이 사용되고 있는가?
철분은 주로 십이지장에서 흡수되고 칼슘은 소장에서 흡수되는데, 유통 되는 대부분의 철분과 칼슘 제재는 정제형태인 무기염류로 섭취되고 있어 체내에서 흡수가 낮은 단점을 가지고 있다(Lee와 Song, 2009b). 따라서 이러한 문제점을 보완하기 위하여 철분과 칼슘의 체내에서의 흡수율을 높이고 안정성을 갖게 하기 위한 방법으로써 펩타이드에 chelate하여 흡수율을 높이는 방법이 사용된다(Shahidi와 Zhong, 2008). 현재까지 가장 연구가 많이 진행된 우유 단백질이 bioactive 펩타이드의 주요 자원이나(Dziuba 등, 1999), 저가의 식물성 단백질의 가수분해를 통하여 bioactive 펩타이드를 얻을 수 있다(Srinivas와 Prakash, 2010).
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