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문제 정의
- 이에 따라, 피부개선에 사용될 수 있는 한방 천 연소재를 이용한 많은 연구가 시도되고 있다. 그러므로 본 연구에서는 염증성 피부질환에 효능이 있는 것으로 알려진 한방 천연소재 중 황백(Phellodendri cortex)에 대하여 연구를 진행하였다.
- 따라서 본 연구에서는 황백의 대표적인 지표물질인 berberine과 palmatine의 동시분석법의 개발 및 검증을 진행하고 항산화 활성에 대해 연구하였다.
- 본 연구의 목적은 예로부터 약재로 사용되어 온 황 백의 대표적인 지표물질 berberine 및 palmatine의 동시 분석법을 개발 및 검증하고 지표물질들의 항산화 효능을 평가하여 해당 물질들에 대한 기초자료를 제공하고자 하였다. 표준물질들의 동시 분석법은 특이성, 직선성, 정확성, 정밀성, 검출한계 및 정량한계를 측정하여 신뢰성을 검증하였으며, 지표물질들의 항산화 활성은 FRAP 활성, reducing power 및 아질산염 소거능 실험으로 측정하였다.
제안 방법
- Berberine 및 palmatine 표준물질을 3.13, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200µg/mL의 농도로 제조해 HPLC를 이용하여 3 회 반복 측정했으며, 각 표준물질의 peak에 대한 면적과 농도비의 관계를 표시하는 검량선을 작성하고 작성한 검량 선으로부터 얻어진 상관계수(correlation coefficient, R ) 값을 통해 직선성을 확인하였다.
- Berberine 및 palmatine의 검출한계(LOD) 및 정량한계 (LOQ)는 검량선의 기울기와 표준편차에 근거하는 방법을 사용했으며 다음 식을 이용하여 확인하였다.
- Berberin과 palmatine의 HPLC 분석은 Li 등의 분석 방법을 변형하여 실시했으며, 두 개의 표준물질을 동시 분석하였다. 분석에 사용한 기기는 Waters 2695 Separation Module HPLC system과 Waters 996 Photodiode Array Detector (Waters, Milford, MA, USA)로 분석조건은 Table 1과 같으며 분석용 columne Intersil ODS-3 C18 (4.
- Working solutione 제조된 berberine 및 palmatine stock solution을 각각 5 mL씩 섞어 500 μg/mL의 standard mixture를 제조하고 이를 증류수로 희석하여 3.13, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200 μg/mL이 되도록 하였다.
- 농도를 알고 있는 황백 추출물에 표준용액 berberine 및 palmatine을 12.5, 25, 50µg/mL의 농도씩 각각 첨가해 일내(Intra-day) 정밀성 및 정확성을 확인하기 위해 하루에 3 회 반복하여 HPLC로 분석하였으며, 일간(Inter-day) 정밀성 및 정확성을 확인하기 위해 3일간 반복하여 HPLC로 분석하였다. 분석하여 얻어진 peak의 머무름 시간(retention time)과 PDA spectrum을 비교하여 정성을 하고 작성한 검량선에 시험용액의 peak 면적을 대입하여 berberine과 palmatine의 농도를 계산하였다.
- 농도를 알고 있는 황백 추출물에 표준용액을 각각 저농도(12.5μg/mL), 중농도(25μg/mL), 고농도(50μg/mL)로 첨가한 뒤 HPLC로 분석했을 때, 각 측정 결과 값 사이의 근접성을 확인하여 정밀성을 평가하며, 회수율을 측정하여 정확성을 평가하였다. 정밀성의 결과는 상대표준편차(RSD)로 확인했다.
- 5, 25, 50µg/mL의 농도씩 각각 첨가해 일내(Intra-day) 정밀성 및 정확성을 확인하기 위해 하루에 3 회 반복하여 HPLC로 분석하였으며, 일간(Inter-day) 정밀성 및 정확성을 확인하기 위해 3일간 반복하여 HPLC로 분석하였다. 분석하여 얻어진 peak의 머무름 시간(retention time)과 PDA spectrum을 비교하여 정성을 하고 작성한 검량선에 시험용액의 peak 면적을 대입하여 berberine과 palmatine의 농도를 계산하였다. 각 결과 값의 표준편차를 결과 값의 평균으로 나눈 비인 상대표준편차(relative standard deviation, RSD)로 일내 및 일간 정밀성을 확인했으며, 정확성은 다음 식을 이용하여 첨가한 농도에 대비하여 회수된 농도를 계산함으로서 회수율을 구해 정확성을 확인하였다.
- 5mL를 첨가하였다. 상온에서 10분간 반응시켜 microplate reader를 이용하여 700nm 에서 흡광도를 측정하였으며, 흡광도 값을 통해 reducing power를 비교하였다.
- 표준물질 berberine, palmatine을 HPLC로 분석하여 얻은 chromatogram을 비교하여 berberine과 palmatine이 선택적으로 분리가 되는지 확인했으며 photodiode-array (PDA) spectrum 을 확인하여 동일한 spectrum을 나타내는지 확인하였다.
- 표준물질들의 동시 분석법은 특이성, 직선성, 정확성, 정밀성, 검출한계 및 정량한계를 측정하여 신뢰성을 검증하였으며, 지표물질들의 항산화 활성은 FRAP 활성, reducing power 및 아질산염 소거능 실험으로 측정하였다. HPLC- PDA를 이용하여 berberine과 palmatine의 혼합용액을 분석하였을 때, 두 물질이 간섭 없이 선택적으로 분리되었음을 확인하였다.
대상 데이터
- 제공받아 사용하였다. Berberine, phosphoric acid, potassium ferricyanide, trichloroacetic acid, Iron(Ⅲ) chloride, sodium acetate, sodium phosphate, TPTZ (2, 4, 6-tripyridyl-s-triazine), ferric chloride, acetic acid, griess reagent 등은 Sigma (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MI, USA)로부터 구입하여 사용했으며, palmatinee PhytoLab (PhytoLab GmbH & Co., Vestenbergsgreuth, Germany)로부터 구입하여 사용하였다. 용매로 사용한 acetonitrilee J.
- 본 실험에서 사용된 황백 추출물은 콤비메드(Yanggu, Korea)에서 제공받아 사용하였다. Berberine, phosphoric acid, potassium ferricyanide, trichloroacetic acid, Iron(Ⅲ) chloride, sodium acetate, sodium phosphate, TPTZ (2, 4, 6-tripyridyl-s-triazine), ferric chloride, acetic acid, griess reagent 등은 Sigma (Sigma-Aldrich Co.
- 분석에 사용한 기기는 Waters 2695 Separation Module HPLC system과 Waters 996 Photodiode Array Detector (Waters, Milford, MA, USA)로 분석조건은 Table 1과 같으며 분석용 columne Intersil ODS-3 C18 (4.6mm× 250mm, 5.0μm, Intersil, Milpitas, CA, USA)이었다.
- , Vestenbergsgreuth, Germany)로부터 구입하여 사용하였다. 용매로 사용한 acetonitrilee J.T. Baker (J.T.Baker Chemicals Co., Phillipsburg, NJ, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
데이터처리
- FRAP assay, reducing power activity, 아질산염 소거 능 측정은 SAS version 9.4 (SAS institute Inc., Cary, NC, USA)을 이용하여 분석하였다. 유의성 분석은 one-way ANOVA 검정을 실시하여 유의성은 P<0.
- Each bar represents the mean±SD of triplicate determinations. Statistical analysis was performed using the one-way ANOVA (P<0.05). AsA: Ascorbic acid.
- 분석하여 얻어진 peak의 머무름 시간(retention time)과 PDA spectrum을 비교하여 정성을 하고 작성한 검량선에 시험용액의 peak 면적을 대입하여 berberine과 palmatine의 농도를 계산하였다. 각 결과 값의 표준편차를 결과 값의 평균으로 나눈 비인 상대표준편차(relative standard deviation, RSD)로 일내 및 일간 정밀성을 확인했으며, 정확성은 다음 식을 이용하여 첨가한 농도에 대비하여 회수된 농도를 계산함으로서 회수율을 구해 정확성을 확인하였다.
- 분석법의 유효성 검증(method validation)은 ICH (International Conference for Harmonization) 가이드라인을 근거로 하여 개발된 분석법의 특이성(specificity), 직선성 (linearity), 정밀성(precision), 정확성(accuracy), 검출한계(limit of detection, LOD) 및 정량한계(limit of quantification, LOQ) 를 이용하여 분석법의 유효성을 검증하였다.
- , Cary, NC, USA)을 이용하여 분석하였다. 유의성 분석은 one-way ANOVA 검정을 실시하여 유의성은 P<0.05 수준에서 검정하였다.
- 5μg/mL), 중농도(25μg/mL), 고농도(50μg/mL)로 첨가한 뒤 HPLC로 분석했을 때, 각 측정 결과 값 사이의 근접성을 확인하여 정밀성을 평가하며, 회수율을 측정하여 정확성을 평가하였다. 정밀성의 결과는 상대표준편차(RSD)로 확인했다. Berberine 및 palmatine의 정밀성은 일간 정밀성에서 각각 1.
이론/모형
- Ferric ion reducing antioxidant power (FRAP) assay는 Kwon 등의 방법을 이용하여 측정하였다. FRAP assay는 ferric ion (Fe )가 ferrous (Fe )로 환원되어 TPTZ와 결합하여 blue 계열의 색을 나타내어 환원력을 흡광도 값으로 나타내는 방법이다.
- Reducing power activity는 Sim 등의 방법을 이용하여 실험하였다. Reducing power activity는 ferric-ferricyanide(Fe ) 혼합물이 수소를 공여하여 유리라디칼을 안정화시2+켜 ferrous (Fe )로 전환하는 환원력을 흡광도의 값으로 나타내는 방법이다.
- 아질산염 소거능은 Sim 등의 방법을 이용하여 측정하였다. 시료 0.
성능/효과
- 01의 결과를 나타냈다. Berberine 및 palmatine의 아질산염 소거 능은 농도 의존적으로 증가하여 1 mM의 농도에서 각각 61.50±2.01%와 56.31±4.00%의 값을 확인할 수 있었고 양성대조군으로 사용된 ascorbic acid (0.5mg/mL)에서는 75.94±0.19%의 결과를 나타냈다. 이는 Shirwaikar 등 연구와 유사한 결과를 보였음을 확인할 수 있었다.
- 정밀성의 결과는 상대표준편차(RSD)로 확인했다. Berberine 및 palmatine의 정밀성은 일간 정밀성에서 각각 1.27-1.93%, 0.19-2.89%를 나타냈으며 일내 정밀성에서는 0.12-0.56%, 0.36-1.52%로 5% 이하의 우수한 정밀성을 나타냈다. 정확성은 회수율을 측정하여 나타내며 berberine 및 palmatine의 일간 정확성은 98.
- Berberine과 palmatine을 동시분석하기 위하여 기존의 분 석법17)을 참고하여 berberine 및 palmatine 표준물질들에 대한 최대흡수 파장을 검토한 결과, 각각 229.7, 265.0, 346.8 nm와 226.2, 274.4, 345.6 nm에서 최대흡수파장을 나 타냈다(Fig. 1). 각 물질의 최대흡수파장 및 기존 보고된 논문21)의 분석 파장인 230 nm에 따른 두 물질의 peak 면 적을 비교하여 최적 면적 값을 나타내는 파장 값을 확인한 결과, 232nm에서 두 물질의 최적 peak 면적 값을 나타내 최적분석파장은 232nm로 설정하였다.
- 표준물질들의 동시 분석법은 특이성, 직선성, 정확성, 정밀성, 검출한계 및 정량한계를 측정하여 신뢰성을 검증하였으며, 지표물질들의 항산화 활성은 FRAP 활성, reducing power 및 아질산염 소거능 실험으로 측정하였다. HPLC- PDA를 이용하여 berberine과 palmatine의 혼합용액을 분석하였을 때, 두 물질이 간섭 없이 선택적으로 분리되었음을 확인하였다. Berberine 및 palmatine의 검량선의 상관계수 값은 모두 0.
- 16의 흡광도 값을 나타냈다. Reducing power activity의 측정 결과는 FRAP의 결과와 같은 경향을 나타내었으며, 0.25, 0.5, 1.0mM의 농도에서 berberine과 palmatinee 각각 0.20±0.01, 0.32±0.00, 0.44±0.01와 0.21±0.01, 0.32±0.01, 0.46±0.01의 결과를 나타냈다. Berberine 및 palmatine의 아질산염 소거 능은 농도 의존적으로 증가하여 1 mM의 농도에서 각각 61.
- 2와 같이 berberine과 palmatine이 간섭 없이 선택적으로 분리되었음을 확인하였다. 각 지표물질의 표준용액과 지표 물질 혼합용액에서 머무름 시간이 일치하는 것을 확인하였으며, PDA spectrum 결과에서도 동일한 spectrum을 나타냈으며 이를 통해 특이성을 확인하였다(Fig. 1).
- 검출한계와 정량한계는 ICH 가이드라인에 근거하였으며 berberine 및 palmatine의 검출한계는 각각 0.32μg/mL, 0.35μg/mL로 측정됐으며 정량한계는 각각 0.97μg/mL, 1.06μg/mL로 나타났다. 이상의 결과를 통해 berberine 및 palmatinee HPLC를 이용해 동시분석이 가능하며 정량분석이 가능한 것으로 나타났다(Table 3).
- 또한, berberine과 palmatine 표준용액을 3.13, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200µg/mL 농도로 단계적으로 희석하여 HPLC 로 분석한 결과, berberine 및 palmatine의 표준검량선은각각 y=27256.6x–39147, y=41917.2x–76447로 나타났으며 상관계수(R ) 값은 두 가지 성분 모두 0.9999로 나타나 우수한 직선성을 보였다(Fig. 3). 이 결과를 통해 berberine의 머무름 시간은 Li 등의 연구와 비슷한 것을 확인할 수 있었고 직선성은 식품의약품안전평가원의 연구 결과와 유사한 결과를 확인할 수 있었다(Fig.
- 이는 Shirwaikar 등 연구와 유사한 결과를 보였음을 확인할 수 있었다. 이 결과들을 통해 berberine과 palmatine 모두 농도 의존적으로 환원력이 높아져 항산화 활성이 증가하였음을 알 수 있었으며, palmatine의 항산화 활성이 berberine보다 더 우수함을 확인할 수 있었다.
- 3). 이 결과를 통해 berberine의 머무름 시간은 Li 등의 연구와 비슷한 것을 확인할 수 있었고 직선성은 식품의약품안전평가원의 연구 결과와 유사한 결과를 확인할 수 있었다(Fig. 3).
- 06μg/mL로 나타났다. 이상의 결과를 통해 berberine 및 palmatinee HPLC를 이용해 동시분석이 가능하며 정량분석이 가능한 것으로 나타났다(Table 3). 이 결과는 식품의 약품안전평가원의 연구 에 의해 보고된 berberine 및 palmatine의 검출한계인 0.
- 52%로 5% 이하의 우수한 정밀성을 나타냈다. 정확성은 회수율을 측정하여 나타내며 berberine 및 palmatine의 일간 정확성은 98.43-100.73%, 93.20-100.60% 를 나타냈고 일내 정확성은 99.56-101.45%, 92.39-97.10%로 우수한 정확성을 나타내었다(Table 2).
- 표준용액과 혼합 추출물의 chromatogram을 비교하여 berberine과 palmatine의 peak를 확인한 결과 Fig. 2와 같이 berberine과 palmatine이 간섭 없이 선택적으로 분리되었음을 확인하였다. 각 지표물질의 표준용액과 지표 물질 혼합용액에서 머무름 시간이 일치하는 것을 확인하였으며, PDA spectrum 결과에서도 동일한 spectrum을 나타냈으며 이를 통해 특이성을 확인하였다(Fig.
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