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문제 정의
- 본 연구에서는 다음과 같은 실험 결과로 제라닐옥시쿠마린 유도체들은 항염증 저해활성을 갖는 기능성 원료로 응용 가능성이 있음을 알았다.
- 본 연구에서는 이전에 실험한 데이터를 중심으로[15] 탱자의 구성성분인 7-제라닐옥시쿠마린과 이들의 다양한 유도체를 합성하여 염증에 대한 항염증 효능을 알아보기 위하여 염증을 유발하는 일산화질소 억제 cytokine을 측정해 보았다.
가설 설정
- 각 화합물의 동정은 각 피크에 나타난 성분들은 윌리 8판 화학구조 라이브러리(미국, 에질런트사)와 비교하여 동일한 상태의 스팩트럼으로 비교하여 확인하였다. 분리된 각 화합물의 정량은 각 피크의 면적을 내부표준물질{4-데칸올(4-decanol)}의 피크면적과 비교하여 산출하였으며, 이때의 응답계수(response factor)를 1로 가정하였다.
제안 방법
- 염증을 유발하는 물질인 lipopolysaccharide (LPS, 1 ㎍/㎖)를 다시 처리하여 대식세포주에 염증을 유발하였다. 24시간 동안 37 ℃, 5 % 이산화탄소 배양기에서 배양시킨 후 배지를 회수하여 원심분리시킨 다음, 그 상등액으로 염증을 일으키는 사이토카인인 인터루킨-6의 생성량을 측정하였다. LPS만을 처리한 시험군과 생성량을 비교해 본 결과 표 2와 같이 각각의 시료는 50~60% 정도 억제시키는 것으로 나타났으며, 대조(+)군보다도 더 높은 활성을 보여 주었다.
- 합성된 화합물들의 분자량분석은 가스크로마토그래피-질량분석기(HP6890GC + HP 5973 MSD ; USA)로 Table 1과 같은 조건으로 시행하였다. 각 화합물의 동정은 각 피크에 나타난 성분들은 윌리 8판 화학구조 라이브러리(미국, 에질런트사)와 비교하여 동일한 상태의 스팩트럼으로 비교하여 확인하였다. 분리된 각 화합물의 정량은 각 피크의 면적을 내부표준물질{4-데칸올(4-decanol)}의 피크면적과 비교하여 산출하였으며, 이때의 응답계수(response factor)를 1로 가정하였다.
- 세척된 마이크로웰은 10 % 우태혈청(FBS : fetal bovine serum)이 첨가된 인산염완충액(PBS ; phosphate buffered salines)로 정지(blocking)시켰으며, 실험에서 채취한 배양 상층액을 적당한 비율로 희석한 후, 각 웰(well)에 분주하여 상온에서 반응시켰다. 그 다음, 비오틴(biotin)이 부착된 2차 항체(1 ㎍/㎖) 100 ㎕/웰과 일정시간 상온에서 반응시킨 후, 아비딘-퍼옥시다아제(avidin- peroxidase)(2.5 ㎍/㎖) 100 ㎕/웰을 첨가하였다. 마지막으로 기질(2,2'-아지노-비스 (2,2'-azino-bis), 0.
- 또한 반응에 있어서 사용된 염기(base)로서는 NaOH, K2CO3, 트리에탄올아민(TEA), CsOH, Cs2CO3등을 사용하였다. 그 외 용매는 아세토니트릴, 에틸아세테이트, n-헥산, 아세톤, 에탄올을 사용하였다, 그리고 분석기기로서는 핵자기공명분광 분석기(FT-NMR spectrometer ; Bruker-AC 300MHz, Zug, Swiss)로 분석하였고, 이때에 사용되는 용매는 내부 표준물질인 테트라메틸실란(TMS ; tetramethylsilane)과 CDCl3, CD3OD로 분석하였다. 화합물의 작용기에 대한 적외선 분광분석은 Nicolt Megna FT-IR 550 시리즈 II 스펙트로메터(Thermo Nicollet, USA)를 사용하였고 KBr펠렛(KBr pellets)을 이용하여 구조확인을 하였다.
- 화합물의 작용기에 대한 적외선 분광분석은 Nicolt Megna FT-IR 550 시리즈 II 스펙트로메터(Thermo Nicollet, USA)를 사용하였고 KBr펠렛(KBr pellets)을 이용하여 구조확인을 하였다. 그리고, 녹는점 측정은 파라핀 오일용기 하에 온도계를 장착하고 열린 유리모세관 방법으로 온도를 보정하지 않고 측정하였다.
- 단핵/대식세포 계열의 세포주인 RAW 264.7를 5×10^5로 분주하여 시료 6개 각각을 최종 농도가 1 uM과 10 uM 농도가 되도록 배지에 처리 한 후, 30분간 배양하였다.
- 마지막으로 기질(2,2'-아지노-비스 (2,2'-azino-bis), 0.1M 구연산(citric acid), H2O2을 첨가하여 발색시킨 시료는 마이크로플레이트 판독기(micro-plate reader)를 이용하여 405 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- 이 연구에서 탱자에서 분리된 7-제라닐옥시쿠마린에 대한 다양한 약리적인잠재적 효능 때문에, 보다 포괄적인 제라닐옥시쿠마린(geranyloxycoumarin)유도체를 합성하고, 이들의 생리활성들을 비교하였다. 먼저, 4-제라닐옥시쿠마린을 합성하기 위하여 4-히드록시쿠마린과 브롬화제라닐을 다양한 염기 (NaOH, K2CO3, 트리에탄올아민(TEA), CsOH, Cs2CO3, KF/Al2O3)와 아세토니트릴용매 하에서 다양한 반응의 조건하에서 반응하였다. 그 결과, Cs2CO3/CH3CN 조건하에서 2시간동안 상온에서 반응하여 화합물 3을 가장 높은 수율로 얻었으나, 환류 조건하에서는 C-알킬화반응(C-alkylation)에 의한 화합물 4가 90% 정도 얻어졌다.
- 생쥐 단핵/대식세포 계열의 세포주인 RAW 264.7(5× 105개)에 시료을 처리하고, 30분간 배양(incubation)한 후, 지방다당체(LPS ; lipopolysaccharide, 1 ㎍/㎖)로 처리하여, 24시간 동안 37 ℃, 5 % 이산화탄소 배양기(CO2 incubator)에서 배양시켰다.
- 이러한 결과에 대한 구조활성관계에 대한 세부적인 연구가 없는 실정이다. 이 연구에서 탱자에서 분리된 7-제라닐옥시쿠마린에 대한 다양한 약리적인잠재적 효능 때문에, 보다 포괄적인 제라닐옥시쿠마린(geranyloxycoumarin)유도체를 합성하고, 이들의 생리활성들을 비교하였다. 먼저, 4-제라닐옥시쿠마린을 합성하기 위하여 4-히드록시쿠마린과 브롬화제라닐을 다양한 염기 (NaOH, K2CO3, 트리에탄올아민(TEA), CsOH, Cs2CO3, KF/Al2O3)와 아세토니트릴용매 하에서 다양한 반응의 조건하에서 반응하였다.
- 출발물질(5)이 박막크로마토그래피(TLC) 상에서 사라짐을 확인한 다음, 반응물을 실온으로 냉각시키고, 회전식 감압증류기로 용매를 제거하고, 50 ㎖의 디클로로메탄을 가하여 5분간 교반한 다음, 유리필터(glass filter)로 여과하고 세척하여 얻어진 여과액을 농축하여 잔여물을 얻었다. 이를 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 이용하여 용리액인 헥산/디클로로메탄(1:1, 용적비) 혼합 용매를 가하여 여러 가지의 제라닐옥시쿠마린들을 수득하였다. 그리고, 합성된 여러 쿠마린 유도체들의 분석결과들은 다음과 같다.
- 3 mmol, 95 %)을 쿠마린이 용해된 반응물에 넣고 상온에서 5분간 교반한 다음 1시간 10분간 환류하였다. 출발물질(5)이 박막크로마토그래피(TLC) 상에서 사라짐을 확인한 다음, 반응물을 실온으로 냉각시키고, 회전식 감압증류기로 용매를 제거하고, 50 ㎖의 디클로로메탄을 가하여 5분간 교반한 다음, 유리필터(glass filter)로 여과하고 세척하여 얻어진 여과액을 농축하여 잔여물을 얻었다. 이를 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 이용하여 용리액인 헥산/디클로로메탄(1:1, 용적비) 혼합 용매를 가하여 여러 가지의 제라닐옥시쿠마린들을 수득하였다.
- 합성된 화합물들의 분자량분석은 가스크로마토그래피-질량분석기(HP6890GC + HP 5973 MSD ; USA)로 Table 1과 같은 조건으로 시행하였다. 각 화합물의 동정은 각 피크에 나타난 성분들은 윌리 8판 화학구조 라이브러리(미국, 에질런트사)와 비교하여 동일한 상태의 스팩트럼으로 비교하여 확인하였다.
- 항염증 효능을 알아보기 위하여 염증을 유발하는 사이토카인-6의 생성 억제능을 측정해 보았다. 단핵/대식세포 계열의 세포주인 RAW 264.
- 그 외 용매는 아세토니트릴, 에틸아세테이트, n-헥산, 아세톤, 에탄올을 사용하였다, 그리고 분석기기로서는 핵자기공명분광 분석기(FT-NMR spectrometer ; Bruker-AC 300MHz, Zug, Swiss)로 분석하였고, 이때에 사용되는 용매는 내부 표준물질인 테트라메틸실란(TMS ; tetramethylsilane)과 CDCl3, CD3OD로 분석하였다. 화합물의 작용기에 대한 적외선 분광분석은 Nicolt Megna FT-IR 550 시리즈 II 스펙트로메터(Thermo Nicollet, USA)를 사용하였고 KBr펠렛(KBr pellets)을 이용하여 구조확인을 하였다. 그리고, 녹는점 측정은 파라핀 오일용기 하에 온도계를 장착하고 열린 유리모세관 방법으로 온도를 보정하지 않고 측정하였다.
대상 데이터
- 다양한 히드록시쿠마린(hydroxycoumarin)과 메르캅토쿠마린(mercaptocoumarin) 등은 98-99% 정도의 순도를 갖는 Aldrich, Fluka 등의 회사제품을 사용하였고, 알케닐사슬에 해당하는 출발물질은 95%의 브롬화제라닐(geranyl bromide, Aldrich)을 사용하였다. 또한 반응에 있어서 사용된 염기(base)로서는 NaOH, K2CO3, 트리에탄올아민(TEA), CsOH, Cs2CO3등을 사용하였다.
- 다양한 히드록시쿠마린(hydroxycoumarin)과 메르캅토쿠마린(mercaptocoumarin) 등은 98-99% 정도의 순도를 갖는 Aldrich, Fluka 등의 회사제품을 사용하였고, 알케닐사슬에 해당하는 출발물질은 95%의 브롬화제라닐(geranyl bromide, Aldrich)을 사용하였다. 또한 반응에 있어서 사용된 염기(base)로서는 NaOH, K2CO3, 트리에탄올아민(TEA), CsOH, Cs2CO3등을 사용하였다. 그 외 용매는 아세토니트릴, 에틸아세테이트, n-헥산, 아세톤, 에탄올을 사용하였다, 그리고 분석기기로서는 핵자기공명분광 분석기(FT-NMR spectrometer ; Bruker-AC 300MHz, Zug, Swiss)로 분석하였고, 이때에 사용되는 용매는 내부 표준물질인 테트라메틸실란(TMS ; tetramethylsilane)과 CDCl3, CD3OD로 분석하였다.
이론/모형
- 7(5× 105개)에 시료을 처리하고, 30분간 배양(incubation)한 후, 지방다당체(LPS ; lipopolysaccharide, 1 ㎍/㎖)로 처리하여, 24시간 동안 37 ℃, 5 % 이산화탄소 배양기(CO2 incubator)에서 배양시켰다. 배양 후, 상층액을 수거하였으며, 상층액에 포함된 인터루킨-6(IL-6)의 양은 효소항체법(enzyme linked immunosorbent assay : ELISA)을 이용하여 측정하였다. 즉, 플레이트-바닥 마이크로웰(plate-bottom micro well)에 염소 항-인간 사이토카인(goat anti-human cytokine) 1차 항체(2 ㎍/㎖)를 코팅완충제(coating buffer)(0.
성능/효과
- 1. 항염증 효능을 가진 탱자의 구성 성분인 7-제라닐옥시쿠마린을 효과적으로 합성하였고, 또한 이러한 합성방법으로 다양한 알콕시쿠마린 유도체를 높은 수율로 얻었다.
- 2. 이와같이 얻어진 여러 유도체들의 항염증 생리활성을 조사한 결과, 일산화질소 하에서 억제 cytokine 측정한 인터루킨-6의 생성 저해능에서 화합물 5~10이 염증을 일으키는 인터루킨-6을 50~60% 정도 억제시키는 것으로 나타났다. 반면에, 6-제라닐옥시쿠마린의 성분이 사이토카인인 인터루킨-6가 1μM농도에서 68.
- 24시간 동안 37 ℃, 5 % 이산화탄소 배양기에서 배양시킨 후 배지를 회수하여 원심분리시킨 다음, 그 상등액으로 염증을 일으키는 사이토카인인 인터루킨-6의 생성량을 측정하였다. LPS만을 처리한 시험군과 생성량을 비교해 본 결과 표 2와 같이 각각의 시료는 50~60% 정도 억제시키는 것으로 나타났으며, 대조(+)군보다도 더 높은 활성을 보여 주었다.
- 먼저, 4-제라닐옥시쿠마린을 합성하기 위하여 4-히드록시쿠마린과 브롬화제라닐을 다양한 염기 (NaOH, K2CO3, 트리에탄올아민(TEA), CsOH, Cs2CO3, KF/Al2O3)와 아세토니트릴용매 하에서 다양한 반응의 조건하에서 반응하였다. 그 결과, Cs2CO3/CH3CN 조건하에서 2시간동안 상온에서 반응하여 화합물 3을 가장 높은 수율로 얻었으나, 환류 조건하에서는 C-알킬화반응(C-alkylation)에 의한 화합물 4가 90% 정도 얻어졌다. 이러한 과정의 4-히드록시쿠마린이 염기와 반응하여 주변이온(ambient ion)을 형성하여 브롬화제라닐과 치환하여 C-알킬화와 O알킬화(o-alkylation)의 화합물이 형성됨을 확인하였다.
- 벤젠골격이 아닌 위치에 히드록시를 갖는 4-히드록시쿠마린 1과는 달리 히드록시기(OH기)가 쿠마린골격의 5,6,7,8번 위치에 있을 경우, 히드록시쿠마린(예, 6-히드록시쿠마린)과 브롬화제라닐, 탄산세슘, 아세토니트릴 조건하에서 상온에서 반응한 결과, 일반적인 O-알킬화된 화합물(5,6,7,8,9,10)을 좋은 수율로 얻을 수 있었다. 그러나 위의 경우와 같이 상온과 환류하여 반응하였을 때에 생성물의 수율에 대한 변화가 상온에서는 긴 반응시간에서 50%정도의 수율로, 환류조건에서는 짧은 시간동안 90%정도의 높은 수율의 O알킬화된 생성물을 얻을 수 있었다. 그림 2에 나타낸 바와 같이, 주어진 조건으로 다양한 히드록시쿠마린과 브롬화제라닐 간의 반응으로 아래와 같이 새로운 쿠마린 유도체들을 얻었다.
- 그러나, 히드록시 이온을 갖는 강염기(NaOH, KOH, CsOH, etc)가 화합물 1과 반응할 경우에는 쿠마린구조의 골격이 열린 형태의 화합물 4가 지배적으로 얻어졌다. 벤젠골격이 아닌 위치에 히드록시를 갖는 4-히드록시쿠마린 1과는 달리 히드록시기(OH기)가 쿠마린골격의 5,6,7,8번 위치에 있을 경우, 히드록시쿠마린(예, 6-히드록시쿠마린)과 브롬화제라닐, 탄산세슘, 아세토니트릴 조건하에서 상온에서 반응한 결과, 일반적인 O-알킬화된 화합물(5,6,7,8,9,10)을 좋은 수율로 얻을 수 있었다. 그러나 위의 경우와 같이 상온과 환류하여 반응하였을 때에 생성물의 수율에 대한 변화가 상온에서는 긴 반응시간에서 50%정도의 수율로, 환류조건에서는 짧은 시간동안 90%정도의 높은 수율의 O알킬화된 생성물을 얻을 수 있었다.
- 이 연구에서는 효과적인 항염증제 개발하기 위해서, 많은 천연물중에서 쿠마린 구조를 가지는 대부분의 성분들이 우수한 생리활성을 나타내고 있다. 특히 탱자에는 여러 종류의 monoterpenes, limonoids, flavonoids과 coumarins 등의 구성성분으로 이루어져 있다[1].
- 그 결과, Cs2CO3/CH3CN 조건하에서 2시간동안 상온에서 반응하여 화합물 3을 가장 높은 수율로 얻었으나, 환류 조건하에서는 C-알킬화반응(C-alkylation)에 의한 화합물 4가 90% 정도 얻어졌다. 이러한 과정의 4-히드록시쿠마린이 염기와 반응하여 주변이온(ambient ion)을 형성하여 브롬화제라닐과 치환하여 C-알킬화와 O알킬화(o-alkylation)의 화합물이 형성됨을 확인하였다.
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