[논문]RFLP와 DGGE에 따른 해면 Spirastrella abata 공생세균의 다양성 비교

정은지; 임춘수; 박진숙

RFLP와 DGGE에 따른 해면 Spirastrella abata 공생세균의 다양성 비교
A Comparison of Bacterial Diversity Associated with the Sponge Spirastrella abata Depending on RFLP and DGGE 원문보기

Korean journal of microbiology = 미생물학회지, v.46 no.4, 2010년, pp.366 - 374

정은지 (한남대학교 생명공학과) , 임춘수 (한남대학교 생명공학과) , 박진숙 (한남대학교 생명공학과)

초록
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비배양에 근거한 16S rDNA-DGGE fingerprinting 방법을 적용하여 공생세균 군집구조를 조사하였다. Zobell 배지와 천일염 배지를 사용하여 총 164균주를 선별하였다. 이들 균주로 부터 증폭한 16S rDNA를 제한효소 HaeIII와 MspI을 사용하여 절단한 후 각각의 다른 RFLP 패턴으로 구분하였다. RFLP패턴으로부터 유래한 16S rDNA의 염기서열 분석 결과, 알려진 염기서열들과 95% 이상의 유사도를 나타내었으며 Proteobacteria (Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria), Actinobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes의 4개의 문이 나타났으며 우점 군집은 Alphaproteobacteria였다. 해면에서 분리한 total gDNA로 부터 증폭한 16S rDNA의 DGGE 분석 결과 5개의 DGGE band가 확인 되었고, 각각의 band의 염기서열 분석 결과 알려진 염기서열들과 96% 이상의 유사도를 나타내었으며 band로부터 밝혀진 모든 서열들은 배양되지 않은 세균 클론들과 높은 상동성을 나타내었다. DGGE에 의한 공생세균 군집은 Proteobacteria (Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria), Actinobacteria, Spirochetes, Chloroflexi로 4개의 문(phylum)으로 나타났다. Spirastrella abata의 공생세균 군집에 대한 RFLP와 DGGE 적용 결과, Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Actinobacteria의 공통 세균 그룹이 발견되었으나 전체적인 공생세균 군집구조는 분석 방법에 따른 차이를 나타내었다.

Abstract ▼ AI-Helper

Culture-dependent RFLP and culture-independent DGGE were employed to investigate the bacterial community associated with the marine sponge Spirastrella abata. A total of 164 bacterial strains associated with the sponge were cultivated using Zobell and Natural sea salt media. PCR amplicons of the 16S rDNA from the bacterial strains were digested with the restriction enzymes HaeIII and MspI, and then assigned into different groups according to their restriction patterns. The 16S rDNA sequences derived from RFLP patterns showed more than 95% similarities compared with known bacterial species, and the isolates belonged to four phyla, Proteobacteria (Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria), Actinobacteria, Firmicutes, and Bacteriodetes, of which Alphaproteobacteria was dominant. DGGE fingerprinting of 16S rDNAs amplified from the sponge- derived total gDNA showed five major DGGE bands, and their sequences showed more than 96% similarities compared with available sequences. The sequences derived from DGGE bands revealed high similarity with the uncultured bacterial clones. DGGE revealed that bacterial community consisted of four phyla, including Proteobacteria (Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria), Actinobacteria, Spirochetes, and Chloroflexi. Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria, and Actinobacteria were commonly found in bacteria associated with S. abata by both RFLP and DGGE methods; however, overall bacterial community in the sponge differed depending on the analysis methods.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 해면 공생세균의 다양성 분석에 있어 방법에 따른 차이를 규명하고자 S. abata를 대상으로 배양에 기초한 PCR-RFLP법과 비배양에 기초한 PCR-DGGE법을 적용하였다. 본 연구에서 대상으로 한 S.
따라서 서로 다른 시기에 혹은 서로 다른 장소에서 채집하였을 경우 동일한 종류의 해면 일지라도 서로 다른 방법을 적용하였을 경우 분석방법 간의 차이를 규명하기 어렵다. 본 연구에서는 해면의 서식환경의 차이가 아닌 분석 방법에 따른 해면공생세균의 다양성의 차이를 파악하고자 동일한 장소에서 동시에 채집한 동종 해면을 대상으로 분석 방법을 달리하였을 경우, 공생세균 군집구조의 차이를 알아보고자 하였다. 제주도 무릉 연안에서 2010년 5월에 채집한 해양 해면 Spirastrella abata를 대상으로 해면 공생 세균의 주요 군집구조를 배양법에 기초한 PCR-RFLP와 비배양법에 기초한 16S rDNA-DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis)를 이용하여 다양성을 조사하고 결과를 비교·분석하였다.

제안 방법

16S rDNA-RFLP fingerprinting type에 따라 각각의 RFLP type 별로 1-2개의 분리 균주들을 선택하여 총 46균주의 부분 염기 서열 (500 bp 이상)을 분석하였다. 증폭된 PCR 산물은 High Pure PCR Product Purification kit (Roche, USA)를 이용하여 정제하였으며, 27f primer로 ABI PRISM 3100 automated sequencer (PE Applied Biosystems, USA)를 이용하여 염기서열을 결정하였다.
DGGE band의 염기서열 분석: 세균군집의 다양성을 분석하기 위해 DGGE band에서 DNA를 추출하여 341f와 518r을 이용하여 재증폭하여 염기서열을 분석하였다. DGGE band의 염기서열을 분석한 결과, S.
DGGE gel 상에서 분리된 band 중, 각 band를 gel에서 잘라내어 Gel Extraction kit (QIAGEN, Germany)을 이용하여 DNA를 회수하였다. 염기서열 분석을 위하여는 band로부터 회수된 DNA를 주형으로 사용하였다.
GC clamp가 추가된 341f (5′-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC CCG CCG CCC CCG CCC GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3′)와 518r (5′-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3′)의 primer쌍을 이용하여 16S rRNA gene의 V3 영역을 증폭하였다.
GeneAmp PCR system 2700 thermal cycler (Applied Biosystems, Version 2.0, USA)를 이용하여 94°C에서 3분간 초기 변성시킨 후, 94℃에서 40초간 변성, 55℃에서 40초간 냉각, 72℃에서 1분간 신장, 이 과정을 30 cycle 반복 수행한 후 최종적으로 72℃에서 10분간 신장시켰다.
GC clamp가 추가된 341f (5′-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC CCG CCG CCC CCG CCC GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3′)와 518r (5′-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3′)의 primer쌍을 이용하여 16S rRNA gene의 V3 영역을 증폭하였다. PCR 반응 혼합물의 조성은 16S rDNA의 PCR 증폭의 경우와 동일하게 하였으며 PCR 조건은 94℃에서 40초간 변성, 65℃ (1 cycle 당 0.5℃ touch down)에서 40초간 냉각, 72℃에서 1분간 신장, 이 과정을 30 cycle 반복 수행한 후 최종적으로 72℃에서 10분간 신장시켰다. 증폭된 DNA의 확인을 위해 PCR 반응액 2 μl를 취하여 2% agarose gel (Bio-Rad, USA)을 이용하여 Mupid-ex (ADVANCE, Japan)로 100 V에서 25분간 1× TAE buffer (40 mM Tris, 20 mM acetic acid, 50 mM EDTA, pH 8.
PCR 반응 혼합물의 조성은 5 μl 10× reaction buffer, 1 μl의 10 mM dNTPs, 5 unit/μl Taq polymerase (Solgent, Korea), 각각의 primer 10 pmol, 그리고 100 ng의 시료 DNA를 1 μl 첨가하여 최종 부피 50 μl이 되도록 하여 PCR 반응을 수행하였다.
Primer는 341f와 518r을 이용하여 위와 동일한 조건으로 PCR을 수행하였다. PCR 증폭 산물은 Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, USA)을 이용하여 정제한 후 염기서열 분석(Macrogen, Korea)을 의뢰하였다.
염기서열 분석을 위하여는 band로부터 회수된 DNA를 주형으로 사용하였다. Primer는 341f와 518r을 이용하여 위와 동일한 조건으로 PCR을 수행하였다. PCR 증폭 산물은 Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, USA)을 이용하여 정제한 후 염기서열 분석(Macrogen, Korea)을 의뢰하였다.
RFLP type의 염기서열 분석: RFLP 분석에 의해 30개의 type으로 나뉜, S. abata에서 분리된 세균들에 대해 각 RFLP type 별로 1-2개의 분리 균주를 선별하여 부분 염기서열을 분석하였다. 염기서열이 분석된 총 46개의 분리 균주는 모두 기존에 보고된 세균 종과 95% 이상의 유사도를 나타내었다.
RFLP 및 DGGE 결과로 얻어진 염기서열은 NCBI (the National Center for Biotechnology Information)에 등록된 염기서열을 대상으로 Blast search를 수행하였다. 각 염기서열의 alignment는 CLUSTAL W (27)를 이용하여 정렬하였고 Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.
분리된 균주들의 순수 분리를 위하여 동일한 배지에서 계대 배양하여 단일 콜로니를 얻었다. ZB 배지와 천일염 배지를 이용하여 분리한 균주 중 164균주를 무작위로 선별하여 16S rDNA의 RFLP분석을 수행하였다.
각각 10-4까지 순차 희석한 후 ZoBell (ZB) 배지(19)와 천일염 배지(Natural sea salt 10 g, Yeast extract 1 g, Agar 15 g, 1 L DW)에 100 μl씩 도말하여 25℃에서 7일간 배양하였다.
동결건조된 해면은 멸균된 막자 사발에 넣고 액체질소를 부은 후 분쇄하였으며 G-spin™ Genomic DNA Extraction kit (Intron, Korea)를 이용하여 추출한 후 DGGE를 위한 PCR 반응의 주형으로 사용하였다.
RFLP type은 각각 HaeIII를 이용한 경우 21개, MspI의 경우 27개의 type이 관찰되었다. 두 효소를 이용한 RFLP type을 조합하여 총 30개의 서로 다른 RFLP type이 구분되었다(Fig. 1 and Table 1).
반응물은 3% agarose gel (Bio-Rad, USA)을 사용하여 1× TAE buffer (40 mM Tris-acetate, 2 mM EDTA, pH 8.0)로 100 V, 30 분간 전기영동한 후 EtBr (50 ng/ml)로 염색하여 Gel Logic 200 (Kodak, USA)을 이용하여 UV 하에서 관찰하여 각 균주의 밴드유형을 확인하였다.
ZB 배지에서 169개, 천일염 배지에서 137개의 균주를 분리하였다. 분리된 균주들의 순수 분리를 위하여 동일한 배지에서 계대 배양하여 단일 콜로니를 얻었다. ZB 배지와 천일염 배지를 이용하여 분리한 균주 중 164균주를 무작위로 선별하여 16S rDNA의 RFLP분석을 수행하였다.
비배양법에 기초한 16S rDNA의 PCR-DGGE를 수행하여 S. abata의 해면 공생세균의 계통학적 다양성을 알아보았다. 해면 시료로부터 추출한 genomic DNA를 주형으로 16S rDNA gene의 V3영역을 증폭하여 194 bp의 예상된 크기의 PCR 산물을 얻었다.
2). 이 해면 종의 DGGE band가 나타내는 세균 다양성을 파악하기 위하여 16S rDNA의 부분 염기서열을 분석하였다.
Zobell 배지와 천일염 배지를 사용하여 총 164균주를 선별하였다. 이들 균주로 부터 증폭한 16S rDNA를 제한효소 HaeIII와 MspI을 사용하여 절단한 후 각각의 다른 RFLP 패턴으로 구분하였다. RFLP패턴으로부터 유래한 16S rDNA의 염기서열 분석 결과, 알려진 염기서열들과 95% 이상의 유사도를 나타내었으며 Proteobacteria (Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria), Actinobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes의 4개의 문이 나타났으며 우점 군집은 Alphaproteobacteria였다.
0)에서 전기 영동하였다. 전기 영동 후 Ethidium Bromide (50 ng/ml)로 염색하여 Gel Logic 200 (Kodak, USA)을 이용, 자외선 조사로 확인하였다. 증폭된 DNA의 크기를 확인하기 위한 marker로는 100 bp ladder (Intron, Korea)를 사용하였다.
1× TAE buffer를 사용하여 60℃, 30 V에서 1시간 안정화시킨 후 60 V로 전압을 올려 15시간 전기 영동을 수행하였다. 전기영동 후 DGGE gel은 Ethidium bromide (50 ng/ml)로 1시간 염색 후 Gel Logic 200 (Kodak, USA)을 이용, 자외선 조사로 확인하였다.
0)에서 전기영동 하였다. 전기영동 후, EtBr (ethidium bromide, 50 ng/ml)에 10 분간 염색하여 Gel Logic 200 (Kodak, USA)을 이용하여 UV하에서 약 1.5 kb 단편을 확인하였다.
제주도 무릉 연안에서 2010년 5월에 채집한 해양 해면 Spirastrella abata를 대상으로 해면 공생 세균의 주요 군집구조를 배양법에 기초한 PCR-RFLP와 비배양법에 기초한 16S rDNA-DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis)를 이용하여 다양성을 조사하고 결과를 비교·분석하였다.
증폭된 DNA의 확인을 위해 PCR 반응액 2 μl를 취하여 2% agarose gel (Bio-Rad, USA)을 이용하여 Mupid-ex (ADVANCE, Japan)로 100 V에서 25분간 1× TAE buffer (40 mM Tris, 20 mM acetic acid, 50 mM EDTA, pH 8.0)에서 전기 영동하였다.
증폭된 DNA의 확인을 위해서 PCR 반응액 3 μl를 취하여 1% agarose gel (Bio-Rad, USA)을 이용하여 Mupid-ex (ADVANCE, Japan)로 100 V, 25 분간 1× TAE buffer (40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA, pH 8.0)에서 전기영동 하였다.
16S rDNA-RFLP fingerprinting type에 따라 각각의 RFLP type 별로 1-2개의 분리 균주들을 선택하여 총 46균주의 부분 염기 서열 (500 bp 이상)을 분석하였다. 증폭된 PCR 산물은 High Pure PCR Product Purification kit (Roche, USA)를 이용하여 정제하였으며, 27f primer로 ABI PRISM 3100 automated sequencer (PE Applied Biosystems, USA)를 이용하여 염기서열을 결정하였다.
DGGE는 Bio-Rad Dcode system (Bio-Rad)을 이용하여 수행하였다(18). 증폭된 PCR 산물은 bis acrylamide (Bio-Rad)를 포함한 10% polyacrylamide를 이용하여 30%에서 70%의 농도 구배 조성(7 M urea, 40% formamide)으로 전기영동을 수행하였다. Polyacrylamide gel은 크기 20×13 (W×H cm), 두께 1 mm로 작성하여 PCR 시료는 2× loading dye와 혼합하여 40 μl의 시료를 loading하였다.
해면 S. abata의 배양 가능한 공생세균 군집구조를 16S rDNA의 PCR-RFLP 방법에 의해 조사하기 위하여 ZoBell 배지와 천일염 배지를 이용하여 총 306균주를 분리하고 분리된 균주 중 무작위로 선별된 164균주에 대하여 2종류의 제한 효소를 이용하여 16S rDNA의 RFLP type을 분석하였다. RFLP type은 각각 HaeIII를 이용한 경우 21개, MspI의 경우 27개의 type이 관찰되었다.
abata의 해면 공생세균의 계통학적 다양성을 알아보았다. 해면 시료로부터 추출한 genomic DNA를 주형으로 16S rDNA gene의 V3영역을 증폭하여 194 bp의 예상된 크기의 PCR 산물을 얻었다. S.
해면 조각을 멸균된 인공해수(ASW)로 3회 세척 후, 해면의 안쪽을 1 cm³ 크기로 잘라 인공해수 3 ml 넣어 균질화시킨 다음 10분간 초음파 처리하였다. 각각 10^-4까지 순차 희석한 후 ZoBell (ZB) 배지(19)와 천일염 배지(Natural sea salt 10 g, Yeast extract 1 g, Agar 15 g, 1 L DW)에 100 μl씩 도말하여 25℃에서 7일간 배양하였다.
해양 해면 Spirastrella abata에 대하여 배양에 근거한 PCR-RFLP와 비배양에 근거한 16S rDNA-DGGE fingerprinting 방법을 적용하여 공생세균 군집구조를 조사하였다. Zobell 배지와 천일염 배지를 사용하여 총 164균주를 선별하였다.

대상 데이터

16S rDNA의 증폭에는 27f (5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′)와 1492r (5′-TAC GGY TAC CTT GTT ACG AC-3′)의 primer 쌍을 사용하였다.
증폭된 DNA의 크기를 확인하기 위한 marker로는 100 bp ladder (Intron, Korea)를 사용하였다. GeneAmp PCR system 2700 thermal cycler (Applied Biosystems, version 2.0, USA)를 이용하였다.
PCR 산물의 RFLP 분석을 위해 2종의 제한효소 HaeIII (TaKaRa, Japan)와 MspI (TaKaRa)을 사용하였다. 증폭된 1.
ZB 배지에서 169개, 천일염 배지에서 137개의 균주를 분리하였다. 분리된 균주들의 순수 분리를 위하여 동일한 배지에서 계대 배양하여 단일 콜로니를 얻었다.
해양 해면 Spirastrella abata에 대하여 배양에 근거한 PCR-RFLP와 비배양에 근거한 16S rDNA-DGGE fingerprinting 방법을 적용하여 공생세균 군집구조를 조사하였다. Zobell 배지와 천일염 배지를 사용하여 총 164균주를 선별하였다. 이들 균주로 부터 증폭한 16S rDNA를 제한효소 HaeIII와 MspI을 사용하여 절단한 후 각각의 다른 RFLP 패턴으로 구분하였다.
본 연구에 사용한 S. abata와 조 등(3)의 연구에서 사용한 S. abata는 각각 제주도의 무릉 연안과 모슬포항에서 다른 시기에 채집된 동일한 해면 종으로 RFLP 방법에 의한 배양가능한 공생세균의 군집으로 Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria가 포함되는 것은 공통적이었으나 본 연구에 이용한 제주도 무릉연안에서 채집한 해면의 경우 Bacteroidetes 문이 추가적으로 발견되었다. 이는 본 연구에서는 서로 다른 2종류의 배양 배지를 이용하여 한 종류의 배양 배지를 이용하였던 이전의 연구 결과(3) 보다 더 다양한 세균 그룹이 검출된 것으로 파악된다.
전기 영동 후 Ethidium Bromide (50 ng/ml)로 염색하여 Gel Logic 200 (Kodak, USA)을 이용, 자외선 조사로 확인하였다. 증폭된 DNA의 크기를 확인하기 위한 marker로는 100 bp ladder (Intron, Korea)를 사용하였다. GeneAmp PCR system 2700 thermal cycler (Applied Biosystems, version 2.
해양 해면 Spirastrella abata에 공생하는 세균의 다양성을 조사하기 위하여 제주도 무릉연안에서 2010년 5월 15일에 스쿠버 다이빙을 이용하여 약 15 m 깊이의 바다에서 해면을 채집하였다. 채집한 해면은 멸균된 인공해수(ASW)로 3회 세척 후 -20℃에서 동결하여 운반 후 실험에 사용하였다.
해양 해면 Spirastrella abata에 공생하는 세균의 다양성을 조사하기 위하여 제주도 무릉연안에서 2010년 5월 15일에 스쿠버 다이빙을 이용하여 약 15 m 깊이의 바다에서 해면을 채집하였다. 채집한 해면은 멸균된 인공해수(ASW)로 3회 세척 후 -20℃에서 동결하여 운반 후 실험에 사용하였다.

데이터처리

염기서열이 분석된 총 46개의 분리 균주는 모두 기존에 보고된 세균 종과 95% 이상의 유사도를 나타내었다. 염기서열이 분석된 30개의 RFLP type은 28개의 세균 종을 나타내었으며 이 결과를 근거로 처음 RFLP 분석에 쓰여진 164균주들을 분석하고 이들의 분석 결과에 근거하여 군집의 차이를 분석하였다(Table 2 and Fig. 3). Alphaproteobacteria 39.

이론/모형

DGGE는 Bio-Rad Dcode system (Bio-Rad)을 이용하여 수행하였다(18). 증폭된 PCR 산물은 bis acrylamide (Bio-Rad)를 포함한 10% polyacrylamide를 이용하여 30%에서 70%의 농도 구배 조성(7 M urea, 40% formamide)으로 전기영동을 수행하였다.
RFLP type의 패턴 분석을 위해 FPQuest^TM (Bio-Rad, Belgium) software를 이용하였으며 Similarity coefficient는 Dice 방법에 의해 구하고 Dendrogram은 Neighbor-joining에 의해 작성하였다(3).
RFLP 및 DGGE 결과로 얻어진 염기서열은 NCBI (the National Center for Biotechnology Information)에 등록된 염기서열을 대상으로 Blast search를 수행하였다. 각 염기서열의 alignment는 CLUSTAL W (27)를 이용하여 정렬하였고 Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0 (24)을 이용하여 neighbor-joining 방법에 의해 각각의 계통수를 작성하였다. 1,000회 반복 bootstrap 분석에 의해 계통수를 확인하였다.

성능/효과

30개의 RFLP type별로 1-2개씩 중복하여 16S rDNA의 부분 염기서열(500 bp 이상)을 분석한 결과, 동일한 RFLP type은 같은 종으로 동정되어(Table 1), 2종의 제한 효소에 의한 RFLP type은 종을 구별하기 위한 간단한 수단임을 확인하였다. 또한 30개의 RFLP type은 28개의 종으로 나타나 RFLP type은 종 및 종 이하의 분류군에 적합한 분류 지표임을 알 수 있었다.
3). Alphaproteobacteria 39.6%, Gammaproteobacteria 29%, Actinobacteria 18.9%, Firmicutes 10.2%, Bacteroidetes 2.1%를 나타내었다. 가장 많은 분포를 보인 세균 종은 Proteobacteria 문에 속하는 Pseudovibrio 및 Psychrobacter이었다.
Alphaproteobacteria가 우점하는 것은 제주도 운진항에서 2006년 12월(18)과 2009년 4월(4)에 각각 채집되어 DGGE 방법에 의해 보고된 S. abata의 주요 공생세균 군집의 경우에도 Alphaproteobacteria가 우점하여 일치하는 결과를 나타내었다. 그러나 Alphaproteobacteria를 제외한 세균 군집은 각각 Deltaproteobacteria (4)와 Firmicute (18)였으며, 이러한 차이는 계절적 차이 혹은 DNA 추출 효율에 있어서의 차이를 나타낸 것으로 파악된다.
Gammaproteobacteria의 경우 29%로 나타나 Alphaproteobacteria에 이어 우점하는 세균 군집이었다. Alphaproteobacteria와 Gammaproteobacteria를 포함한 Proteobacteria 문은 총 68.6%를 차지하여 S. abata 해면에서 가장 우점하는 세균 문 (phylum)임을 알 수 있었다. Psychrobacter 속 세균은 27% 포함되어 Gammaproteobacteria 내에서 가장 우점하는 세균 속으로 나타났다.
abata에서 가장 우점하는 세균 군집으로 나타났다. Alphaproteobacteria의 Pseudovibrio 종은 15.8%로 전체 단일 세균 종 중 가장 우점하는 종이었다. 이는 조 등(3)에 의한 제주도 모슬포항에 서식하는 해면 S.
DGGE band로부터 결정된 서열들은 모두 알려진 서열들과 96%에서 100%의 상동성을 나타내었으며 모두 배양되지 않은 세균(uncultured bacteria)인 것으로 나타났다.
해면에서 분리한 total gDNA로 부터 증폭한 16S rDNA의 DGGE 분석 결과 5개의 DGGE band가 확인 되었고, 각각의 band의 염기서열 분석 결과 알려진 염기서열들과 96% 이상의 유사도를 나타내었으며 band로부터 밝혀진 모든 서열들은 배양되지 않은 세균 클론들과 높은 상동성을 나타내었다. DGGE에 의한 공생세균 군집은 Proteobacteria (Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria), Actinobacteria, Spirochetes, Chloroflexi로 4개의 문(phylum)으로 나타났다. Spirastrella abata의 공생세균 군집에 대한 RFLP와 DGGE 적용 결과, Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Actinobacteria의 공통 세균 그룹이 발견되었으나 전체적인 공생세균 군집구조는 분석 방법에 따른 차이를 나타내었다.
(FJ481347)와 100%의 상동성을 나타내었다. DS-3은 Uncultured Actinobacterium (EU819009)과 100%의 상동성을 보였으며 DS-4은 Uncultured gamma proteobacterium (EU816809)과 100%의 상동성을 보였다. DS-5는 Uncultred Spirochetes (FJ529354)와 99%의 상동성을 나타내었다.
PCR-RFLP와 PCR-DGGE에 의한 서로 다른 방법에 따른 S. abata의 공생세균 다양성을 분석한 결과, 방법에 따라 공생 세균의 군집구조에 차이를 나타냄을 확인하였다. 또한 해면 공생세균의 군집구조에 대한 연구방법에서 비배양법의 경우 DNA의 추출방법에 따라(6, 11), 배양법에서는 배양배지 혹은 배양 조건에 따라(29), 해면 공생세균의 우점 그룹이 달라진다는 연구결과들이 보고되고 있다.
abata 해면에서 가장 우점하는 세균 문 (phylum)임을 알 수 있었다. Psychrobacter 속 세균은 27% 포함되어 Gammaproteobacteria 내에서 가장 우점하는 세균 속으로 나타났다. 전체 세균군집 중 18.
이들 균주로 부터 증폭한 16S rDNA를 제한효소 HaeIII와 MspI을 사용하여 절단한 후 각각의 다른 RFLP 패턴으로 구분하였다. RFLP패턴으로부터 유래한 16S rDNA의 염기서열 분석 결과, 알려진 염기서열들과 95% 이상의 유사도를 나타내었으며 Proteobacteria (Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria), Actinobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes의 4개의 문이 나타났으며 우점 군집은 Alphaproteobacteria였다. 해면에서 분리한 total gDNA로 부터 증폭한 16S rDNA의 DGGE 분석 결과 5개의 DGGE band가 확인 되었고, 각각의 band의 염기서열 분석 결과 알려진 염기서열들과 96% 이상의 유사도를 나타내었으며 band로부터 밝혀진 모든 서열들은 배양되지 않은 세균 클론들과 높은 상동성을 나타내었다.
해면 시료로부터 추출한 genomic DNA를 주형으로 16S rDNA gene의 V3영역을 증폭하여 194 bp의 예상된 크기의 PCR 산물을 얻었다. S. abata의 DGGE band pattern 분석 결과, 총 5개의 band를 확인할 수 있었으며, DGGE는 2회 이상 수행하여 재현성이 있음을 확인하였다(Fig. 2). 이 해면 종의 DGGE band가 나타내는 세균 다양성을 파악하기 위하여 16S rDNA의 부분 염기서열을 분석하였다.
DGGE에 의한 공생세균 군집은 Proteobacteria (Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria), Actinobacteria, Spirochetes, Chloroflexi로 4개의 문(phylum)으로 나타났다. Spirastrella abata의 공생세균 군집에 대한 RFLP와 DGGE 적용 결과, Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Actinobacteria의 공통 세균 그룹이 발견되었으나 전체적인 공생세균 군집구조는 분석 방법에 따른 차이를 나타내었다.
Table 2에서 보는 바와 같이 Alphaproteobacteria는 39.6%로 나타나 S. abata에서 가장 우점하는 세균 군집으로 나타났다. Alphaproteobacteria의 Pseudovibrio 종은 15.
1%를 나타내었다. 가장 많은 분포를 보인 세균 종은 Proteobacteria 문에 속하는 Pseudovibrio 및 Psychrobacter이었다.
30개의 RFLP type별로 1-2개씩 중복하여 16S rDNA의 부분 염기서열(500 bp 이상)을 분석한 결과, 동일한 RFLP type은 같은 종으로 동정되어(Table 1), 2종의 제한 효소에 의한 RFLP type은 종을 구별하기 위한 간단한 수단임을 확인하였다. 또한 30개의 RFLP type은 28개의 종으로 나타나 RFLP type은 종 및 종 이하의 분류군에 적합한 분류 지표임을 알 수 있었다.
abata를 대상으로 배양에 기초한 PCR-RFLP법과 비배양에 기초한 PCR-DGGE법을 적용하였다. 본 연구에서 대상으로 한 S. abata의 경우, 배양가능한 공생세균 군집과 비배양에 기초한 DGGE법에 의해 밝혀진 공생세균 군집 구조를 비교한 결과, Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria 및 Actinobacteria의 그룹이 공통적으로 존재하였다. 한편, PCR-RFLP 방법에 의한 경우, Firmicutes와 Bacteriodetes, 비배양에 기초한 PCR-DGGE에 의한 경우, Chloroflexi와 Spirochetes가 발견되어 방법에 따른 군집 구조의 차이를 나타내었다.
비배양법에 기초한 DGGE에 의한 fingerprinting 패턴에 의해 16S rDNA 염기서열로부터 공생세균의 다양성을 분석한 결과, S. abata의 전체 세균 군집 구조는 Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Actinobacteria, Chloroflexi, Spirochetes로 구성되었다. 일반적으로 배양 가능한 공생세균 중 우점하는 세균군집으로 알려진 Proteobacteria (Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria)를 비롯하여 배양에 기초한 RFLP의 결과에서는 나타나지 않은 Chloroflexi, Spirochetes를 포함하여 총 4개의 문(phylum)에 속하는 세균 군집이 나타났다(Fig.
abata에서 분리된 세균들에 대해 각 RFLP type 별로 1-2개의 분리 균주를 선별하여 부분 염기서열을 분석하였다. 염기서열이 분석된 총 46개의 분리 균주는 모두 기존에 보고된 세균 종과 95% 이상의 유사도를 나타내었다. 염기서열이 분석된 30개의 RFLP type은 28개의 세균 종을 나타내었으며 이 결과를 근거로 처음 RFLP 분석에 쓰여진 164균주들을 분석하고 이들의 분석 결과에 근거하여 군집의 차이를 분석하였다(Table 2 and Fig.
abata에 대한 배양 가능한 공생세균 다양성의 분석 결과에서 Alphaproteobacteria가 우점 세균 군집이며 이중 우점하는 세균 종은 Pseudovibrio 속이라는 결과와 일치하는 것이었다. 이 결과는 군집분석에 사용한 방법이 동일할 경우 유사한 군집구조를 나타내는 것으로, 서식 환경 등의 또 다른 생태학적 조건이 크게 다르지 않다면 동일한 방법으로 분석한 군집구조의 경우 주요 세균군집에 있어 일관성을 나타내는 것으로 볼 수 있다.
abata의 전체 세균 군집 구조는 Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Actinobacteria, Chloroflexi, Spirochetes로 구성되었다. 일반적으로 배양 가능한 공생세균 중 우점하는 세균군집으로 알려진 Proteobacteria (Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria)를 비롯하여 배양에 기초한 RFLP의 결과에서는 나타나지 않은 Chloroflexi, Spirochetes를 포함하여 총 4개의 문(phylum)에 속하는 세균 군집이 나타났다(Fig. 4).
Psychrobacter 속 세균은 27% 포함되어 Gammaproteobacteria 내에서 가장 우점하는 세균 속으로 나타났다. 전체 세균군집 중 18.9%를 나타내는 Actinobacteria의 경우 Mycobacterium 속, Kytococcus 속, Dietzia 속, Brachybacterium 속, Micrococcus 속, Arthrobacter 속, Arsenicicoccus 속 등 다양한 세균 종이 분포하였다. Firmicutes의 경우 10.
공통 군집으로 밝혀진 Proteobacteria의 경우 해양 해면에서 일반적으로 가장 많이 분포하는 것으로 알려있으며 Actinobacteria의 경우, 해양 유래 천연물들의 생산자로 알려져 있다(29). 특히 Spirastrella 속 해면은 다양한 생리활성물질을 생산하는 것으로 알려져 있는 바 본 연구에 이용한 Spirastrella abata에서도 두 가지 방법에 의한 다양성 분석 결과 모두에서 Actinobacteria의 존재를 확인할 수 있었다. 그밖에 Spirastrella 속 해면의 공생세균에 관한 많은 연구들에서 Actinobacteria가 공통적으로 존재하는 것으로 보고되었다(1, 2, 23).
RFLP패턴으로부터 유래한 16S rDNA의 염기서열 분석 결과, 알려진 염기서열들과 95% 이상의 유사도를 나타내었으며 Proteobacteria (Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria), Actinobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes의 4개의 문이 나타났으며 우점 군집은 Alphaproteobacteria였다. 해면에서 분리한 total gDNA로 부터 증폭한 16S rDNA의 DGGE 분석 결과 5개의 DGGE band가 확인 되었고, 각각의 band의 염기서열 분석 결과 알려진 염기서열들과 96% 이상의 유사도를 나타내었으며 band로부터 밝혀진 모든 서열들은 배양되지 않은 세균 클론들과 높은 상동성을 나타내었다. DGGE에 의한 공생세균 군집은 Proteobacteria (Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria), Actinobacteria, Spirochetes, Chloroflexi로 4개의 문(phylum)으로 나타났다.

후속연구

또한 해면 공생세균의 군집구조에 대한 연구방법에서 비배양법의 경우 DNA의 추출방법에 따라(6, 11), 배양법에서는 배양배지 혹은 배양 조건에 따라(29), 해면 공생세균의 우점 그룹이 달라진다는 연구결과들이 보고되고 있다. 따라서 방법에 따른 공생세균 군집 구조의 분석에는 각각의 한계가 있으므로 연구 방법에 따른 차이를 고려하면서 배양법과 비배양법을 동시에 적용하여 수행하는 것이 효과적일 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	Spirastrella abata에서 생산되는 생리활성 물질은 무엇이 있는가?	Demospongiae 강(class)에 속하는 Spirastrella abata는 우리나라의 제주도를 비롯하여 국내 해양 환경에 풍부하게 분포하는 해양 해면으로, 특이적이고 다양한 생리활성 물질을 생산한다(1, 2). 이 해면에서 생산되는 생리활성물질로는 Lysophosphatidylcholine과 Sphingosine 4-sulfates 등이 있으며 Lysophosphatidylcholine의 경우 콜레스테롤 생합성에 대하여 억제 작용을 갖는 것으로 보고되어있다(2, 23).
	DGGE 기술이란 무엇인가?	분자적 분석 방법 중 PCR- DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis)의 경우 실험 방법이 비교적 간단하고 주요 세균군집을 알아내는데 효율적이어서 미생물 다양성을 파악하는데 흔히 이용되고 있다(15, 20). DGGE는 특정 유전자 부위를 증폭한 PCR 산물을 Polyacrylamide gel상에서 전기 영동하여 확인하는 방법으로 이론적으로는 하나 이상의 염기서열이 다를 경우 서로 다른 band로 구분되어 자연환경의 미생물을 배양하지 않아도 군집 구조를 쉽게 파악할 수 있는 기술이다(9). 반면, 새로운 미생물 종의 자원화와 미생물에 의한 천연물 생산의 산업화 등을 위해서는 배양이 기초가 되어야 하므로 배양 가능한 해면 공생세균의 다양성에 관한 연구 또한 중요하다.
	해면은 계통학적으로 어떻게 나뉘는가?	해면은 해양에서 우점적으로 존재하는 주요 무척추동물 그룹 중의 하나로 해양을 비롯한 담수 환경에도 서식할 수 있으며 약 7,000-15,000종이 전세계적으로 분포하고 있는 것으로 알려져 있다(20, 28). 계통학적으로는 Calcarea, Hexactinellida, Demospongiae 3개의 강(class)으로 나뉘어진다(8, 26). 해면 조직 내 외에 세균, 고세균, 시아노박테리아, 녹조류, 홍조류, 규조류 등 많은 미생물을 포함하며 특히 세균을 다량 포함하는 것으로 알려져 있다(10).

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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