건강에 대한 관심의 증가로 천연식품뿐만 아니라 산업 부산물을 이용한 기능성 소재 탐색에 대한 연구들이 활발하게 진행되고 있다. 본 연구에서는 산업 부산물인 잣송이를 이용하여 초임계 방법으로 추출을 하여 항비만 식품 소재로서의 기능성을 알아보고자 하였다. 분화된 3T3-L1 지방세포에서 잣송이 초임계 추출물이 지방의 축적 및 지방분해에 미치는 영향을 확인한 결과, 잣송이 초임계 추출물을 1, $5{\mu}g/mL$ 농도로 처리 시 세포 내 지방 축적이 억제되었고 중성지방분해 산물인 glycerol의 함량은 증가하였다. 잣송이 초임계 추출물이 지방합성 효소 및 지방분해 효소에 미치는 영향을 알아보기 위해 real-time PCR을 실시한 결과, 잣송이 초임계 추출물은 지방합성 효소인 FAS에 아무런 영향이 나타나지 않았고, 지방분해 효소인 LPL과 HSL의 유전자 발현이 증가됨에 따라 세포 내 중성지방이 지방산과 glycerol로 분해되었음을 확인하였다. 따라서 이 결과들은 잣송이 초임계 추출물이 지방조직에서의 LPL과 HSL 유전자 발현 증가를 통한 지방분해로 항비만 효과를 나타냄을 보여주고 있다. 잣송이 초임계 추출물이 항비만 생리활성을 나타내는 기능성 식품 신소재로서 개발 가능성이 있을 것으로 사료된다.
건강에 대한 관심의 증가로 천연식품뿐만 아니라 산업 부산물을 이용한 기능성 소재 탐색에 대한 연구들이 활발하게 진행되고 있다. 본 연구에서는 산업 부산물인 잣송이를 이용하여 초임계 방법으로 추출을 하여 항비만 식품 소재로서의 기능성을 알아보고자 하였다. 분화된 3T3-L1 지방세포에서 잣송이 초임계 추출물이 지방의 축적 및 지방분해에 미치는 영향을 확인한 결과, 잣송이 초임계 추출물을 1, $5{\mu}g/mL$ 농도로 처리 시 세포 내 지방 축적이 억제되었고 중성지방분해 산물인 glycerol의 함량은 증가하였다. 잣송이 초임계 추출물이 지방합성 효소 및 지방분해 효소에 미치는 영향을 알아보기 위해 real-time PCR을 실시한 결과, 잣송이 초임계 추출물은 지방합성 효소인 FAS에 아무런 영향이 나타나지 않았고, 지방분해 효소인 LPL과 HSL의 유전자 발현이 증가됨에 따라 세포 내 중성지방이 지방산과 glycerol로 분해되었음을 확인하였다. 따라서 이 결과들은 잣송이 초임계 추출물이 지방조직에서의 LPL과 HSL 유전자 발현 증가를 통한 지방분해로 항비만 효과를 나타냄을 보여주고 있다. 잣송이 초임계 추출물이 항비만 생리활성을 나타내는 기능성 식품 신소재로서 개발 가능성이 있을 것으로 사료된다.
Seeds of Korean pine cone (Pinus koraiensis) have long been consumed as an edible food in countries located in North-East Asia, On the other hand, Korean pine cone, containing various polyphenols, is discarded as a useless garbage after removing seeds. This study investigated the lipolytic effects o...
Seeds of Korean pine cone (Pinus koraiensis) have long been consumed as an edible food in countries located in North-East Asia, On the other hand, Korean pine cone, containing various polyphenols, is discarded as a useless garbage after removing seeds. This study investigated the lipolytic effects of pine cone extract in differentiated 3T3-L1 adipocytes. Intracellular lipid accumulation was measured by Oil red O staining, free glycerol release by colorimetric reaction, and expression of genes related to lipid metabolism by real-time PCR. Compared to control, pine cone extract reduced intracellular lipid accumulation by 8.8% and increased free glycerol release by 8.2% a concentration of $5{\mu}g/mL$ in differentiated 3T3-L1 adipocytes. mRNA levels of fatty acid synthesis were not significantly different between control and pine cone extract, but mRNA levels of lipoprotein lipase (LPL) and hormone-sensitive lipase (HSL) significantly increased by 38.7% and 94.1% at a concentration of $5{\mu}g/mL$, respectively. Thus, pine cone extract is suggested to have lipolytic effects through induction of LPL and HSL gene expression.
Seeds of Korean pine cone (Pinus koraiensis) have long been consumed as an edible food in countries located in North-East Asia, On the other hand, Korean pine cone, containing various polyphenols, is discarded as a useless garbage after removing seeds. This study investigated the lipolytic effects of pine cone extract in differentiated 3T3-L1 adipocytes. Intracellular lipid accumulation was measured by Oil red O staining, free glycerol release by colorimetric reaction, and expression of genes related to lipid metabolism by real-time PCR. Compared to control, pine cone extract reduced intracellular lipid accumulation by 8.8% and increased free glycerol release by 8.2% a concentration of $5{\mu}g/mL$ in differentiated 3T3-L1 adipocytes. mRNA levels of fatty acid synthesis were not significantly different between control and pine cone extract, but mRNA levels of lipoprotein lipase (LPL) and hormone-sensitive lipase (HSL) significantly increased by 38.7% and 94.1% at a concentration of $5{\mu}g/mL$, respectively. Thus, pine cone extract is suggested to have lipolytic effects through induction of LPL and HSL gene expression.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 잣 알맹이와 잣피를 제외한 나머지 부산물인 잣송이의 항비만 효과를 평가하기 위하여 3T3- L1 지방세포를 이용하여 잣송이 추출물의 지방분해 효과와 지방분해 효소인 lipoprotein lipase(LPL)와 hormonesensitive lipase(HSL) 유전자 발현에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.
건강에 대한 관심의 증가로 천연식품뿐만 아니라 산업 부산물을 이용한 기능성 소재 탐색에 대한 연구들이 활발하게 진행되고 있다. 본 연구에서는 산업 부산물인 잣송이를 이용 하여 초임계 방법으로 추출을 하여 항비만 식품 소재로서의 기능성을 알아보고자 하였다. 분화된 3T3-L1 지방세포에서 잣송이 초임계 추출물이 지방의 축적 및 지방분해에 미치는 영향을 확인한 결과, 잣송이 초임계 추출물을 1, 5 μg/mL 농도로 처리 시 세포 내 지방 축적이 억제되었고 중성지방 분해 산물인 glycerol의 함량은 증가하였다.
세포 내에 생성된 중성지방은 분화 마지막 단계까지 계속적으로 지방구를 형성하게 되는데 시간이 지날수록 지방구끼리 결합하여 그 크기가 점점 증가하게 된다. 본 연구에서는 잣송이 초임계 추출물의 지방구 감소 효과를 검증하기 위하여 형성된 지방구를 분해 또는 감소시킬 수 있는지를 측정한 것이다.
제안 방법
1 L의 초임계 추출장비에 분쇄된 잣송이 310 g을 투입한 후, energized seal로 밀봉하고 추출기의 head 부분과 본체는 clamp 체결 방식을 사용하였다. 초임계 유체로 사용된 CO2는 cylinder에서 가스 상태로 나와서 원하는 압력에 도달할 때까지 Haskel gas booster(No.
12시간 동안 배양한 후 잣송이 추출물을 5, 10, 20 μg/mL로 처리하여 24시간 동안 배양하였다.
가 유지되는 배양기에서 배양하였다. 2일마다 배양액을 교환하였고 세포가 단일 층으로 플라스크 바닥에 70% 이상 부착하면 PBS 용액을 사용하여 세포표면을 세척하였으며, 0.25% trypsin-EDTA를 첨가한 뒤 배양기에서 3분간 방치하여 세포를 분리하였다. 그 후 원심분리기(GYROZEN 416G, BMS, Seoul, Korea)를 사용하여 1,600 rpm에서 5분간 원심분리 하여 세포를 모았다.
Free glycerol reagent 800 μL와 배양액 10 μL를 혼합하여 37°C에서 5분간 반응시킨 후, iMARKTM Microplate Reader (Bio-Rad Laboratories)를 이용하여 560 nm 파장에서 optical density를 측정하였다. Glycerol 함량은 free glycerol을 표준시약으로 사용한 표준곡선을 작성함으로써 측정 하였다.
Real-time PCR 반응은 총 20 μL 내에 cDNA 2 μL와 2X SYBR mix 10 μL, forward, reverse primer는 각각 100 pmol/μL를 1 μL씩 첨가하였고, 나머지는 H2O로 채워주었다.
, Gaithersburg, MD, USA)로 제조사의 protocol에 따라 RNA 추출을 실시하였다. iScript cDNA synthesis kit (Bio-Rad Laboratories)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 유전자들의 발현을 측정하기 위하여 SYBR Green(iQ SYBR Green Supermix, Bio-Rad Laboratories)을 이용한 실시간 정량 PCR을 실시하였고, 기기는 Real-Time PCR(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 사용하였다.
그 후 MTT reagent 20 μL를 첨가하여 빛에 의한 MTT 환원을 최소화하기 위해서 호일로 빛을 차단하고 4시간 동안 반응시켰다.
Hot start를 위해 95°C에서 8분, 증폭 단계의 denaturation을 95°C에서 15초, annealing을 52°C에서 30초, extension을 72°C에서 30초간 반복하며, 각 cycle의 extension 후에 값이 기록되었다. 모든 cycle이 완료된 후 primer의 특이성을 확인하기 위해 melting curve 분석을 실시하였다. 결과의 분석은 Applied Biosystems에서 제공하는 One step system software v2.
배양액과 MTT reagent를 suction 하고 PBS 용액으로 2회 세척한 후, 각 well당 DMSO 200 μL를 첨가하여 배양기에서 용해시켰으며, 20분 후 iMARKTM Microplate Reader(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 이용하여 560 nm 파장에서 optical density를 측정하였다.
분화 중기 3일 동안 배양액을 insulin(5 μg/mL)만을 포함하는 10% FBS를 함유한 DMEM으로 매일 교환해 주었고, 분화 후기 3일 동안은 10% FBS를 함유한 DMEM 배양액으로 매일 교환해 주었다.
분화된 3T3-L1 지방세포에 잣송이 초임계 추출물을 1, 5 μg/mL 농도로 처리한 후 생성되었던 지방구에 미치는 영향을 확인하기 위해 중성지방만을 붉은색으로 염색하는 Oil red O 염색법을 통해 3T3-L1 지방세포 내 생성된 중성지방의 양을 측정한 결과를 Fig. 2, Fig. 3에 나타내었다.
그 후 formalin을 suction 하고 60% isopropanol을 넣어 바로 suction 한 후 flask를 완전히 건조시켰으며, Oil red O solution 용액을 첨가하여 60분 동안 지방구를 염색하였다. 염색 후 증류수로 4번 세척하여 지방구의 세포 내 축적을 현미경을 이용하여 관찰하였으며 사진촬영을 통해 육안으로 잣송이 추출물이 지방세포 분화에 미치는 영향을 관찰하였다 (29). 지방 정량을 위해 잘 건조된 상태에서 100% isopropanol을 첨가하여 Oil red O dye를 용출한 뒤 iMARKTM Microplate Reader(Bio-Rad Laboratories)를 이용하여 560 nm 파장에서 optical density를 측정하였다.
iScript cDNA synthesis kit (Bio-Rad Laboratories)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 유전자들의 발현을 측정하기 위하여 SYBR Green(iQ SYBR Green Supermix, Bio-Rad Laboratories)을 이용한 실시간 정량 PCR을 실시하였고, 기기는 Real-Time PCR(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 사용하였다. 각각의 유전자에 대한 PCR primer의 염기서열은 Table 1에 제시하였다.
이들 세포를 6 well plate(TPP) 에 1×105 cells/well이 되게끔 균등하게 분주하였고, 100% confluent 상태인 4일 후 10% FBS와 1% sodium pyruvate, 1% hepes, 1% NEAA mixture를 함유한 high-glucose DMEM에 adipogenic cocktail[MDI solution인 3- IBMX(0.5 mM), insulin(5 μg/mL), DEX(0.25 μM)]을 혼합 하여 분화 유도를 시작하였다.
이상의 결과를 토대로 추후 실험에는 세포가 사멸하지 않고 독성이 일어나지 않은 5 μg/mL 농도를 최대로 하여 실험에 사용 하였다.
잣송이 추출물 처리 시 지방 대사 관여 효소의 발현을 확인하기 위해 real-time PCR을 실시하였다. 지방조직을 적출하여 RNeasyⓡ Lipid Tissue Mini kit(Qiagen Sciences Inc.
염색 후 증류수로 4번 세척하여 지방구의 세포 내 축적을 현미경을 이용하여 관찰하였으며 사진촬영을 통해 육안으로 잣송이 추출물이 지방세포 분화에 미치는 영향을 관찰하였다 (29). 지방 정량을 위해 잘 건조된 상태에서 100% isopropanol을 첨가하여 Oil red O dye를 용출한 뒤 iMARKTM Microplate Reader(Bio-Rad Laboratories)를 이용하여 560 nm 파장에서 optical density를 측정하였다. 이때 100% isopropanol을 blank로 사용하였다.
잣송이 추출물 처리 시 지방 대사 관여 효소의 발현을 확인하기 위해 real-time PCR을 실시하였다. 지방조직을 적출하여 RNeasyⓡ Lipid Tissue Mini kit(Qiagen Sciences Inc., Gaithersburg, MD, USA)로 제조사의 protocol에 따라 RNA 추출을 실시하였다. iScript cDNA synthesis kit (Bio-Rad Laboratories)를 사용하여 cDNA를 합성하였다.
대상 데이터
3T3-L1 preadipocyte는 American Type Cultured Collection(ATCC; Rockville, MD, USA)에서 분주 받아 실험하였다. High-glucose Dulbeco's modified Eagle's medium(DMEM), newborn calf serum(NCS), fetal bovine serum(FBS), PBS, penicillin-streptomycin, L-glutamin, Sodium pyruvate, hepes, NEAA mixture은 Thermo Scientific(Hyclone, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에서 구입하였고, gentamicin reagent solution은 Gibco-BRL(Grand Island, NY, USA)에서 구입 하였다.
분화하기 직전의 상태인 3T3-L1 preadipocyte를 96 well plate에 1×104 cells/ well로 총 용적을 100 μL가 되도록 분주하였으며, 배양액은 10% NCS를 함유한 DMEM을 사용하였다.
1 L의 초임계 추출장비에 분쇄된 잣송이 310 g을 투입한 후, energized seal로 밀봉하고 추출기의 head 부분과 본체는 clamp 체결 방식을 사용하였다. 초임계 유체로 사용된 CO2는 cylinder에서 가스 상태로 나와서 원하는 압력에 도달할 때까지 Haskel gas booster(No. 30/75, Holiday Inn., Burbank, CA, USA)를 이용하여 압력을 높이고 150 bar에도달한 후, 추출기 내부가 일정한 압력을 유지하도록 needle valve를 조작하면서 추출물을 500 mL 가지 달린 플라스크에 포집하였다. 추출기의 온도는 자동 온도 조절이 가능한 전기히터를 사용하여 40°C로 일정하게 유지하였다.
데이터처리
Statistical analyses were performed by Duncan's multiple range tests after one-way ANOVA using SPSS software.
모든 cycle이 완료된 후 primer의 특이성을 확인하기 위해 melting curve 분석을 실시하였다. 결과의 분석은 Applied Biosystems에서 제공하는 One step system software v2.1로 분석하였다.
모든 측정항목의 결과는 평균 (mean)±표준편차(standard deviation, SD)로 표시하였고 실험군간 평균의 차이는 one-way ANOVA로 유의성을 확인한 후 Duncan's multiple range test를 이용하여 사후 검증하였으며 P<0.05 수준에서 유의성의 여부를 검증하였다.
본 실험 결과는 SPSS(Statistical Package for the Social Science, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) version 20 프로그램을 이용하여 분석하였다. 모든 측정항목의 결과는 평균 (mean)±표준편차(standard deviation, SD)로 표시하였고 실험군간 평균의 차이는 one-way ANOVA로 유의성을 확인한 후 Duncan's multiple range test를 이용하여 사후 검증하였으며 P<0.
이론/모형
본 실험에 사용한 잣송이 초임계 추출물이 지방세포에 독성을 나타내는지를 측정하기 위하여 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyl tetrazolium bromide(MTT) assay(28)를 수행하였다. MTT solution(5 mg/mL)은 PBS 에 녹인 뒤 여과하여 사용하였다.
잣송이 초임계 추출물의 3T3-L1에 대한 세포 독성을 알아보기 위하여 MTT assay를 실시하였다. 3T3-L1 세포에 대한 잣송이 초임계 추출물의 세포 생존율은 Fig.
잣송이 추출물이 지방세포의 분해과정에서 glycerol 방출량에 미치는 영향은 glycerol phosphate oxidase- TRINDER 효소반응법(30)을 적용한 free glycerol reagent를 이용하여 배양액 내 glycerol 함량을 측정하였다. 지방세포의 분해과정에서의 free glycerol을 측정하기 위해 분화 후기(11일째)에 배양액을 모아 사용하였다.
성능/효과
5, 10 μg/mL 농도에서는 세포 생존율이 100%, 95%로 세포독성은 나타나지 않았으나, 20 μg/mL 농도에서 세포 생존율이 74.5% 유의적으로 감소하였다(P<0.05).
Free glycerol 함량을 측정한 결과, 전지방세포군에 비해 지방 분화 유도군이 68.0% 유의적으로 증가하였고, 잣송이 초임계 추출물을 1 μg/mL 농도로 처리한 군은 지방 분화 유도군에 비해 35.0% 유의적으로 증가하였다(P<0.05).
HSL mRNA의 발현을 확인한 결과, 전지방세포군에 비해 지방 분화 유도군이 90.5% 유의적으로 감소하였고, 잣송이 초임계 추출물을 1 μg/mL 농도로 처리한 군은 지방 분화 유도군에 비해 69.8% 유의적으로 증가하였다(P<0.05).
LPL mRNA의 발현을 확인한 결과, 전지방세포군에 비해 지방 분화 유도군이 32.6% 증가하였으나 유의성은 나타나지 않았고, 잣송이 초임계추출물을 1 μg/mL 농도로 처리한 군은 지방 분화 유도군에 비해 18.9% 감소하였으나 유의성이 나타나지 않았다.
이러한 성분들이 HSL과 LPL 유전자를 증가시켜 지방분해 효과를 나타내는 것으로 사료된다. 결론적으로 분화된 3T3-L1 지방세포에서 잣송이 초임계 추출물의 지방분해 효과는 LPL과 HSL 지방분해 효소의 발현 증가에 의한 것으로 사료된다.
잣송이 초임계추출물이 지방합성 효소 및 지방분해 효소에 미치는 영향을 알아보기 위해 real-time PCR을 실시한 결과, 잣송이 초임계 추출물은 지방합성 효소인 FAS에 아무런 영향이 나타나지 않았고, 지방분해 효소인 LPL과 HSL의 유전자 발현이 증가됨에 따라 세포 내 중성지방이 지방산과 glycerol로 분해되었음을 확인하였다. 따라서 이 결과들은 잣송이 초임계추출물이 지방조직에서의 LPL과 HSL 유전자 발현 증가를 통한 지방분해로 항비만 효과를 나타냄을 보여주고 있다. 잣송이 초임계 추출물이 항비만 생리활성을 나타내는 기능성 식품 신소재로서 개발 가능성이 있을 것으로 사료된다.
본 연구에서 잣송이 초임계 추출물을 1, 5 μg/mL 농도로 처리한 후 FAS mRNA의 발현을 측정한 결과, 잣송이 초임계 추출물의 처리에 따른 효과는 나타나지 않았다(Fig. 5).
분화된 3T3-L1 지방세포에서 잣송이 초임계 추출물이 지방의 축적 및 지방분해에 미치는 영향을 확인한 결과, 잣송이 초임계 추출물을 1, 5 μg/mL 농도로 처리 시 세포 내 지방 축적이 억제되었고 중성지방 분해 산물인 glycerol의 함량은 증가하였다.
분화된 3T3-L1 지방세포에서 잣송이 초임계 추출물이 지방의 축적 및 지방분해에 미치는 영향을 확인한 결과, 잣송이 초임계 추출물을 1, 5 μg/mL 농도로 처리 시 세포 내 지방 축적이 억제되었고 중성지방 분해 산물인 glycerol의 함량은 증가하였다. 잣송이 초임계추출물이 지방합성 효소 및 지방분해 효소에 미치는 영향을 알아보기 위해 real-time PCR을 실시한 결과, 잣송이 초임계 추출물은 지방합성 효소인 FAS에 아무런 영향이 나타나지 않았고, 지방분해 효소인 LPL과 HSL의 유전자 발현이 증가됨에 따라 세포 내 중성지방이 지방산과 glycerol로 분해되었음을 확인하였다. 따라서 이 결과들은 잣송이 초임계추출물이 지방조직에서의 LPL과 HSL 유전자 발현 증가를 통한 지방분해로 항비만 효과를 나타냄을 보여주고 있다.
지방 축적 함량을 측정한 결과, 전지방세포군에 비해 지방 분화 유도군이 84.7% 유의적으로 증가하였고, 잣송이 초임계 추출물을 1 μg/mL 농도로 처리한 군은 지방 분화 유도군에 비해 0.8% 감소하였으나 유의성은 나타나지 않았다.
추출 종료 시점은 추출물의 무게가 증가될 때까지 최대한 진행하였다. 초임계 추출을 통해 얻어진 잣송이의 수득율은 약 4.2%로 나타났다.
후속연구
따라서 이 결과들은 잣송이 초임계추출물이 지방조직에서의 LPL과 HSL 유전자 발현 증가를 통한 지방분해로 항비만 효과를 나타냄을 보여주고 있다. 잣송이 초임계 추출물이 항비만 생리활성을 나타내는 기능성 식품 신소재로서 개발 가능성이 있을 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
비만이란?
4%로 급증하였다(1). 비만은 환경적, 유전적 및 사회적 요인 등 다양한 원인들이 관여하는 복합적 증후군으로 섭취한 에너지 중 소비되고 남은 것이 체내에 지방조직으로 과다하게 축적된 상태를 의미하며, 고 혈압, 심혈관 질환, 고지혈증, 당뇨와 같은 성인병을 일으키는 주된 원인으로 밝혀지고 있다(2,3). 이러한 비만의 예방 및 치료를 위한 방법으로는 음식 섭취의 감소, 지방 또는 단백질 대사 또는 지방과 단백질의 저장에 대한 조절, 영양소 흡수의 억제, thermogenesis 증가 등이 있다.
비만이 주원인이 되는 성인병은?
4%로 급증하였다(1). 비만은 환경적, 유전적 및 사회적 요인 등 다양한 원인들이 관여하는 복합적 증후군으로 섭취한 에너지 중 소비되고 남은 것이 체내에 지방조직으로 과다하게 축적된 상태를 의미하며, 고 혈압, 심혈관 질환, 고지혈증, 당뇨와 같은 성인병을 일으키는 주된 원인으로 밝혀지고 있다(2,3). 이러한 비만의 예방 및 치료를 위한 방법으로는 음식 섭취의 감소, 지방 또는 단백질 대사 또는 지방과 단백질의 저장에 대한 조절, 영양소 흡수의 억제, thermogenesis 증가 등이 있다.
비만치료제의 부작용은?
S. Food and Drug Administration)에서 승인된 제니칼(orlistat)은 lipase 활성을 감소시켜 지방 흡수를 억제하고 지방을 배설시키지만 장기 복용 시 지방변 및 위장 질환 등의 문제점이 있고, phentermine, diethylpropion, mazindol은 중추신경계에서의 교감신경 유사작용을 통해 식욕 억제효과가 있으나 입마름과 수면장애 등과 같은 부작용이 있다(10-13). 따라서 보다 안전하고 효과적인 항비만 물질을 개발하기 위해 천연소재를 이용한 연구가 요구되고 있다.
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