선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 Kim et al(2009)에 의해 항염 작용을 갖는다고 보고된 길경 butanol 분획물을 사용하여 이 성분의 항부종 효과를 Winter et al(1962) 방법으로 동물실험을 통하여 연구 검토하였으며, 길경 butanol 추출물에 column chromatography를 실시하여 길경의 항염증 작용을 갖는 유효성분을 분리하여 화학적 구조를 규명하고, 이 성분의 생리활성 효과를 연구 검토하여 그 결과를 보고하고자 한다.
- 본 연구는 길경 butanol 분획의 항염증 작용을 갖는 유효성분을 분리하고 이의 화학적 규조를 규명하였으며, 이 성분의 생리활성 효과에 관하여 확인하였다.
제안 방법
- 즉, 150～200 g 수컷 흰쥐를 하룻밤 절식시킨 뒤, 뒷발의 용적을(Vn)을 측정하였다. 1% carrageenan-생리식염액 0.1 mL를 흰쥐 뒷 발바닥에 피하주사하고, 일정 시간 간격으로 뒷발의 용적 (Vt)을 plethysmometer로 측정하였다. 부종을 유발시키고, 검체는 carrageenan 주사 30분 전에 경구 투여하였다.
- Ishikawa el al(1969)의 방법에 따라서 흰쥐의 등 부분에 CMC-pouch를 만들어 유주현상의 억제 여부를 검토하였다. 150～200 g의 수컷 흰쥐 8마리를 1군으로 하여 등 부분의 털을 제거하고 소독 후 공기 8 mL를 피하 주사하였다. 24시간 후에 멸균된 2% CMC-생리식염수액에 약물을 현탁하여 5 mL 씩 공기 낭에 주입하였다.
- 1 mL/mouse 씩을 꼬리 정맥에 주사하였다. 30분후 복강 내부를 5 mL 생리식염액으로 씻은 다음 채취하고 3,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후, 590 nm 자외선 흡수 스펙트럼 하에서 혈관 투과성의 정도를 대조약물로 ibuprofen 100 mg/kg을 경구투여하여 비교 검정하였다.
- 이때 대조군은 ibuprofen 15 mg/rat 으로 하였다. 6시간 후 낭속에 삼출물을 채취하여 계량하고, 일정량을 취하여 Turk액으로 염색하고 hemocytometer를 이용하여 백혈구수를 계수하였다. 삼출액 중 단백질량은 Alam (1992)의 방법으로 정량하였다.
- Butanol 추출물은 Fig. 1과 같이 column chromatography를 실시하였다. 즉, 건조분말상의 butanol 가용부를 methanol로 용해시키고, 동량의 silica gel(No.
- Ishii et al(1978, 1981, 1984)이 보고한 platycodin D와 비교하여 13C chemical shift가 일치하고 표준품과도 일치하므로 이 compound의 구조는 3-O-β-D-glucopyranosyl{2β, 3β, 16α, 23, 24-pentahydroxyolean-12-en-28-oic acid} 28-Oβ-D-apiofuranosyl(1→3)-β-D-xylopyranosyl(1→4)-α- L-rhamnopyranosyl(1→2)α-L-arabinopyranoside 인 platycodin D(Fig. 3)로 확정하였다.
- 5시간 이후로는 arachidonic acid의 cyclooxygenase product 중의 하나인 PGs(prostaglandin류)가 관여한다고 보고하였으며, Salvemini et al(1996) 은 1시간까지의 초기 부종에서는 histamine, 5-HT, kinin, PAF 등의 물질들이 관여하며, 1시간 이후 6시간까지는 prostaglandin, superoxide anion, nitric oxide 등이 관여하는 것으로 보고하였다. Rasa et al(1971)과 Salvemini et al(1996)의 보고와 비교하여 볼 때 subfraction No. 8 200 mg/kg을 경구 투여한 군에서 부종에 관여하는 여러 매개물 중 cyclooxygenase 대사에 의해 생성되는 prostaglandin류의 생성을 억제함으로 급성 염증에 효과가 뛰어남을 확인하였고, subfraction No. 8 추출물을 다시 분획하여 그 분획 물에 대한 항염증작용을 검색하였다.
- 7734)에 코팅한 다음, 이 분말을 column에 넣고 CHCl3: MeOH: H2O(15: 10: 2)로 용출시킨 뒤, TLC 상에서 같은 Rf 값을 나타내는 분획을 합하여 15개의 분획으로 분리하였다. 각 분획 층은 농축하여 건조, 분말화 하였으며, 시료는 1% CMC 액에 현탁시킨 후 동물에 투여하였다.
- TLC상에서 Rf 값이 같은 분획을 합하여 4개의 분획으로 분리하였다. 각 분획층은 감압 농축하여 건조, 분말화하였으며, 시료는 1% CMC액에 현탁시킨 후 동물에 투여하였다.
- 본 실험에서는 Kim et al(2009)에 의해 항염 작용을 갖는다고 보고된 길경 butanol 분획 건조물을 사용하였다. 각 유효 분획의 수율을 구하고, 이 수율에 의해 투여량을 결정하였다. 즉, 건조된 약재 5 g에 해당하는 각 유효 분획량을 계산하고, 산출된 양을 1% CMC에 현탁하여 투여하였다.
- 건조분말상의 fraction No. 8을 가지고 동량의 silica gel(No. 7729)에 코팅한 다음, 이 분말을 column에 넣고 물포화 ethyl acetate와 methanol 혼합용액으로 gradient column chromatography 하여 각각의 분획을 얻었다. TLC상에서 Rf 값이 같은 분획을 합하여 4개의 분획으로 분리하였다.
- 부종을 유발시키고, 검체는 carrageenan 주사 30분 전에 경구 투여하였다. 검체는 1% carrageenan-생리식염 액 주사 30분전에 경구투여 하였다. 대조군으로 saline을 대조약물로 ibuprofen 200 mg/kg을 경구 투여하여 비교 실험을 하였다.
- 2)의 하층부를 사용, column chromatography 하여 TLC 상에서 Rf 값이 같은 분획을 합하였다. 그 Rf 값에 따라 8-4-1과 8-4-2의 2개의 분획으로 분리한 뒤 각 분획 층을 농축시켜 각 각 결정형의 고형 분말화하여 compound Ⅰ과 compound Ⅱ를 얻었다.
- 물층에 Ag2CO3을 가하여 중화시킨 후 여과하고 얻은 여액을 농축한다음 BuOH: EtOH: H2O(4: 1: 5, the upper phase)를 전개용매로 하여 TLC를 실시하였다. 그 결과 compound Ⅰ 및 Ⅱ로부터 glucose, arabinose, rhamnose, xylose, apiose를 표준품과 비교하여 각각 확인하였다.
- 01의 유의성을 나타냄으로 λ-carrageenan 유발 부종 억제 작용이 뛰어남을 알 수 있었다. 그러므로 부종 억제 작용이 뛰어난 butanol subfraction No. 8-4를 다시 분획하여 그 분획 물에 대한 항염증작용을 검색하였다.
- 검체는 1% carrageenan-생리식염 액 주사 30분전에 경구투여 하였다. 대조군으로 saline을 대조약물로 ibuprofen 200 mg/kg을 경구 투여하여 비교 실험을 하였다. 부종 유발전의 용적(Vn)을 기준으로 하여 그 증가율을 아래의 식으로 계산하였다.
- Whittle BA(1964)의 방법에 따라서 검체가 단백질 친화성 색소인 pontamine sky blue의 모세혈관 투과성에 미치는 영향을 검토하였다. 마우스 7마리를 1군으로 하여 약물을 경구투여하고, 60분 후에 0.7% 아세트산-생리식염수액을 0.1 mL/10 g 씩 복강 내에 주사하여, 혈관 투과성을 증대시키고, 30분 후에 pontamine sky blue 4%액 0.1 mL/mouse 씩을 꼬리 정맥에 주사하였다. 30분후 복강 내부를 5 mL 생리식염액으로 씻은 다음 채취하고 3,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후, 590 nm 자외선 흡수 스펙트럼 하에서 혈관 투과성의 정도를 대조약물로 ibuprofen 100 mg/kg을 경구투여하여 비교 검정하였다.
- 1 mL를 흰쥐 뒷 발바닥에 피하주사하고, 일정 시간 간격으로 뒷발의 용적 (Vt)을 plethysmometer로 측정하였다. 부종을 유발시키고, 검체는 carrageenan 주사 30분 전에 경구 투여하였다. 검체는 1% carrageenan-생리식염 액 주사 30분전에 경구투여 하였다.
- 5 mL를 가하여 10시간 동안 환류하였다. 이 용액을 감압 하에 5 mL로 농축하여 여과한 후에 침전물을 물로 씻고 건조시켜 갈색고형분을 얻었으며, CHCl3: MeOH: H2O(7: 3: 1, the lower phase)를 전개용매로 TLC 하여 platycodigenin임을 표준품과 비교해서 확인하였다.
- 즉, 삼출액을 3,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 백혈구를 침전시킨 후 상등액 10 μL와 200μL Bio-Rad protein assay 염색시약을 취해 96 well microtiter plate에 넣고 5분간 반응시킨 후 595 nm에서 microplate reader로 측정하였다. 이때 BSA(bovine serum albumin)를 표준물질로 하여 단백질량을 계산하였다.
- 이에 흰쥐의 등 부위에 air-pouch를 만들어서 인간의 synovium과 유사한 형태로 만든 뒤 2% CMC를 주사하여 완만하게 nonspecific 염증반응을 유도한 CMC-pouch법에 의해 백혈구 유주를 측정하였다(Ishkawa & Mori 1969, Sedgwick & Lees P 1986).
- Winter el al(1962)의 방법에 따라서 carrageenan edema 억제 작용을 실시하였다. 즉, 150～200 g 수컷 흰쥐를 하룻밤 절식시킨 뒤, 뒷발의 용적을(Vn)을 측정하였다. 1% carrageenan-생리식염액 0.
- 각 유효 분획의 수율을 구하고, 이 수율에 의해 투여량을 결정하였다. 즉, 건조된 약재 5 g에 해당하는 각 유효 분획량을 계산하고, 산출된 양을 1% CMC에 현탁하여 투여하였다. 검액 조제 시에는 흰쥐 체중 kg당 5 mL가 주입되도록 하였으며 실험 직전에 조제하여 사용하였다.
- 1과 같이 column chromatography를 실시하였다. 즉, 건조분말상의 butanol 가용부를 methanol로 용해시키고, 동량의 silica gel(No.7734)에 코팅한 다음, 이 분말을 column에 넣고 CHCl3: MeOH: H2O(15: 10: 2)로 용출시킨 뒤, TLC 상에서 같은 Rf 값을 나타내는 분획을 합하여 15개의 분획으로 분리하였다. 각 분획 층은 농축하여 건조, 분말화 하였으며, 시료는 1% CMC 액에 현탁시킨 후 동물에 투여하였다.
대상 데이터
- Carrageenan의 종류와 type은 여러 가지가 있으나, Sigma 사의 type Ⅳ(λ)가 가장 강한 기염물질이었으므로 본 실험에서도 type Ⅳ를 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 시약은 ibuprofen(Sigma Chemial., USA), carboxymethyl cellulose(CMC, Junsei Chemical Co. Ltd., Japan), carrageenan type IV(Sigma Chemical Co., USA), pontamine sky blue(Fluka A.G., Switzerland), Bio-Rad protein assay(Bio-Rad Labratoris, USA), bovine serum albumin(Sigma Chemical Co., USA), kieselgel 60(70∼230 mesh, Merck, Art, 7734, Germany), Kieselgel 60(finer than 230 mesh, Merck, Art, 7729, Germany), Kieselgel F254(precoated, Merck, Art, 5549, Germany)이고, 기타 시약 및 추출 용매는 대한 약전품 또는 분석용 일급시약을 사용하였다.
- 본 실험에서는 Kim et al(2009)에 의해 항염 작용을 갖는다고 보고된 길경 butanol 분획 건조물을 사용하였다. 각 유효 분획의 수율을 구하고, 이 수율에 의해 투여량을 결정하였다.
- 체중 20～35 g의 ddY계 수컷 마우스와 체중 100～250 g의 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐를 2주일 이상 적응시킨 뒤 실험에 사용하였고, 고형사료(삼양사료) 및 물을 충분히 공급하였다. 동물실내(22～25℃)의 명암은 12시간씩으로 자동조절시켰다.
데이터처리
- 모든 실험 결과는 평균치와 표준오차로 나타내었고, 각 군 간의 비교는 Student's t-test를 사용하였으며, 대조군과 비교하여 p값이 5% 미만일 때는 통계학적으로 유의성이 있다고 판정하였다.
이론/모형
- Ishikawa el al(1969)의 방법에 따라서 흰쥐의 등 부분에 CMC-pouch를 만들어 유주현상의 억제 여부를 검토하였다. 150～200 g의 수컷 흰쥐 8마리를 1군으로 하여 등 부분의 털을 제거하고 소독 후 공기 8 mL를 피하 주사하였다.
- Whittle BA(1964)의 방법에 따라서 검체가 단백질 친화성 색소인 pontamine sky blue의 모세혈관 투과성에 미치는 영향을 검토하였다. 마우스 7마리를 1군으로 하여 약물을 경구투여하고, 60분 후에 0.
- Winter el al(1962)의 방법에 따라서 carrageenan edema 억제 작용을 실시하였다. 즉, 150～200 g 수컷 흰쥐를 하룻밤 절식시킨 뒤, 뒷발의 용적을(Vn)을 측정하였다.
- 6시간 후 낭속에 삼출물을 채취하여 계량하고, 일정량을 취하여 Turk액으로 염색하고 hemocytometer를 이용하여 백혈구수를 계수하였다. 삼출액 중 단백질량은 Alam (1992)의 방법으로 정량하였다. 즉, 삼출액을 3,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 백혈구를 침전시킨 후 상등액 10 μL와 200μL Bio-Rad protein assay 염색시약을 취해 96 well microtiter plate에 넣고 5분간 반응시킨 후 595 nm에서 microplate reader로 측정하였다.
성능/효과
- 에서 glycosidic C-O로 추정되는 흡수 band가 나타나는 것으로 보아 이 compound도 saponin으로 생각된다. Compound Ⅰ과 동일한 방법으로 가수분해한 결과 aglycone으로 platycodigenin과 당으로 glucose, arabinose, rhamnose, xylose 및 apiose를 TLC상에서 확인할 수 있었으며, 이는 compound Ⅰ과 일치하였다. 또한 compound의 1HNMR spectrum은 δ:1.
- 로 결정하였다. Platycodin D와 platycodin D3 12 mg/kg과 36 mg/kg을 각각 흰쥐에 경구 투여한 결과 carrageenan 부종이 강력히 억제되었다.
- Platycodin D와 platycodin D3 16 mg/kg과 24 mg/kg을 각각 마우스에 경구 투여한 경우에도 모세혈관 투과성 억제 작용이 뚜렷하게 나타내었다. Platycodin D와 platycodin D3 3 mg/rat과 7 mg/rat을 피하주사한 경우, 흰쥐의 CMC-pouch 모델에서 백혈구 유주가 강력히 억제됨을 나타내었다.
- : EtOH 용액에서 가수분해하여 TLC상에서 표준품과 비교하여 platycodigenin임을 확인하였다. 그러므로 이 compound는 aglycone으로 platycodigenin과 당으로 glucose, arabinose, rhamnose, xylose 및 apiose로 구성되어 있음을 확인할 수 있었다. 또한 이 compound의 1H-NMR spectrum은 δ: 1.
- 길경 butanol 분획을 column chromatography 한 결과 15개의 분획 중 No. 8에서 강력한 carrageenan 부종 억제 작용이 나타내었다. 2차 butanol 분획 No.
- 01)을 나타내었다. 또한 Ibuprofen 200 mg/kg을 투여한 대조군에서는 2, 3, 4시간에서 각각 15%, 39%, 38%의 부종 억제를 나타내었으며, 이로부터 subfraction No. 8은 2시간과 4시간에서 대조군보다 부종 억제율이 뛰어 남을 알 수 있었다. 한편, subfraction No.
- 또한 compound Ⅱ 36 mg/kg을 투여 군에 saline 투여 군에 비해 1, 2, 3, 4시간에 32.40%, 40.88%, 55.79%, 47.88%의 부종 억제 작용을 나타내었으며, 2, 3, 4시간에 각각 p<0.05, p<0.001, p<0.01 유의성을 나타냄으로 λ-carrageenan 유발 부종 억제 작용이 뛰어남을 알 수 있었다.
- 01) 강력하게 억제되었으므로 검체의 백혈구 작용이 있음을 알게 되었다. 반면에 pouch 내의 삼출액량은 대조군에 비해 검체와 대조약물 군 모두 별다른 효과를 나타내지 않았으며 단백질 삼출액 또한 검체와 대조약물 모두에서 유의성 있는 억제 작용을 나타내지 않았다. 이는 검체가 국소 적용에 의해 검체의 적용시간이 충분하지 못하기 때문이거나 CMC가 단백질 유출에 영향을 줄만큼 자극을 나타내지 못하였기 때문이라고 한 Ishigawa & Mori(1969)의 보고와 같은 결과를 나타내었다.
- 001의 유연성을 나타내었다. 이 결과로부터 compound Ⅰ과 compound Ⅱ 모두 염증 제 1기에 해당하는 혈관 투과성 항진 즉, 모세혈관 투과에 대하여 강한 억제 작용이 있음을 알 수 있었다.
- 이때 단일 물질인 compound Ⅰ과 compound Ⅱ를 각각3 mg/rat, s.c.와 7 mg/rat, s.c 투여군에서는 saline 투여한 대조군의 유주된 백혈구 수가 mm3 당 38,560±3,225.9인데 비하여 각각 26,462±1,768.7, 21,498±1245.2였으며, 이는 대조군에 비하여 백혈구 유주가 각각 32.15%(p<0.05), 44.25% (p<0.01) 강력하게 억제되었으므로 검체의 백혈구 작용이 있음을 알게 되었다.
- 이상의 실험 결과에서 길경의 항염증 유효성분은 platyco- din D와 platycodin D3 임을 확인하였고 이들의 항염증 생리활성이 강력함을 알 수 있었다. 앞으로 이 물질이 진통작용과 소화기계에 미치는 영향과 그 작용 메커니즘에 관한 연구도 계속되어야 할 것으로 사료된다.
- 8-3, 8-4에서 부종 억제 작용을 나타내었다. 즉, butanol subfraction No. 8-3 15 mg/kg을 투여군에서 saline투여군에 비해 1, 2, 3, 4시간에 11.78%, 12.88%, 17.04%, 15.83%의 부종 억제 작용을 나타내었으나, 통계적 유의성은 나타내지 않았다. 한편, butanol subfraction No.
- 즉, compound Ⅰ 12 mg/kg 투여 군에서는 saline투여 군에 비해 1, 2, 3, 4시간에 21.57%, 32.97%, 33.38%, 35.51%의 부종 억제 작용을 나타내었으며, 2, 3 시간에 p<0.05, 4 시간에 p<0.01 유의성을 나타내었다.
- 즉, subfraction No. 8 200 mg/kg 을 경구 투여한 군에서는 2, 3, 4시간에서 각각 20%, 34%, 40%의 부종 억제 작용을 나타내었으며, 3시간에 95%의 유의성(p<0.05)과 4시간에 99%의 유의성(p<0.01)을 나타내었다.
- 즉, 염증 제 1기에 해당하는 혈관 투과성 항진에 대한 실험으로 마우스의 복강 내에 기염물질인 아세트산을 투여하여 혈관 투과성을 증가시키고, 단백질 친화성 색소인 pontamine sky blue를 투여하여 복강 내로 투과되는 색소의 양을 검정한 결과 compound Ⅰ 16 mg/kg을 경구 투여한 복강액내에 삼출된 pontamine sky blue액의 농도가 saline 투여군에 비해 46.23%를 억제하여 p<0.01의 유연성을 나타냈으며, compound Ⅱ 24 mg/kg 경구투여 군에서는 saline 투여군에 비해 49.23%를 억제하여 p<0.001의 유연성을 나타내었다.
- 또한 m/z 1409에서 pentose가 떨어져서 생성된 fragment ion이 m/z 1277에서, 3 mole의 pentose와 1 mole의 methylpentose가 떨어져서 생성된 fragmention ion이 m/z 867에서 나타나므로 platycodin D에서 한 개의 glucose가 결합된 compound로 추정되었다. 한편, 13C-NMR spectrum (Table 5)은 platycodin D와 매우 유사하여 platycodin D와 비교하여 추가적으로 methyl-glucopyranoside에 해당하는 car- bon signal들이 나타나며, aglycone과 C-3에 결합된 glucose에 C-6 chemical shift가 3.7 ppm 저자장 이동된 것으로 보아 또 하나의 glucose가 platycodin D의 C-3에 결합되고 glucose의 C-6에 결합된 compound임을 알 수 있었다. 따라서 이 com- pound는 3-O-β-D-gentiobiosyl{2β, 3β, 16α, 23, 24-pentahydro-xyolean-12-en-28-oic acid} 28-O-β-D-apiofuranosyl(1→3)-β-D-xylopyranosyl(1→4)-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)α-L-arabinopyranoside 인 platycodin D3(Fig.
- 한편, butanol subfraction No. 8-4 32 mg/kg을 투여 군에는 saline투여 군에 비해 1, 2, 3, 4시간에 p<0.05, p<0.01의 유의성을 나타냄으로 λ-carrageenan 유발 부종 억제 작용이 뛰어남을 알 수 있었다.
- 한편, subfraction No. 15 65 mg/kg을 경구투여한 군에서는 1, 2, 3, 4시간에서 17%, 19%, 28%, 31%의 부종 억제를 보였으며, 3시간에서와 4시간에서 95% 유의성(p<0.05)을 나타내었다.
후속연구
- 임을 확인하였고 이들의 항염증 생리활성이 강력함을 알 수 있었다. 앞으로 이 물질이 진통작용과 소화기계에 미치는 영향과 그 작용 메커니즘에 관한 연구도 계속되어야 할 것으로 사료된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.