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문제 정의
- 따라서 본 추출물을 이용하여 3T3-L1 지방전구세포에서 호르몬 유도를 통한 지방세포 분화 억제를 확인하였고, 지방세포 분화의 중요한 전사인자로 알려진 PPARγ signaling pathway에 어떤 영향을 미치는지 확인하였다.
- 본 연구에서는 3T3-L1 지방전구세포를 이용하여 용아초 에틸아세테이트 추출물의 항비만 활성을 확인하고자 하였다. 용아초 에틸아세테이트 추출물에 의한 지방세포 분화 및 adipogenesis 저해 활성을 확인하기 위해 추출물을 3T3- L1 지방전구세포에 분화를 유도하면서 농도별(50, 100 μg/ mL)로 처리하였고, 그 결과 용아초 에틸아세테이트 추출물은 지방세포의 분화를 억제시켰다.
- 우리는 본 연구에서 전통적인 약재로도 사용가능한 천연물로 용아초 에틸아세테이트 추출물에 의한 항비만 활성 및 그의 작용 메커니즘에 관한 연구를 진행하였다. 비만은 지방세포 형성을 통한 지방질의 축적에 의해 발생한다.
- 이 같은 활성에 대한 기전을 확인하기 위해 PPARγ 전사활성과 지방세포 분화에 관여하는 유전자들의 활성을 확인해 보았다.
제안 방법
- 3T3-L1 세포를 96 well plate에 5×103/well 세포수로 분주하여 배양한 후 용아초에틸아세테이트 추출물을 각각 농도별(0, 12.5, 25, 50, 100 μg/mL)로 24시간 동안 처리하여 실험을 진행하였다.
- 3T3-L1 지방전구세포의 분화를 유도하면서 용아초 에틸아세테이트 추출물을 50, 100 μg/mL 농도로 처리하여 8일 동안 분화시킨 후 GLUT4와 adiponectin의 mRNA 발현을 확인하였다.
- HEK 293T 세포에 pGL3-PPRE luciferase reporter 유전자와 PPARγ, pRL-SV-40 플라스미드를 transfection 하여 유전자들을 하루 동안 발현시킨 후 세포에 용아초 에틸아세테이트 추출물을 50, 100 μg/mL 처리하는 실험을 진행하고 좀 더 확실한 PPARγ 유전자의 반응을 살피기 위하여 PPARγ agonist로서 지방세포로의 분화를 촉진시키는 약물인 rosiglitazone(4 μg/mL)과 함께 추출물을 24시간 동안 처리하여 추출물에 의한 PPARγ의 전사 활성 정도를 관찰하였다.
- PCR 조성은 RNA 1 μg으로 합성된 cDNA를 증류수로 1/50로 희석하여 5 μL를 사용하였고, 10 pmole primer를 각각 0.5 μL, 2X SYBR Green 10 μL, 4 μL의 증류수를 사용하여 total volume을 20 μL로 맞추었다.
- 5 μL, 2X SYBR Green 10 μL, 4 μL의 증류수를 사용하여 total volume을 20 μL로 맞추었다. Real-time PCR cycle은 초기변성은 95℃ 30초, 변성은 95℃ 5초, annealing은 60℃ 15초, 신장반응은 72℃ 10초로 하여 40 cycle을 진행했고 융해곡선은 55℃ 시작해서 95℃를 끝으로 하여 0.5℃씩 상승시키며 80번을 반응하여 원하는 형광 값을 검출했다. 형광신호 정량은 Bio-Rad MyiQ program을 사용하였다.
- pGL3-basic luciferase expression 벡터(promega)에 PPARγ response element(PPRE) 유전자와 PPARγ 유전자를 삽입하여 얻은 재조합 벡터와 control reporter로서 Renilla luciferase의 cDNA를 가지는 pRL-SV-40 프라스미드(Promega)를 HEK 293T 세포에 co-transfection 하였다.
- 5 mM IBMX, 1 μM dexamethasone, 1 μg/mL insulin)를 포함하는 10% FBS DMEM 배지로 지방세포 분화를 2일 동안 유도하였고, 배양 48시간 후, 1 μg/mL insulin이 함유된 10% FBS DMEM으로 이틀 동안 배양하였다. 그 후 2일마다 4일 동안 10% FBS DMEM 배양액으로 교체하였다. 지방세포 분화 유도 동안 용아초 에틸아세테이트 분획물을 50, 100 μg/mL의 농도로각 배양액에 처리하였고, 분화가 완성되는 시점인 8일째에 지방세포 분화 정도를 관찰하였다.
- 그러므로 용아초 에틸아세테이트 추출물에 의한 지방세포 분화 억제가 PPARγ와 C/EBPα 활성 억제를 통한 것인지를 확인하기 위해 용아초 에틸아세테이트 추출물을 3T3-L1 세포 분화를 유도하면서 농도별(50, 100 μg/mL)로 처리하였고 8일 후 real-time PCR를 실시하여 PPARγ와 C/EBPα 발현 정도를 측정하였다.
- GLUT4는 지방세포와 근육세포에서 주로 발현되는 포도당 수용체로 세포질에 분포하고 있다가 인슐린이 존재할 때 세포막으로 이동하여 glucose uptake를 원활하게 일어나도록 하는 역할을 한다(15-19). 그러므로 지방세포의 분화와 지방축적에 있어 포도당의 유입은 중요한 반응으로 이번 실험을 통해 glucose uptake에 있어 중요한 역할을 하는 GLUT4의 mRNA 발현 변화를 측정해 보았다. 또한 지방세포 특이적으로 발현되어 분비되는 adiponectin은 인슐린 민감성과 에너지 항상성 유지에 중요한 역할을 하는 호르몬으로, 기존 연구 보고에 따르면 PPARγ agonist는 3T3-L1 지방전구세포에서 adiponectin의 증가를 유도하고 이것은 PPAR response element를 통한 지방세포 분화와 관련 있다고 알려져 있다(20,21).
- 또한 luciferase assay system을 이용하여 용아초 에틸아세테이트 추출물 처리에 의한 PPARγ 전사 활성을 측정해 보았다.
- 용아초를 이용한 앞선 연구들은 항바이러스, 항산화, 항염에 대한 활성 연구가 있으나(7-9), 아직까지 여러 가지 질환과 작용메커니즘 관련 문헌은 매우 부족하다. 또한 용아초를 이용한 항비만 활성이나 그와 관련된 질환에 대한 효능을 평가한 선행연구가 거의 없으므로 본 연구자들은 최근 여러 질병의 근원이될 수 있는 비만 치료제를 천연물을 원료로 하는 연구를 진행하다 용아초를 선택하게 되었다. 우선 용아초의 에탄올 추출물을 극성에 따라 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 수포화부탄올, 물 층으로 용매 분획하여 각각 추출물을 확보하였으며, 서론에 제시한 바와 같이 용아초 분획들에 대한 Oil Red O assay를 실시하여 가장 활성이 좋은 에틸아세테이트 분획 추출물을 선택하였다.
- 용아초 추출물과 분획물의 제조로는 용아초 1 kg을 70% 에탄올 수용액 50 mL 로 실온에서 24시간 동안 추출하고 여액을 감압 농축하여 에탄올 추출물 114 g을 얻었다. 수득한 용아초 추출물에 정제수 1,000 mL을 넣고 교반하여 현탁 한 후 계통분획법에 의하여 헥산(7.6 g), 디클로로메탄(6.5 g), 에틸아세테이트 (9.5 g), 수포화부탄올(15 g) 및 물로 분획하여 각각의 용매별 추출물을 제조하였다. 이들 용매별 추출물 중 가장 좋은 활성을 나타낸 에틸아세테이트 분획물을 이용하여 실험을 진행하였다.
- 앞선 실험의 결과를 토대로 본 연구에서 항비만 활성이 가장 우수한 에틸아세테이트 추출물을 이용하여 3T3-L1 지방전구세포의 분화 억제 활성과 PPARγ, C/EBPα와 adipogenic marker인 GLUT4, adiponectin의 유전자 발현 억제 작용 등을 관찰하였다.
- 용아초 에틸아세테이트 추출물에 의한 지방세포 분화 및 adipogenesis 저해 활성을 확인하기 위해 추출물을 3T3- L1 지방전구세포에 분화를 유도하면서 농도별(50, 100 μg/ mL)로 처리하였고, 그 결과 용아초 에틸아세테이트 추출물은 지방세포의 분화를 억제시켰다.
- 용아초 에틸아세테이트 추출물에 의한 지방축적 감소가 어떤 분자생물학적 메카니즘에 의해 유도되는지 확인하기 위해 지방전구세포의 분화를 유도하면서 용아초 에틸아세테이트 추출물을 8일 동안 처리한 후 PPARγ, C/EBPα의 mRNA 발현(Fig. 3A)과 PPARγ 전사 활성 정도를 검토하였다(Fig. 3B).
- 용아초 에틸아세테이트 추출물이 지방전구세포에서 지방 세포로의 분화를 억제시키는지 확인하기 위해 3T3-L1 지방전구세포에 dexametasone, insulin, IBMX를 처리하여 지방 세포로의 분화를 유도시킨 후 분화가 유도되는 동안 세포에 용아초 에틸아세테이트 추출물 50, 100 μg/mL을 8일 동안 처리하고 Oil Red O 시약을 이용하여 염색을 실시하였다.
- 또한 용아초를 이용한 항비만 활성이나 그와 관련된 질환에 대한 효능을 평가한 선행연구가 거의 없으므로 본 연구자들은 최근 여러 질병의 근원이될 수 있는 비만 치료제를 천연물을 원료로 하는 연구를 진행하다 용아초를 선택하게 되었다. 우선 용아초의 에탄올 추출물을 극성에 따라 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 수포화부탄올, 물 층으로 용매 분획하여 각각 추출물을 확보하였으며, 서론에 제시한 바와 같이 용아초 분획들에 대한 Oil Red O assay를 실시하여 가장 활성이 좋은 에틸아세테이트 분획 추출물을 선택하였다. 따라서 본 추출물을 이용하여 3T3-L1 지방전구세포에서 호르몬 유도를 통한 지방세포 분화 억제를 확인하였고, 지방세포 분화의 중요한 전사인자로 알려진 PPARγ signaling pathway에 어떤 영향을 미치는지 확인하였다.
- 유전자들은 하루 동안 발현시킨 후 세포에 50, 100 μg/mL 용아초 에틸아세테이트 추출물과 시료에 PPARγ 유도물질인 4 μg/mL rosiglitazone를 같이 처리하여 24시간 동안 처리한 후 용아초 에틸아세테이트 추출물에 의한 PPARγ의 전사 활성 정도를 luciferase 발현 정도를 통해 관찰하였다.
- 5 g), 수포화부탄올(15 g) 및 물로 분획하여 각각의 용매별 추출물을 제조하였다. 이들 용매별 추출물 중 가장 좋은 활성을 나타낸 에틸아세테이트 분획물을 이용하여 실험을 진행하였다.
- 이에 본 연구자들은 150여종의 약용식물 library를 Oil Red O assay에 적용하여 screening을 수행한 결과 지방분화 억제활성이 가장 우수하게 판단된 식물로 용아초를 선택했으며 이 식물을 이용 용매분획을 진행하여 헥산, 디클로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올, 물에 해당하는 분획물을 습득하였다. 이 분획물들을 이용 Oil Red O assay를 실시하여 항비만 in vitro 효능을 평가한 결과 100 μg/mL를 처리한 농도에서 디클로메탄은 세포독성이 나타났고, 헥산 분획물은 63.
- 지방세포 분화 유도 동안 용아초 에틸아세테이트 분획물을 50, 100 μg/mL의 농도로각 배양액에 처리하였고, 분화가 완성되는 시점인 8일째에 지방세포 분화 정도를 관찰하였다.
- 지방전구세포는 MDI(0.5 mM IBMX, 1 μM dexamethasone, 1 μg/mL insulin)를 포함하는 10% FBS DMEM 배지로 지방세포 분화를 2일 동안 유도하였고, 배양 48시간 후, 1 μg/mL insulin이 함유된 10% FBS DMEM으로 이틀 동안 배양하였다.
- 추출된 RNA를 1 μg 사용하여 cDNA를 합성한 후 SYBR Green과 Table 1에 나타낸 PPARγ, C/EBPα, GLUT4, adiponectin primer를 이용하여 Real-time PCR을 했고 대조군 유전자로는 GAPDH를 사용하였다.
대상 데이터
- Dulbecco’s modified Eagle media(DMEM), fetal bovine serum(FBS), trypsin-EDTA 및 penicillin-streptomycin 은 WelGene사(Deagu, Korea)에서 구입하였다. Bovine calf serum(BCS), Invitrogen사(Gaithersburg, MD, USA)에서 구입하였다. Insulin, Oil Red O 염색 시약, dimethyl sulfoxide(DMSO)은 Sigma사(St.
- Dulbecco’s modified Eagle media(DMEM), fetal bovine serum(FBS), trypsin-EDTA 및 penicillin-streptomycin 은 WelGene사(Deagu, Korea)에서 구입하였다.
- Bovine calf serum(BCS), Invitrogen사(Gaithersburg, MD, USA)에서 구입하였다. Insulin, Oil Red O 염색 시약, dimethyl sulfoxide(DMSO)은 Sigma사(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였고, isobutyl methyl xanthine (IBMX), dexamethasone은 Calbiochem사(Darmstadt, Germany)에서 구입하여 사용하였다. 또한 Real-time PCR을 위해 사용한 SYBR green은 Takara사(Shiga, Japan)에서 구입하여 실험하였다.
- Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였고, isobutyl methyl xanthine (IBMX), dexamethasone은 Calbiochem사(Darmstadt, Germany)에서 구입하여 사용하였다. 또한 Real-time PCR을 위해 사용한 SYBR green은 Takara사(Shiga, Japan)에서 구입하여 실험하였다.
- 실험에 사용한 3T3-L1(CL-173) 세포는 ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)로부터 구입하였고 마우스 지방전구세포인 3T3-L1 세포는 10% BCS DMEM 배지를 넣고 37℃, 5% CO2의 조건에서 배양하였다.
- 실험에 사용한 용아초는 2009년 4월 서울시 소재 경동시장에서 구입하였으며, 경기과학기술진흥원 천연물신약연구소 천연물신약연구팀 홍성수 박사가 동정한 후 사용하였다. 표품은 경기과학기술진흥원 천연물신약연구소 천연물신약 연구팀(표본번호: G21)에 보관중이다.
데이터처리
- 본 실험결과는 평균(mean)과 표준편차(SD, standard deviation)로 표시하였고, 각 실험군과의 비교는 one-way ANOVA 통계 프로그램을 이용하여 분석한 후, p<0.05 수준에서 Duncan's multiple range test로 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- 5～100 μg/mL) for 24 hr. Cell viability was measured by the MTT assay.
- 용아초 에틸아세테이트 추출물의 세포독성 평가는 MTT 방법을 이용해 측정하였다(Fig. 1). 3T3-L1 세포를 96 well plate에 5×103/well 세포수로 분주하여 배양한 후 용아초에틸아세테이트 추출물을 각각 농도별(0, 12.
- 5℃씩 상승시키며 80번을 반응하여 원하는 형광 값을 검출했다. 형광신호 정량은 Bio-Rad MyiQ program을 사용하였다. PCR에 사용한 primer sequence는 Table 1에 나타내었다.
성능/효과
- Fig. 3A에서 보여주듯이 용아초 에틸아세테이트 추출물 처리에 따라 두 전사인자 모두의 mRNA 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었고, 특히 효과가 좋은 100 μg/ mL에서는 분화를 유도하지 않은 control과 거의 같은 수준까지 억제 활성이 있는 것을 확인할 수 있었다.
- 3T3-L1 지방전구세포의 분화를 유도하면서 용아초 에틸아세테이트 추출물을 50, 100 μg/mL 농도로 처리하여 8일 동안 분화시킨 후 GLUT4와 adiponectin의 mRNA 발현을 확인하였다. GLUT4와 adiponectin 발현을 조사한 결과 두 유전자 발현이 모두 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4). 특히 GLUT4는 50, 100 μg/mL에서 약 50%, 90% 이상 감소하였고, adiponectin은 100 μg/mL에서는 50% 이상 억제 효과를 나타냈다.
- Oil Red O 염색액을 추출한 값을 측정한 결과 용아초 에틸아세테이트 추출물 50 μg/mL 처리한 농도에서는 58%, 100 μg/mL 농도에서는 80% 정도 지방세포로의 분화 억제 효과를 보였고, Fig. 2B는 염색된 지방구를 현미경으로 관찰하여 나타낸 것으로, 분화가 유도된 control에 비해 염색된 지방구의 수가 크게 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
- 그 결과 농도에 따른 세포독성은 유발되지 않았으며 지방세포 분화 억제 활성이 있는 100 μg/mL 고농도에서도 세포독성이 나타나지 않았다.
- 그 결과 추출물을 단독으로 처리한 경우, 농도에 따라 PPARγ 활성이 다소 감소하는 것으로 나타났으나 agonist인 rosiglitazone과 함께 처리했을 시에는 단독으로 처리했을 때보다 큰 활성 억제 효과를 확인할 수 있었고, 50 μg/mL과 100μg/mL을 처리한 두 군 모두 처리를 안 한 군에 비해 30% 이상 활성이 억제되는 것을 관찰할 수 있었다.
- 다음으로 용아초 에틸아세테이트 추출물이 PPARγ와 C/EBPα의 mRNA 발현을 억제하고 PPARγ 전사 활성을 효과적으로 감소시키는 것을 증명하였다.
- 2B는 염색된 지방구를 현미경으로 관찰하여 나타낸 것으로, 분화가 유도된 control에 비해 염색된 지방구의 수가 크게 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 용아초 에틸아세테이트 추출물이 3T3- L1 지방세포 분화유도과정에 효과를 나타내어 농도 의존적으로 지방량이 축적되는 정도를 유의하게 감소시킨다는 것을 알 수 있었다.
- 또한 PPARγ와 더불어 지방세포 분화와 축적에 영향을 미치는 GLUT4와 adiponectin의 발현 억제를 증명하였다.
- 본 연구의 결과 용아초 에틸아세테이트 추출물은 3T3-L1 세포가 분화하는 동안 PPARγ와 그의 조절 인자를 타깃 하여 신호전달을 조절함으로써 분화억제 활성을 갖는 것을 확인하였다.
- 실험 결과 용아초 에틸아세테이트 추출물은 PPARγ 전사 활성을 억제시켰고 PPARγ 및 C/EBPα의 mRNA 발현을 농도 의존적으로 감소시켰으며 지방세포 분화에 관여하는 adipokine들의 발현을 조절하는 것으로 나타났다.
- 이 결과들은 용아초 에틸아세테이트 추출물의 지방분화 억제활성은 PPARγ signaling pathway의 억제에 의한 것으로 추측되며 이 추출물은 PPARγ antagonist로써 가능성을 보여주었다.
- 이 분획물들을 이용 Oil Red O assay를 실시하여 항비만 in vitro 효능을 평가한 결과 100 μg/mL를 처리한 농도에서 디클로메탄은 세포독성이 나타났고, 헥산 분획물은 63.6%, 에틸아세테이트 분획물은 84.3%, 부탄올 분획물은 47.8%, 물 분획물은 14.7% 억제 효과를 나타내었다.
후속연구
- 본 연구의 결과 용아초 에틸아세테이트 추출물은 3T3-L1 세포가 분화하는 동안 PPARγ와 그의 조절 인자를 타깃 하여 신호전달을 조절함으로써 분화억제 활성을 갖는 것을 확인하였다. 그러나 항비만 활성을 나타내는 여러 가지 반응경로가 있으므로 다른 작용기전 관련 down-stream 단백질의 활성화 및 또 다른 신호전달체계에 관한 연구는 좀 더 진행되어야 할 것으로 사료된다. 더 나아가 세포내에서의 항비만 비임상 유효성 평가뿐만 아니라 항비만 치료제 및 기능성식품으로서의 활용가치를 위한 생체 내에서의 비임상 유효성 평가도 진행하여 향후 제품화 가능성을 높이는 것이 남겨진 과제가 될 것이다.
- 그러나 항비만 활성을 나타내는 여러 가지 반응경로가 있으므로 다른 작용기전 관련 down-stream 단백질의 활성화 및 또 다른 신호전달체계에 관한 연구는 좀 더 진행되어야 할 것으로 사료된다. 더 나아가 세포내에서의 항비만 비임상 유효성 평가뿐만 아니라 항비만 치료제 및 기능성식품으로서의 활용가치를 위한 생체 내에서의 비임상 유효성 평가도 진행하여 향후 제품화 가능성을 높이는 것이 남겨진 과제가 될 것이다.
- 따라서 용아초 에틸아세테이트 추출물의 항비만 효과는 지방 생성의 주요 전사인자인 PPARγ와 C/EBPα의 유전자 발현조절을 통해 지방 분화 억제 및 지방 축적을 효과적으로 감소시키는 것으로 보이며, 효과가 있는 농도가 100 μg/mL로 천연물질로써 비교적 낮은 농도에서 효과가 나타나는 것으로 보아 항비만 소재로의 개발 가능성이 있을 것으로 사료된다.
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