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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 알레르기 원인식품의 하나인 고등어가 가공식품 중에 존재하는지를 손쉽게 확인할 수 있도록 ELISA 검출법을 개발하고자 하였다. 즉, 고등어로부터 parvalbumin을 분리, 정제하고 실험동물에 면역하여 고등어에 대하여만 매우 높은 특이성을 나타내는 항체를 생산하고, 이를 이용하여 ELISA 조건을 확립하였으며 spike test 및 실제 가공식품 중 고등어를 검출하는데 ELISA 검출법을 적용하였다.
- 기존에 생선 검출을 위한 ELISA 개발은 여러 편 보고된 바있으나, 고등어만을 특이적으로 검출하는 방법에 관한 보고는 거의 없었다. 본 연구에서는 고등어 parvalbumin에 대한 토끼 항체를 이용하여 가공식품 중 고등어의 검출을 위한 ELISA를 개발하였다. 암모늄침전법과 Sephadex G-50 column chromatography를 이용하여 열에 안정한 12 kDa의 고등어 parvalbumin을 분리, 정제하였다.
가설 설정
- 1)Foods spiked with mackerel was homogenized, heated and diluted with PBST for the quantitation of mackerel parvalbumin by sELISA.
- 2)“O” means qualitative coincidence of ELISA result with indication on the food package, whereas “X” means discordance.
제안 방법
- 우선 ELISA format을 검토하였는데 간접경합 ELISA(competitive indirect ELISA, ciELISA), 직접경합 ELISA(competitive direct ELISA, cdELISA), 샌드위치 ELISA(sandwich ELISA, sELISA)의 조건하에서 얻은 표준곡선을 비교한 결과, 고등어 parvalbumin의 검출한계는 각각 200, 300, 3 ng/mL로써 검출감도가 가장 우수한 format은 sELISA로 나타났다(자료 미제시). ELISA에서 표준곡선에 사용되는 표준시료는 결과에 큰 영향을 미치는데(28), 본 연구에서는 고등어의 주요 알레르겐인 parvalbumin과 전체 고등어 생살을 기준으로 표준곡선을 나타내었다(Fig. 3). 여기에서 parvalbumin의 검출범위는 10-1000 ng/ mL(ppb)로 매우 민감한 검출이 가능함을 알 수 있었다.
- 매 면역 일주일 후, 토끼의 귀 정맥으로부터 채혈하여 4℃에서 하룻밤 방치한 후 원심분리(3,000 rpm, 20 min)하여 항혈청을 분리하였다(26). T-GelTM Purification Kit(Pierce Co., Rockford, IL, USA)를 이용하여 제조사의 설명에 따라 항혈청으로부터 항체를 정제한 후, PBS에 대하여 투석하여 사용하였다.
- 고등어 분쇄물을(1% in PBS)을 25, 60, 80, 100, 121℃에서 각각 10분간 열처리하고 10,000×g에서 20분간 원심분리한 후 상징액에 대하여 sELISA를 실시하였다.
- 고등어의 parvalbumin을 면역원으로 사용하고자 ‘재료 및 방법’에 따라 분리, 정제하였다.
- 그 후 4℃, 4000×g에서 10분간 원심분리하고 상징액을 회수하여 상온에서 55% 암모늄침전을 실시하였다.
- Parvalbumin은 열에 매우 안정하기 때문에 가열조리하여 섭취한 경우라도 알레르기 환자에게서는 알레르기 반응이 유도될 수 있다(22). 그러므로 열처리 정도에 따른 고등어에 대한 특이항체의 반응성을 조사하였다. 그 결과 80℃, 10분간 열처리시 상온처리에 비하여 23배, 100℃ 열처리시 2.
- 다시 이 수치를 각기 첨가한 parvalbumin의 함량(0.2-6 ppm(고등어 함량×1/500))과 비교하여 분석 회수율을 구하였다.
- 따라서, sELISA 분석치에 희석계수(5×5=25)를 곱하여 시료중의 농도를 구하였다.
- 이와 같이 얻어진 parvalbumin을 면역하여 항체를 생산하였을 때 추가 면역을 실시할수록 대체로 높은 항체가를 나타내어 4차 혈청을 정제하여 얻은 특이항체를 ELISA 분석용으로 사용하였다(자료 미제시). 또한 정제한 특이항체에 HRP를 공유결합시킴으로써 항체-HRP 복합물을 준비하였다.
- 신뢰성 검증을 위하여 가공식품에 농도별로 첨가한 고등어의 함량을 sELISA로 검출하고 그 분석수치의 회수율을 조사하였다. 대표적인 표준곡선을 Fig.
- 본 연구에서는 고등어 parvalbumin에 대한 토끼 항체를 이용하여 가공식품 중 고등어의 검출을 위한 ELISA를 개발하였다. 암모늄침전법과 Sephadex G-50 column chromatography를 이용하여 열에 안정한 12 kDa의 고등어 parvalbumin을 분리, 정제하였다. 여기에서 얻어진 parvalbumin을 토끼에게 면역하여 생산한 항 parvalbumin 항체 및 특이항체-HRP 복합물을 이용하여 샌드위치 ELISA(sELISA)의 조건을 확립하였다.
- 암모늄침전법과 Sephadex G-50 column chromatography를 이용하여 열에 안정한 12 kDa의 고등어 parvalbumin을 분리, 정제하였다. 여기에서 얻어진 parvalbumin을 토끼에게 면역하여 생산한 항 parvalbumin 항체 및 특이항체-HRP 복합물을 이용하여 샌드위치 ELISA(sELISA)의 조건을 확립하였다. 이때 parvalbumin의 검출한계는 3 ng/mL이고, 고등어(생살)의 검출범위는 5-5,000µg/mL이었다.
- 1과 같은 크로마토그램을 얻었다. 이때 얻은 분획에 대하여 항 개구리 parvalbumin 단클론항체의 교차반응을 ELISA로 조사함으로써 parvalbumin의 존재를 확인하였다(17). 또한 그 주요 분획들의 SDS-PAGE 결과를 Fig.
- 0)/1 mM DTE로 재현탁시켜 Sephadex G-50을 이용한 size exclusion chromatography를 행하였다. 이때 얻은 분획에 대하여 항 개구리 parvalbumin 항체를 이용한 ELISA를 실시하여 교차반응한 고등어 parvalbumin의 존재를 확인하고 이들 주요 획 분만을 모아서 3차 증류수에 투석하고 동결건조한 후 실험에 사용하였다. 또한 분리정제한 parvalbumin의 분자량 및 순도 확인을 위하여 Laemmli 방법(25)에 따라 SDS-PAGE를 실시하였다.
- 토끼의 등 피부에 마리 당 500 µg의 parvalbumin 용액과 Freund’s complete adjuvant를 1:1로 혼합한 유탁액 1 mL을 피하주사하였다. 이어서 2주 간격으로 3차례 추가면역을 실시하였다. 다만, 이 때에는 adjuvant로써 Freund's incomplete adjuvant를 사용 하였다.
- 2B(lane 3)에서는 최종적으로 분리된 parvalbumin의 band가 약 12 kDa에서 확인되었다. 이와 같이 얻어진 parvalbumin을 면역하여 항체를 생산하였을 때 추가 면역을 실시할수록 대체로 높은 항체가를 나타내어 4차 혈청을 정제하여 얻은 특이항체를 ELISA 분석용으로 사용하였다(자료 미제시). 또한 정제한 특이항체에 HRP를 공유결합시킴으로써 항체-HRP 복합물을 준비하였다.
- 항 고등어 parvalbumin 항체의 수산식품 단백질 몇 종에 대한 반응성을 조사하였다. 즉, 고등어, 우럭, 대구, 연어, 광어, 꽁치, 오징어, 새우, 꽃게, 바다가재 등을 70℃, 10분간 열처리한 다음, 시료처리 방법에 따라 준비한 각기 여러 농도의 시료용액에 대하여 sELISA를 실시하였다. 본 연구에서 특이항체의 교차반응율은 다음 식에 의하여 구하였다.
- ELISA 검출법의 신뢰성을 검정하기 위하여 spike test를 실시하였다. 즉, 몇 종의 가공식품(크림수프, 이유식, 소시지 등)에 고등어를 첨가하고, 그 중에 함유된 고등어의 함량을 sELISA로 분석하였다. 최종 100-3,000 ppm(0.
- 즉, 몇 종의 가공식품(크림수프, 이유식, 소시지 등)에 고등어를 첨가하고, 그 중에 함유된 고등어의 함량을 sELISA로 분석하였다. 최종 100-3,000 ppm(0.01-0.3%)의 고등어 첨가 시료를 70℃, 10분간 열처리한 다음, PBS를 4배 첨가하고 균질화하여 추출하고, 이를 다시 PBST로 5배 희석하여 sELISA를 실시하였다. 따라서, sELISA 분석치에 희석계수(5×5=25)를 곱하여 시료중의 농도를 구하였다.
- 다시 4℃, 4000×g에서 25분간 원심분리하고 상징액을 회수하여 상온에서 90% 암모늄침전을 실시한 후, 한번 더 4℃, 9000×g에서 25분간 원심분리하였다. 침전물을 회수하여 50 mM Tris(pH 8.0)/1 mM DTE로 재현탁시켜 Sephadex G-50을 이용한 size exclusion chromatography를 행하였다. 이때 얻은 분획에 대하여 항 개구리 parvalbumin 항체를 이용한 ELISA를 실시하여 교차반응한 고등어 parvalbumin의 존재를 확인하고 이들 주요 획 분만을 모아서 3차 증류수에 투석하고 동결건조한 후 실험에 사용하였다.
- 특이항체와 항체-HRP복합물을 이용하여 고등어의 주요 알레르겐(parvalbumin, 12 kD)을 분석하기 위한 ELISA의 최적조건을 검토하였다. 우선 ELISA format을 검토하였는데 간접경합 ELISA(competitive indirect ELISA, ciELISA), 직접경합 ELISA(competitive direct ELISA, cdELISA), 샌드위치 ELISA(sandwich ELISA, sELISA)의 조건하에서 얻은 표준곡선을 비교한 결과, 고등어 parvalbumin의 검출한계는 각각 200, 300, 3 ng/mL로써 검출감도가 가장 우수한 format은 sELISA로 나타났다(자료 미제시).
- 항 고등어 parvalbumin 항체의 수산식품 단백질 몇 종에 대한 반응성을 조사하였다. 즉, 고등어, 우럭, 대구, 연어, 광어, 꽁치, 오징어, 새우, 꽃게, 바다가재 등을 70℃, 10분간 열처리한 다음, 시료처리 방법에 따라 준비한 각기 여러 농도의 시료용액에 대하여 sELISA를 실시하였다.
대상 데이터
- ELISA를 위한 항 고등어 parvalbumin 항체 및 특이항체-효소 결합물은 자체적으로 제작한 것을 사용하였다. New Zealand White 종 토끼는 한림실험동물(Pyeongtaek, Gyeonggi, Korea)로부터 구입하였으며, microplate는 Nunc사(Roskilde, Denmark)의 MaxisorpTM를, microplate reader는 Molecular Devices 사(Sunnyvale, CA, USA)의 ThermoMaxTM를 사용하였다. 생선류와 가공식품류 시료는 2008년 성남시 분당소재 할인매장에서 구입하였고, 특히 후자의 경우 국내 및 국외 제품 중 단순 가공품 3종, 우동소스 6종, 일반소스 2종, 크림스프 2종, 이유식 2종, 총 16점을 무작위로 확보하여 실험에 사용하였다.
- 다만, 이 때에는 adjuvant로써 Freund's incomplete adjuvant를 사용 하였다.
- New Zealand White 종 토끼는 한림실험동물(Pyeongtaek, Gyeonggi, Korea)로부터 구입하였으며, microplate는 Nunc사(Roskilde, Denmark)의 MaxisorpTM를, microplate reader는 Molecular Devices 사(Sunnyvale, CA, USA)의 ThermoMaxTM를 사용하였다. 생선류와 가공식품류 시료는 2008년 성남시 분당소재 할인매장에서 구입하였고, 특히 후자의 경우 국내 및 국외 제품 중 단순 가공품 3종, 우동소스 6종, 일반소스 2종, 크림스프 2종, 이유식 2종, 총 16점을 무작위로 확보하여 실험에 사용하였다.
- 5에, 분석의 회수율을 Table 3에 각각 나타내었다. 이때, 가공식품은 고등어 알레르겐이 함유될 가능성이 높은 식품군인 크림스프, 이유식, 소시지, 소스를 대상으로 하였다. 그 결과 분석상의 회수율은 각각 104, 101, 54, 0%로 나타났다.
데이터처리
- ELISA 검출법의 신뢰성을 검정하기 위하여 spike test를 실시하였다. 즉, 몇 종의 가공식품(크림수프, 이유식, 소시지 등)에 고등어를 첨가하고, 그 중에 함유된 고등어의 함량을 sELISA로 분석하였다.
- 이어서 microplate reader로 흡광도(A450)를 측정하였다. 모든 시료는 3반복 처리하여 얻은 평균값을 사용하였다.
- 한편 본 연구에서 개발한 sELISA를 이용하여 위와 동일한 방법으로 시판 시료 16점의 고등어 검출을 실시하였다.
이론/모형
- 이때 얻은 분획에 대하여 항 개구리 parvalbumin 항체를 이용한 ELISA를 실시하여 교차반응한 고등어 parvalbumin의 존재를 확인하고 이들 주요 획 분만을 모아서 3차 증류수에 투석하고 동결건조한 후 실험에 사용하였다. 또한 분리정제한 parvalbumin의 분자량 및 순도 확인을 위하여 Laemmli 방법(25)에 따라 SDS-PAGE를 실시하였다.
- 따라서 본 연구에서는 알레르기 원인식품의 하나인 고등어가 가공식품 중에 존재하는지를 손쉽게 확인할 수 있도록 ELISA 검출법을 개발하고자 하였다. 즉, 고등어로부터 parvalbumin을 분리, 정제하고 실험동물에 면역하여 고등어에 대하여만 매우 높은 특이성을 나타내는 항체를 생산하고, 이를 이용하여 ELISA 조건을 확립하였으며 spike test 및 실제 가공식품 중 고등어를 검출하는데 ELISA 검출법을 적용하였다.
성능/효과
- 3%)에서 분석회수율은 각각 104, 101, 54, 0%로 나타났다. sELISA에 의하여 16점의 시판시료 중 고등어의 함유 유무를 조사한 결과, 정성적으로 표시와 일치하는 것은 75%이었다. 그러므로 본 연구에서 개발한 sELISA는 일부 한계가 있기는 하지만, 가공식품 중 고등어를 정성적으로 검출하는데는 효과적으로 활용할 수 있을 것이다.
- 이어서. 광어, 우럭, 오징어, 꽃게, 꽁치, 대구, 새우, 연어, 바다가재, 고등어에 대한 교차반응을 조사한 결과 고등어에 대한 반응성은 월등히 높았으나 다른 수산식품에서는 반응성이 거의 없거나 매우 낮게 나타나 고등어에 대한 특이성이 매우 높은 항체임을 알 수 있었다. 또한 분석시 시료의 열 안정성은 100℃까지 양호하였으며 크림스프, 이유식, 소시지, 소스에 대한 spike test(0.
- 그러므로 열처리 정도에 따른 고등어에 대한 특이항체의 반응성을 조사하였다. 그 결과 80℃, 10분간 열처리시 상온처리에 비하여 23배, 100℃ 열처리시 2.3배 높은 반응성이 나타났으나 121℃ 열처리하면 그 반응성이 1/30로 감소하였다(Fig. 4, Table 2). 따라서, 본 연구에서 개발한 sELISA분석으로 열처리한 고등어를 분석하면, 60-100℃ 열처리 후에도 특이항체와의 양호한 반응을 나타내지만 이보다 높은 온도의 열처리에서는 반응성이 급격하게 감소하는 것으로 나타났다.
- 이때, 가공식품은 고등어 알레르겐이 함유될 가능성이 높은 식품군인 크림스프, 이유식, 소시지, 소스를 대상으로 하였다. 그 결과 분석상의 회수율은 각각 104, 101, 54, 0%로 나타났다. 즉, 크림스프와 이유식은 매우 양호하였으나, 소시지의 경우 1/2 정도로 낮았으며, 소스의 경우에는 고등어의 분석은 거의 불가능하였다.
- 4, Table 2). 따라서, 본 연구에서 개발한 sELISA분석으로 열처리한 고등어를 분석하면, 60-100℃ 열처리 후에도 특이항체와의 양호한 반응을 나타내지만 이보다 높은 온도의 열처리에서는 반응성이 급격하게 감소하는 것으로 나타났다. 이는 최근 Gajewski와 Hsieh(19)이 보고한 연구와도 일치하는 결과인데, 그들은 상업적으로 판매되는 parvalbumin에 대한 단클론항체인 MAb 3E1을 이용하여 여러 종류의 생선 및 갑각류 등을 100℃로 열처리하여 반응성을 확인하였으며 이에 따라 가공한 식품과 가공하지 않은 식품 모두에서 고등어 알레르겐을 검출할 수 있음을 제시하였다.
- 2%였으나, 다른 생선류의 분쇄물에 대한 반응성은 대체로 2×10−6% 이하로 나타났다(Table 1). 따라서, 특이항체는 고등어에 대한 반응성이 다른 생선류에 비하여 월등하게 높았으나, 다른 생선류에 대하여는 반응이 매우 미약하거나 없는 것으로 나타났다.
- 시판 시료 16점의 고등어 검출을 실시한 결과, 고등어가 함유된 것으로 표시된 7점 시료 중 정성적으로 검출된 것은 3점, 불검출된 것은 4점이었으며, 고등어의 함유가 표시되지 않은 시료 9점 중 검출된 것은 0점, 불검출된 것은 9점이었다(Table 4). 따라서, 표시와 검출이 정성적으로 일치하는 시료는 모두 12점으로써 75%의 일치율을 나타내었다. 하지만, 정량적으로 일치하지 않았다.
- 광어, 우럭, 오징어, 꽃게, 꽁치, 대구, 새우, 연어, 바다가재, 고등어에 대한 교차반응을 조사한 결과 고등어에 대한 반응성은 월등히 높았으나 다른 수산식품에서는 반응성이 거의 없거나 매우 낮게 나타나 고등어에 대한 특이성이 매우 높은 항체임을 알 수 있었다. 또한 분석시 시료의 열 안정성은 100℃까지 양호하였으며 크림스프, 이유식, 소시지, 소스에 대한 spike test(0.01-0.3%)에서 분석회수율은 각각 104, 101, 54, 0%로 나타났다. sELISA에 의하여 16점의 시판시료 중 고등어의 함유 유무를 조사한 결과, 정성적으로 표시와 일치하는 것은 75%이었다.
- 시판 시료 16점의 고등어 검출을 실시한 결과, 고등어가 함유된 것으로 표시된 7점 시료 중 정성적으로 검출된 것은 3점, 불검출된 것은 4점이었으며, 고등어의 함유가 표시되지 않은 시료 9점 중 검출된 것은 0점, 불검출된 것은 9점이었다(Table 4). 따라서, 표시와 검출이 정성적으로 일치하는 시료는 모두 12점으로써 75%의 일치율을 나타내었다.
- 3). 여기에서 parvalbumin의 검출범위는 10-1000 ng/ mL(ppb)로 매우 민감한 검출이 가능함을 알 수 있었다. 또한, 이로부터 고등어(생살)의 검출범위는 5-5,000 µg/mL(ppm)임을 알 수 있었다.
- 특이항체와 항체-HRP복합물을 이용하여 고등어의 주요 알레르겐(parvalbumin, 12 kD)을 분석하기 위한 ELISA의 최적조건을 검토하였다. 우선 ELISA format을 검토하였는데 간접경합 ELISA(competitive indirect ELISA, ciELISA), 직접경합 ELISA(competitive direct ELISA, cdELISA), 샌드위치 ELISA(sandwich ELISA, sELISA)의 조건하에서 얻은 표준곡선을 비교한 결과, 고등어 parvalbumin의 검출한계는 각각 200, 300, 3 ng/mL로써 검출감도가 가장 우수한 format은 sELISA로 나타났다(자료 미제시). ELISA에서 표준곡선에 사용되는 표준시료는 결과에 큰 영향을 미치는데(28), 본 연구에서는 고등어의 주요 알레르겐인 parvalbumin과 전체 고등어 생살을 기준으로 표준곡선을 나타내었다(Fig.
- 이상의 결과를 종합하면, 본 연구에서 고등어 parvalbumin에 대한 특이항체를 이용한 sELISA는, 소스와 같은 일부 식품에는 적용이 불가능한 문제가 있지만, 일반적인 가공식품 중 고등어의 함유유무를 정성적으로 분석하는데 효과적으로 활용 가능한 것으로 판단되었다.
- 그 결과 분석상의 회수율은 각각 104, 101, 54, 0%로 나타났다. 즉, 크림스프와 이유식은 매우 양호하였으나, 소시지의 경우 1/2 정도로 낮았으며, 소스의 경우에는 고등어의 분석은 거의 불가능하였다. 이와 유사한 연구의 예는 대구 parvalbumin에 대한 항체를 이용한 ELISA에서 알 수 있는데, 빵, 수프, 와인, 간장 등에 첨가한 대구 parvalbumin의 분석회수율을 조사하였을 때 간장과 와인의 경우는 그 회수율이 각각 80%와 40%로 낮게 나타났다(16).
- 한편, 고등어 parvalbumin 및 70℃, 10분간 열처리한 생선류에 대한 특이항체의 반응성을 서로 비교한 결과, parvalbumin에 대한 특이항체의 반응성을 100%로 하였을 때, 고등어의 반응성은 0.2%였으나, 다른 생선류의 분쇄물에 대한 반응성은 대체로 2×10−6% 이하로 나타났다(Table 1).
후속연구
- sELISA에 의하여 16점의 시판시료 중 고등어의 함유 유무를 조사한 결과, 정성적으로 표시와 일치하는 것은 75%이었다. 그러므로 본 연구에서 개발한 sELISA는 일부 한계가 있기는 하지만, 가공식품 중 고등어를 정성적으로 검출하는데는 효과적으로 활용할 수 있을 것이다.
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