[논문]PCR-RFLP에 의한 Vibrio core group을 포함한 Vibrio 종의 구분

박진숙

doi:10.5352/jls.2012.22.2.245

PCR-RFLP에 의한 Vibrio core group을 포함한 Vibrio 종의 구분
Differentiation of Vibrio spp. including Core Group Species by PCR-RFLP 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.22 no.2 = no.142, 2012년, pp.245 - 250

초록
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Vibrio속의 core 균주(Vibrio alginolyticus, Vibrio parahaemolyticus)를 포함하여 총 6 종의 Vibrio 균주(V. fluvialis, V. proteolyticus, V. vulnificus, V. mimicus)와 Grimontia (Vibrio) hollisae의 16S rDNA를 PCR 증폭하여 Alu I, Cfo I, Dde I, Hae III, Msp I, Rsa I의 6 종의 제한효소를 처리 후 RFLP 분석을 수행하였다. 2 종의 core 균주와 V. proteolyticus는 4 종의 제한효소(Cfo I, Dde I, Msp I, Rsa I)에서 동일한 제한효소 패턴을 나타내었다. 제한효소의 패턴의 조합에 의해 6 종의 Vibrio 종은 6 개의 RFLP type으로 구분되었다. 특히 Alu I의 경우, 실험된 6 종의 Vibrio속에 대하여 각기 다른 6 개의 종 특이적 RFLP type을 나타내었다. 제한효소 패턴에 근거하여 작성한 덴드로그램에서 Vibrio core group 균주인 V. alginolyticus 와 V. parahaemolyticus는 90% 이상의 매우 높은 유사도를 나타내었다. 반면 Grimontia hollisae는 실험된 모든 제한효소 패턴에서 Vibrio속 세균과는 분명히 구분되는 RFLP type을 나타내었다. 따라서 PCR-RFLP는 제한효소를 적절히 선택한다면 Vibrio 속 세균의 신속한 구분에 여전히 유용하다.

Abstract ▼ AI-Helper

The 16S rDNA - RFLP types for six Vibrio species (V. fluvialis, V. proteolyticus, V. vulnificus, V. mimicus) including two core group members, V. alginolyticus and V. parahaemolyticu s, and Grimontia (Vibrio) hollisae were determined using PCR-RFLP analysis. Six tetrameric restriction enzymes (Alu I, Cfo I, Dde I, Hae III, Msp I, and Rsa I) were selected for RFLP analysis. V. alginolyticus, V. parahaemolyticus, and V. proteolyticus showed the same RFLP pattern following digestion with four of the six used restriction enzymes: CfoI, DdeI, MspI, and RsaI. Various restriction enzyme combinations generated digests recognizable as distinct RFLP types for each of the assayed Vibrio species. In particular, AluI single digestion produced species specific band patterns that enabled the differentiation between these Vibrio species. Dendrogram based on restriction patterns showed that two Vibrio core group members, V. alginolyticus and V. parahaemolyticus were closely related having a similarity over 90%. Although the observed RFLP pattern for Grimontia hollisae shared several common bands with other Vibrio spp., G. hollisae results were still clearly distinct from Vibrio spp. RFLP types for all restriction enzymes tested. If restriction enzymes are aptly selected, PCR-RFLP analysis is still a rapid and effective tool for differentiating Vibrio species.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

특히 Vibrio core group 균주들은 DNA-DNA relatedness 혹은 16S rDNA 염기서열에 있어서도 일반적으로 종을 규정하는 범위 내에 여러 종들이 연속적으로 분포하는 특성을 보이고 있다[4]. 따라서 본 논문에서는 일반적으로 세균 종의 동정과 계통학적 위치의 고찰에 황금율로 적용되고 있는 16S rRNA gene을 이용하여 Vibrio 종 동정에 대한 16S rDNA의 PCR- RFLP방법을 재평가하고자 하였다. 실험에 사용한 Vibrio 균주는 현재 core group 균주로 간주되는 V.
한편, 종의 구분에 있어 변별력이 낮은 것으로 평가되는 경우도 있다[18]. 따라서 본 실험에서는 Vibrio core group에 속하는 V. alginolyticus와 V. parahaemolyticus, 2종을 포함하여 V. proteolyticus, V. vulnificus, V. fluvials, V. mimicus 총 6 종의 Vibrio 균주와 참고 균주로 최근 Vibrio속에서 Grimontia속으로 옮겨진[16] Grimontia hollisae를 대상으로 6 종(Alu I, Cfo I, Dde I, Hae III, Msp I, Rsa I)의 제한효소를 이용한 RFLP 패턴 분석을 실시하여 Vibrio속 세균의 동정에 대한 16S rDNA- RFLP의 유용성을 재평가하고자 하였다.

제안 방법

parahaemolyticus를 포함하여 6 종의 Vibrio 표준 균주와 참고 균주 Grimontia(Vibrio) hollisae를 대상으로 하였다. 6 종의 제한효소를 이용하여 생성된 제한효소패턴에 근거하여(Fig. 1) 16S rDNA의 RFLP type을 분석하였다. Vibrio의 RFLP type은 각각 AluⅠ를 이용한 경우 6 개, CfoⅠ, 2 개, DdeⅠ, 3 개, HaeⅢ, 5 개, MSpⅠ, 2 개, RsaⅠ, 3 개의 type이 관찰되었다(Table 1).
6x tracking dye와 혼합하여 13 μl를 3% NuSieve agarose (FMC Bioproducts, Rockland, ME, USA)에 loading하여, 0.5x TBE buffer에서 80V로 4 시간 전기 영동한 후 EtBr (50 ng/ml)로 염색하고 Gel Logic 200 (Kodak, USA)을 이용하여 UV 하에서 관찰하여 각 균주의 밴드패턴을 확인하였다.
5 U의 Taq polymerase (Takara, Japan), 100 ng의 주형 DNA를 혼합하여 PCR 반응을 수행하였다. Perkin-Elmer DNA thermocycler (DNA thermal cycler 480, Perkin-Elmer Co., USA)를 이용하여 94℃에서 3분간 초기 변성시킨 후, 94℃에서 1 분간 변성, 60℃에서 1분간 냉각, 72℃에서 2 분간 신장, 이 과정을 30 cycle 반복 수행한 후 최종적으로 72℃에서 7 분간 신장시켰다. 증폭된 DNA의 확인을 위해서 PCR 반응액 3 μl를 취하여 1% agarose gel (Bio-Rad, USA)을 이용하여 Mupid-ex (ADVANCE, Japan)로 100 V, 25 분간 1x TAE buffer (40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA, pH 8.
증폭된 DNA의 확인을 위해서 PCR 반응액 3 μl를 취하여 1% agarose gel (Bio-Rad, USA)을 이용하여 Mupid-ex (ADVANCE, Japan)로 100 V, 25 분간 1x TAE buffer (40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA, pH 8.0)에서 전기영동 후, ethidium bromide (EtBr, 50 ng/ml)에 10 분간 염색하여 UV 하에서 1.5 kb의 DNA 단편을 확인하였다.
최종 반응량 100 μl가 되도록 10 mM Tris-HCl (pH8.3), 1.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 100 μg gelatin/ml, 200 μM dNTP, 각 oligonucleotide primer 200 nM, 2.5 U의 Taq polymerase (Takara, Japan), 100 ng의 주형 DNA를 혼합하여 PCR 반응을 수행하였다.

대상 데이터

16S rDNA의 증폭에는 27f (5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’)와 1492r (5’-TAC GGY TAC CTT GTT ACG AC-3’)의 primer 쌍을 사용하였다.
AluⅠ를 이용한 경우 실험한 6종의 Vibrio 종에 대하여 서로 다른 6개의 RFLP type (1-6)이 관찰되었다(Table 1, Fig. 1A).
PCR 산물의 RFLP 분석을 위해 4 base를 인식하는 AluⅠ, CfoⅠ, DdeⅠ, HaeⅢ, MspⅠ, RsaⅠ, 6 종의 제한효소(TaKaRa, Japan)를 사용하였다. 제한효소의 처리는 PCR 산물 15 μl, 제한효소 2 units, 10x reaction buffer 2 μl를 첨가하여 최종 20 μl로 하여 37℃에서 4 시간 반응시켰다.
Vibrio 종 동정에 대한 16S rDNA의 PCR-RFLP방법을 평가하기 위해 core group으로 알려진 V. alginolyticus 와 V. parahaemolyticus를 포함하여 6 종의 Vibrio 표준 균주와 참고 균주 Grimontia(Vibrio) hollisae를 대상으로 하였다. 6 종의 제한효소를 이용하여 생성된 제한효소패턴에 근거하여(Fig.
본 실험에서 사용한 균주는 모두 표준 균주(Type strain)로 V. alginolyticus KCTC2472^T (=ATCC17749^T)와 V. fluvialis KCTC2473^T (=ATCC33809^T)는 한국 유전자은행(Korea Collection for Type Clutures, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, Daejon, Korea)에서, V. parahaemolyticus ATCC17802^T, V. proteolyticus ATCC15338^T, V. vulnificus ATCC27562^T, V. mimicus ATCC 33653^T, Grimontia hollisae ATCC33564^T는 ATCC (American Type Cultrue Collection, Rockville, MD. USA)로부터 분양 받았으며 균주는 MB(Marine Broth, Difco, Detroit, USA) 배지를 이용하여30℃에서 1-2일간 배양하여 DNA 추출에 사용하였다.
따라서 본 논문에서는 일반적으로 세균 종의 동정과 계통학적 위치의 고찰에 황금율로 적용되고 있는 16S rRNA gene을 이용하여 Vibrio 종 동정에 대한 16S rDNA의 PCR- RFLP방법을 재평가하고자 하였다. 실험에 사용한 Vibrio 균주는 현재 core group 균주로 간주되는 V. alginolyticus, V. parahaemolyticus의 2 균주[13]와 이전의 논문에서 core group으로 간주되었던 V. proteolyticus [1,2,18]와 V. vulnificus [2]를 포함시켰으며 2003년 Vibrio속에서 Grimontia속으로 옮겨진 G. hollisae [16]를 포함하여 분류학적 특성에서 매우 유사한 균주들과 분류학적 특성에서 좀더 차이를 나타내는 균주를 대상으로 하여 Vibrio 균주 간의 PFLP type의 차이를 분석하고자 하였다.
5 kb의 DNA 단편을 확인하였다. 증폭된 DNA의 크기를 측정하기 위한 marker로는 1Kb ladder를 사용하였다.

데이터처리

RFLP type의 패턴 분석을 위해 FPQuest^TM (Bio-Rad, Belgium) software를 이용하였으며 Similarity coefficient는 Dice 방법에 의해 구하고 덴드로그램은 Neighbor-joining에 의해 작성하였다.

성능/효과

Vibrio의 RFLP type은 각각 AluⅠ를 이용한 경우 6 개, CfoⅠ, 2 개, DdeⅠ, 3 개, HaeⅢ, 5 개, MSpⅠ, 2 개, RsaⅠ, 3 개의 type이 관찰되었다(Table 1). 6 종의 Vibrio 종, 즉 V. alginolyticus V. parahaemolyticus, V. proteolyticus, V. vulnificus, V. fluviali, V. mimicus에 대한 6 종류의 효소를 이용한 제한효소패턴을 조합한 결과 총 6 개의 서로 다른 RFLP type (a-f)이 구분되었다(Table 1).
6 종의 제한효소를 이용하여 생성된 제한효소패턴(Fig. 1)에 근거하여 Vibrio 표준 균주들과 G. hollisae의 16S rDNA의 RFLP type을 분석한 결과, Vibrio의 RFLP type은 각각 CfoⅠ와 MspⅠ의 경우 2 개, DdeⅠ와 RsaⅠ의 경우 3 개, HaeⅢ, 5 개, AluⅠ를 이용한 경우 6 개의 type을 나타내어(Table 1), 6 종의 제한 효소 중 Vibrio 종의 구분에 HaeⅢ와 AluⅠ이 우수함을 알 수 있었다. 특히 AluⅠ의 경우 실험한 6 종의 Vibrio 세균 종에 대하여 6 개의 종 특이적 RFLP type을 나타내어(Table 1, Fig.
6종의 제한 효소를 이용한 Vibrio종의 RFLP 분석을 위해 FPQuest^TM (Bio-Rad, Belgium) software를 이용하여 덴드로그램을 작성한 결과 Vibrio core group으로 알려진 V. alginolyticus 와 V. parahaemolyticus는 similarity 90% 이상에서 1개의 cluster로 구분되었으며, 85% 이상 유사도에서는 V. proteolyticus와 V. vulnificus를 포함하여 하나의 cluster를 형성하였다. V.
Vibrio속의 16S rRNA gene은 높은 염기서열 유사성을 갖는 multi copy gene으로 이를 이용한 Vibrio 종의 동정이 용이하지 않음에도 불구하고[6] 본 논문에서 실험된 16S rDNA의 PCR-RFLP 방법은 Vibrio종의 구분에 있어, 적절한 제한 효소의 선택과 결과의 조합에 의해 Vibrio종의 동정에 유용함을 알 수 있었다.
1) 16S rDNA의 RFLP type을 분석하였다. Vibrio의 RFLP type은 각각 AluⅠ를 이용한 경우 6 개, CfoⅠ, 2 개, DdeⅠ, 3 개, HaeⅢ, 5 개, MSpⅠ, 2 개, RsaⅠ, 3 개의 type이 관찰되었다(Table 1). 6 종의 Vibrio 종, 즉 V.
vulnificus 의 제한효소패턴이 동일하게 나타났다. 따라서 Vibrio 균주의 구분에 있어 16S rDNA PCR-RFLP는 변별력이 매우 낮은 것으로 지적된 바 있으나[18], 본 실험 결과에 따르면 6 종의 Vibrio 균주가 6 개의 RFLP type을 나타내어 종의 구분에 매우 유용하였다. 이러한 연구 결과는 Photobacterium과 Vibrio의 구분에 있어 HhaⅠ을 이용한 PCR-RFLP가 유용하다는 연구 결과[20]와 유사하다.
1A) Vibrio 종의 동정과 일치함을 알 수 있었다. 반면 CfoⅠ, MspⅠ, DdeⅠ, RsaⅠ의 경우 종 동정에 대한 변별력은 낮았으나 6 종류의 효소를 이용한 제한효소패턴을 조합한 결과 Vibrio 6 종에 대하여 총 6 개의 서로 다른 RFLP type(a-f)으로 구분되어(Table 1), Vibrio 균주의 PCR-RFLP는 본 실험에 사용된 Vibrio 종의 동정에 유용함을 알 수 있었다.
제한효소패턴(Fig. 1)에 근거하여 덴드로그램을 작성한 결과(Fig. 2) 현재 core group 균주로 간주되는 V. alginolyticus, V. parahaemolyticus는 90% 이상의 매우 밀접한 similarity를 나타내었으며 이는 지방산 분석[10], rpoB gene [8] 및 MLSA 방법의 결과[13]와 유사한 결과였다. 이전의 논문에서[1,2,18], V.
참고 균주로 사용한 G. hollisae의 경우 본 실험에서 사용한 모든 제한 효소에서 Vibrio종과는 분명히 다른 RFLP type을 나타내었으며(Table 1), 덴드로그램(Fig. 2) 상에서 Vibrio종과 는 가장 먼 유연 관계를 나타내어 16S rDNA의 PCR- RFLP 방법이 여전히 Vibrio종의 동정에 유용함을 알 수 있었다.
참고 균주로 사용한 Grimontia hollisae의 경우, 본 실험에서 사용한 모든 제한 효소에서 Vibrio종의 그것과는 확연히 구분되는 RFLP type을 나타내었다(Table 1, Fig. 1).
hollisae의 16S rDNA의 RFLP type을 분석한 결과, Vibrio의 RFLP type은 각각 CfoⅠ와 MspⅠ의 경우 2 개, DdeⅠ와 RsaⅠ의 경우 3 개, HaeⅢ, 5 개, AluⅠ를 이용한 경우 6 개의 type을 나타내어(Table 1), 6 종의 제한 효소 중 Vibrio 종의 구분에 HaeⅢ와 AluⅠ이 우수함을 알 수 있었다. 특히 AluⅠ의 경우 실험한 6 종의 Vibrio 세균 종에 대하여 6 개의 종 특이적 RFLP type을 나타내어(Table 1, Fig. 1A) Vibrio 종의 동정과 일치함을 알 수 있었다. 반면 CfoⅠ, MspⅠ, DdeⅠ, RsaⅠ의 경우 종 동정에 대한 변별력은 낮았으나 6 종류의 효소를 이용한 제한효소패턴을 조합한 결과 Vibrio 6 종에 대하여 총 6 개의 서로 다른 RFLP type(a-f)으로 구분되어(Table 1), Vibrio 균주의 PCR-RFLP는 본 실험에 사용된 Vibrio 종의 동정에 유용함을 알 수 있었다.

후속연구

이는 16S rRNA gene과 같이 단일 유전자(single gene)가 아닌 복수 유전자(multiple gene)를 이용하는 경우이므로 보다 정확한 종 동정의 결과를 도출할 수 있을 것이다. 그러나 실제적으로 임상에 서와 같이 빠른 동정이 필요한 경우, PCR-RFLP에 의해 16S rRNA gene과 같은 단일 유전자를 대상으로 하여 종의 동정이 가능하다면 PCR-RFLP는 보다 실질적인 Vibrio 종의 동정 및 검출 방법으로 이용할 수 있을 것이다. 나아가 Vibrio 종의 많은 균주를 대상으로 동정에 유용성을 갖는 제한 효소를 선별하는 실험을 수행하고 그 결과 특정 Vibrio 종의 구분에 유용한 특정 제한 효소를 찾을 수 있다면, 종 특이적(species specific) primer 제작에 이용되는 16S rRNA gene의 신호서열과 같이, 특정 제한 효소를 이용한 PCR- RFLP는 Vibrio 종의 동정에 있어 보다 유용한 방법이 될 수 있을 것이다.
그러나 실제적으로 임상에 서와 같이 빠른 동정이 필요한 경우, PCR-RFLP에 의해 16S rRNA gene과 같은 단일 유전자를 대상으로 하여 종의 동정이 가능하다면 PCR-RFLP는 보다 실질적인 Vibrio 종의 동정 및 검출 방법으로 이용할 수 있을 것이다. 나아가 Vibrio 종의 많은 균주를 대상으로 동정에 유용성을 갖는 제한 효소를 선별하는 실험을 수행하고 그 결과 특정 Vibrio 종의 구분에 유용한 특정 제한 효소를 찾을 수 있다면, 종 특이적(species specific) primer 제작에 이용되는 16S rRNA gene의 신호서열과 같이, 특정 제한 효소를 이용한 PCR- RFLP는 Vibrio 종의 동정에 있어 보다 유용한 방법이 될 수 있을 것이다.
16S rRNA gene을 이용하는 경우, 염기서열의 높은 유사성과 multi copy gene에 기인한 이질성으로 인하여 세균 그룹에 따라 종의 동정이 어려운 경우가 보고되어 온 바[4,18], 정확한 종의 동정을 위하여 MLSA 방법[13,17] 등 특정 유전자를 복수로 이용하는 방법 등[3]이 권유되고 있다. 이는 16S rRNA gene과 같이 단일 유전자(single gene)가 아닌 복수 유전자(multiple gene)를 이용하는 경우이므로 보다 정확한 종 동정의 결과를 도출할 수 있을 것이다. 그러나 실제적으로 임상에 서와 같이 빠른 동정이 필요한 경우, PCR-RFLP에 의해 16S rRNA gene과 같은 단일 유전자를 대상으로 하여 종의 동정이 가능하다면 PCR-RFLP는 보다 실질적인 Vibrio 종의 동정 및 검출 방법으로 이용할 수 있을 것이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	hoc committee에서 세균의 종을 규명할 때 사용할 것을 권고한 방법은 무엇인가?	최근 세균의 종을 규정하는 위원회(hoc committee)에서는 DNA-DNA reassociation 대신 MLSA (multilocus sequence analysis)를 이용하는 것을 권고하고 있다. MLSA는 흔히 다섯 종류 이상의 여러 관리 유전자(housekeeping genes), 예를 들어 16S rRNA, rpoA, recA, pyrH, rpoB, rpoD, gyrB, rctB, toxR, 등의 유전자의 염기서열 차이를 이용하여 분류군 간의 유연관계를 분석하는 방법으로 최근 Pascual 등[13]은 MLSA를 수행하여 DNA-DNA reassociation 값과의 비교를 통하여 Vibrio core group의 동정에 대한 유용성을 평가하였다.
	Vibrio속의 세균의 정확한 종 수준의 동정이 어려운 까닭은 무엇인가?	Vibrio속의 세균은 그람 음성의 비브리오형 간균으로 하구, 해양 환경에 널리 분포하며 사람 혹은 어류 등에 병원성을 나타내는 세균으로[3,18] 신속한 동정이 매우 중요한 세균 그룹이다. 그러나 이 그룹 내의 종들은 표현형과 유전형이 매우 유사하여 정확한 종 수준의 동정이 매우 어려운 것으로 알려져 있다[7]. 특히 6 개의 Vibrio 종으로 구성되는 Vibrio속의 core group (V.
	Vibrio속의 core group에 속하는 것은 무엇이 있는가?	그러나 이 그룹 내의 종들은 표현형과 유전형이 매우 유사하여 정확한 종 수준의 동정이 매우 어려운 것으로 알려져 있다[7]. 특히 6 개의 Vibrio 종으로 구성되는 Vibrio속의 core group (V. alginolyticus, V. parahaemolyticus, V. harvey, V. campbellii, V. rotiferianus, 그리고 V. natriegens)은 16S rRNA gene의 유사도가 97.6% 이상, DNA-DNA 상동치(reassociation value)는 70%에 가까운 값을 나타내는 매우 밀접한 유연관계를 갖는 세균 종들로 구성되는데[2,13] 이들을 중심으로 ARDRA, RADP, RFLP, AFLP, IGS-PCR, ribotyping 등 여러 가지 분자적 방법들을 이용하여 Vibrio 종의 동정 및 검출이 시도되었으나 적용하는 방법에 따라 동정의 결과가 다른 것으로 보고되었다[3,13,18].

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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