[논문]동결 보호제(DMSO) 농도에 따른 돼지 중간엽 줄기세포의 Caspase 3과 7 발현

옥선아; 노규진

동결 보호제(DMSO) 농도에 따른 돼지 중간엽 줄기세포의 Caspase 3과 7 발현
Activation of Caspase-3 and -7 on Porcine Bone Marrow Derived Mesenchymal Stem Cells (pBM-MSCs) Cryopreserved with Dimethyl Sulfoxide (DMSO) 원문보기

Journal of embryo transfer = 한국수정란이식학회지, v.27 no.3, 2012년, pp.183 - 187

옥선아 (국립축산과학원 바이오공학과) , 노규진 (국립경상대학교 수의과대학 수의산과학연구실)

Abstract ▼ AI-Helper

Adult stem cell transplantation has been increased every year, because of the lack of organ donors for regenerative medicine. Therefore, development of reliable and safety cryopreservation and bio-baking method for stem cell therapy is urgently needed. The present study investigated safety of dimethyl sulfoxide (DMSO) such as common cryoprotectant on porcine bone marrow derived mesenchymal stem cells (pBM-MSCs) by evaluating the activation of Caspase-3 and -7, apoptosis related important signal pathway. pBM-MSCs used for the present study were isolated density gradient method by Ficoll-Paque Plus and cultured in A-DMEM supplemented 10% FBS at $38.5^{\circ}C$ in 5% $CO_2$ incubator. pBM-MSCs were cryopreserved in A-DMEM supplemented either with 5%, 10% or 20% DMSO by cooling rate at $-1^{\circ}C$/min in a Kryo 360 (planner 300, Middlesex, UK) and kept into $LN_2$. Survival rate of cells after thawing did not differ between 5% and 10% DMSO but was lowest in 20% DMSO by 0.4% trypan blue exclusion. Activation of Caspase-3 and -7 by Vybrant FAM Caspase-3 and -7 Assay Assay Kit (Molecular probes, Inc.OR, USA) was analyzed with a flow cytometer. Both of cryopreserved and control groups (fresh pBM-MSCs) were observed after the activation of Caspase-3 and -7. The activation did not differ between 5% and 10% DMSO, but was observed highest in 20% DMSO. Therefore 5% DMSO can be possibly used for cell cryopreservation instead of 10% DMSO.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

세포 동결 시 가장 일반적으로 사용되는 동결 보호제인 dimethyl sulfoxide(DMSO)는 사람에서 이 동결 보호제가 첨가된 세포를 이식하였을 때 저혈압, 심장부정맥, 오심 등 각종 부작용을 유발할 수 있는 것으로 알려져 있다(Davis 등, 1990; Zambelli 등, 1998). 따라서 본 연구에서는 이러한 DMSO 동결 보호제의 독성을 규명하고, 이를 개선하기 위하여 apoptosis에 관여하는 주요 경로인 미토콘드리아 내에서 시토크롬 c(cytochrome c)의 방출과 동시에 세포질(cytoplasm)에 존재하는 apoptotic protease activation factor(Apaf1)와 Caspase(cysteine-aspartic acid specific proteases) 9의 결합에 의한 apoptosome의 형성에 의한 Caspase-3과 -7의 절단 활성(Thornberry 등, 1997)에 의한 핵단 백질 절단 경로를 분석함으로써 세포 사멸에 미치는 농도별 DMSO의 효과를 돼지 골수 유래 중간엽 줄기세포(porcine bone marrow derived mesenchymal stem cells(MSCs), pBM- MSCs)를 사용하여 분석하였다.
줄기세포 이식 치료를 위해서는 동결 후 세포의 생존율이 매우 중요한 요소 중 하나이고 이것을 평가하기 위해 주로 apoptosis를 비교함으로써 세포의 운명을 판정하는 기준으로 삼고 있다. 따라서 이 연구는 apoptosis에 발생하는 경로 중 비교적 초기에 나타나는 상위 신호에 의해 분열로 인한 핵단백질 분해효소들(Caspase-3과 -7)의 활성을 조사하기 위해 capases의 fluorescent inhibitor를 붙임으로써 간접적으로 측정하는 방식에 의해 분석하였다(Bedner 등, 2000). 그리고 이 분석 방법은 일반적으로 많이 사용되는 후기 apoptosis에 나타나는 DNA의 절단을 관찰하는 terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP nick end labeling(TUNEL) 염색이나 세포 내막에 존재하는 phosphatidyl serine(PS)의 외부 노출을 Annexin V staining 을 통해 확인하는 방법보다 직접적으로 세포의 운명을 확인 할 수 있는 방법이라 할 수 있다(Bedner 등, 2000).
이 연구는 성체줄기세포를 이용한 세포 치료을 위해서 선결조건인 안전한 동결보존 방법의 개발과 동시에 세포동결 보호 제인 DMSO와 동결 자체가 세포사 중 apoptosis에 미치는 독성 효과를 규명하는 것이었다. 이 연구는 특히 apoptosis 경로 중외부 자극에 의한 미토콘드리아 내막에 존재하는 사이토크롬 C의 방출과 최종적으로 단백질 분해효소인 Caspase-3과 -7의 활성에 의한 발현을 조사함으로써 apoptosis의 형태적 발현 정도가 아닌 실제적인 효소 발현 경로를 조사하였다, 그 결과 정상세포에도 이 효소는 일정 수준이 발현됨으로써 비정상적인 세포를 제거하는 역할을 한다는 것을 규명하였고, 동시에 동결과 동결 보호제의 독성이 이 단백질 분해 효소의 과발현으로 세포 사멸에 치명적인 효과를 나타낼 수 있음을 규명하였다.

제안 방법

동결 융해된 pBM-MSCs는 융해 직후 0.4% Trypan Blue 염색약과 세포용액을 1:1(v:v)로 희석하여 광학현미경 아래에서 hemocytometer를 이용하여 세포의 생존율을 조사하였다. 이때 세포가 파랗게 염색된 것은 죽은 세포로 판정하였고, 전체 세포 수에서 염색되지 않은 세포수를 계산하여 퍼센트로 환산하였다.
세포 사멸율을 조사하기 위하여 Vybrant FAM Caspase-3 and -7 Assay Kit(Molecular probes, Inc.OR, USA)를 사용하여 제조자 설명서에 의해 분석이 이루어졌다. 먼저 단일세포로 된 pBM-MSCs는 1×10⁶cell/ml 세포 농도로 조정되었고, 각각 300ul의 세포 부유액과 10 ul의 30×fluorescent inhibitor of capases (FLICA)를 잘 혼합하였다.
이 실험을 위해 사용된 실험군은 아무런 처리를 하지 않은 신선 세포인 대조군과 비교군으로서는 5% DMSO, 10% DMSO, 20% DMSO의 동결 보호제를 사용하여 동결 보관된 세포군으로 나누어 실험에 공시하였다.
5℃의 5% CO₂ 인큐베이터 속에서 20분 간격으로 2번 잘 혼합해 주면서 빛을 피하여 배양 후, 2 ml의 wash buffer를 첨가하여 수세후 다시 1 ml의 wash buffer를 첨가하여 수세하였다. 최종적으로 400 ul의 wash buffer를 첨가하여 잘 혼합하고 유세포 분석기(BD bioscience, Heidelberg, Germany)를 사용하여 single color 분석을 수행하였다. 이때 excitation와 emission은 488과 530 nm를 선택하여 분석하였다.

대상 데이터

pBM-MSCs를 위한 기본 배양액으로는 Advanced Dulbecco’s modified Eagle medium(ADMEM)에 10% 소 혈청, 1 mM Napyruvate, 100 U/ml penicillin G, 100 μg/ml streptomycin sulfate를 첨가하여 사용하였고, 세포들은 모두 38.5℃ 인큐베이터 속에서 5% CO2 농도를 유지하면서 배양되었다.
이 실험에 사용된 모든 시약은 특별한 언급이 없는 경우, Sigma Chemical Company(St Louis, MO, USA)에서 구입하였고, 배양액은 Gibco(Life Technologies, Rockville, MS, USA)에서 구입하였다. 모든 배양액은 pH 7.
5℃ 인큐베이터 속에서 5% CO₂ 농도를 유지하면서 배양되었다. 이 실험에 사용된 세포는 모두 3passages 까지만 사용되었고, 대조구로는 동결 과정을 거치치 않은 신선 pBM-MSCs를 사용하였다.

데이터처리

이 실험 결과는 모두 PSAW statistic 18 program을 사용하여 one way ANOVA를 이용하여 Fig. 2는 LSD로, Fig. 3은 Bon-ferroni로 multiple comparison을 수행하였다. 유의성 p<0.

성능/효과

20% DMSO 군(60.0±0.0%)의 경우 유의적으로 가장 높은 Caspase-3과 -7의 발현이 관찰됨을 확인할 수 있었다.
3에 나타내었다. Fig. 3A에서 대조군(Fig. 3Aa) 와 비교하여 비교군인 5%, 10%, 20% DMSO 군은 negative control과 비교적 오른쪽으로 더 많이 이동한 것을 관찰할 수 있고, 특히 20% DMSO 군이 많이 이동한 것을 관찰할 수 있었다. Fig.
이 분석법에 의한 결과에서 정상세포도 일정수준의 Caspase-3과 -7이 발현됨을 확인할 수 있었고, 그 원인은 세포에서 스스로 문제가 있는 세포를 제거하는 기능과 Apoptosis 외 다른 경로에 의해 일부 발현될 수 있다는 보고와 일치하는 것으로 생각된다(Smolewski 등, 2002). pBM-MSCs에서 이 효소의 발현을 직접 비교한 연구가 없어 비교할 수 없지만 동결 시 동결 독성과 동결 보호제의 독성으로 이 효소의 활성이 유발됨을 실험 결과를 통해 확인할 수 있었다. 특히 20% DMSO의 경우 더 많은 독성을 유발하였고, 5%와 10% DMSO 간에는 차이가 없음을 확인할 수 있었다.
1과 같이 Ficoll-Paque Plus를 이용하여 골수로부터 분리된 세포는 평판 배양법에 의해 adherent condition 조건 아래에서 성공적으로 배양되었다. 그리고 fibroblast like cell과 같은 형태로 spindle-shaped cells의 형태를 보임을 관찰할 수 있었고, 또한 성체 줄기세포와 배아 줄기세포에서 보이는 colony formation이 관찰되었다.
1%)은 유의적으로 높게 활성화된 Caspase-3과 -7이 발현되는 것을 확인할 수 있었지만 5%와 10% DMSO 군간에는 유의성이 존재하지 않았다. 그리고 아무런 처리를 하지 않은 세포에서도 일정수준의 Caspase-3과 -7의 발현이 존재함을 확인할 수 있었다. 20% DMSO 군(60.
대조군(37.3±0.6%)과 비교하여 5%와 10%, DMSO 군(56.0±0.1%, 54.0±0.1%)은 유의적으로 높게 활성화된 Caspase-3과 -7이 발현되는 것을 확인할 수 있었지만 5%와 10% DMSO 군간에는 유의성이 존재하지 않았다.
또 다른 특징 중 하나는 세포가 세포밀도 구배 의존적으로 배양을 하지 않고, 세포의 outgrowth에 의한 colonies의 형성이다(Ock 등, 2010). 선행 보고들과 같이 이 연구에서 사용된 pBMMSCs의 경우도 같은 특성을 보임으로써 성공적으로 추출 배양되었음을 확인할 수 있었다.
아무런 처리를 하지 않은 대조군과 비교하여 5% DMSO 군의 생존율은 유의성이 없었다(90.4±1.8% vs. 86.2±7.4%).
그리고 이 분석 방법은 일반적으로 많이 사용되는 후기 apoptosis에 나타나는 DNA의 절단을 관찰하는 terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP nick end labeling(TUNEL) 염색이나 세포 내막에 존재하는 phosphatidyl serine(PS)의 외부 노출을 Annexin V staining 을 통해 확인하는 방법보다 직접적으로 세포의 운명을 확인 할 수 있는 방법이라 할 수 있다(Bedner 등, 2000). 이 분석법에 의한 결과에서 정상세포도 일정수준의 Caspase-3과 -7이 발현됨을 확인할 수 있었고, 그 원인은 세포에서 스스로 문제가 있는 세포를 제거하는 기능과 Apoptosis 외 다른 경로에 의해 일부 발현될 수 있다는 보고와 일치하는 것으로 생각된다(Smolewski 등, 2002). pBM-MSCs에서 이 효소의 발현을 직접 비교한 연구가 없어 비교할 수 없지만 동결 시 동결 독성과 동결 보호제의 독성으로 이 효소의 활성이 유발됨을 실험 결과를 통해 확인할 수 있었다.
이 연구는 성체줄기세포를 이용한 세포 치료을 위해서 선결조건인 안전한 동결보존 방법의 개발과 동시에 세포동결 보호 제인 DMSO와 동결 자체가 세포사 중 apoptosis에 미치는 독성 효과를 규명하는 것이었다. 이 연구는 특히 apoptosis 경로 중외부 자극에 의한 미토콘드리아 내막에 존재하는 사이토크롬 C의 방출과 최종적으로 단백질 분해효소인 Caspase-3과 -7의 활성에 의한 발현을 조사함으로써 apoptosis의 형태적 발현 정도가 아닌 실제적인 효소 발현 경로를 조사하였다, 그 결과 정상세포에도 이 효소는 일정 수준이 발현됨으로써 비정상적인 세포를 제거하는 역할을 한다는 것을 규명하였고, 동시에 동결과 동결 보호제의 독성이 이 단백질 분해 효소의 과발현으로 세포 사멸에 치명적인 효과를 나타낼 수 있음을 규명하였다.
이상의 결과들로부터 관례적인 10% 농도보다 감소된 5% DMSO 를 이용한 동결 보호제의 사용도 10% DMSO를 사용한 동결과 같은 효과를 볼 수 있음을 생존율 조사와 Caspase-3과 -7의 활성 경로의 확인을 통하여 확인할 수 있었다. 최종적으로 이러한 연구 결과는 세포의 동결보존 연구와 상업적인 줄기세포 보존기술 향상에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.
pBM-MSCs에서 이 효소의 발현을 직접 비교한 연구가 없어 비교할 수 없지만 동결 시 동결 독성과 동결 보호제의 독성으로 이 효소의 활성이 유발됨을 실험 결과를 통해 확인할 수 있었다. 특히 20% DMSO의 경우 더 많은 독성을 유발하였고, 5%와 10% DMSO 간에는 차이가 없음을 확인할 수 있었다. 그러나 비록 이 효소가 과발현이 모든 세포를 apoptosis로 진행시키는 것은 아니며, 적절한 억제 유전자의 발현 신호가 오게 되면 apoptosis는 감소될 수도 있다.

후속연구

이상의 결과들로부터 관례적인 10% 농도보다 감소된 5% DMSO 를 이용한 동결 보호제의 사용도 10% DMSO를 사용한 동결과 같은 효과를 볼 수 있음을 생존율 조사와 Caspase-3과 -7의 활성 경로의 확인을 통하여 확인할 수 있었다. 최종적으로 이러한 연구 결과는 세포의 동결보존 연구와 상업적인 줄기세포 보존기술 향상에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	줄기세포 연구가 치명적인 질환의 치료를 위한 목적으로 사용되는 이유는 무엇인가?	최근 줄기세포 연구는 가까운 미래에 치료될 수 없는 치명적인 질환 치료를 위한 목적으로 사용되고 있다. 줄기세포의 경우, 노화되거나 질병에 걸린 세포를 대체할 수 있는 능력을 가지고 있는 것으로 알려져 있기 때문이다(Bhandari 등, 2011; Aldahmash 등, 2012). 줄기세포는 성체 줄기세포와 배아 줄기세포로 크게 나뉘어지고 있으며, 비교적 최근에는 다양한 체세포 유래 유도 만능 줄기세포들이 Oct4, Sox2, c-Myc, Nanog, Klf4등의 유전자들이 바이러스 등을 이용하여 만들어지고 있다 (Yamanaka, 2007).
	성체 줄기세포는 어떤 것에 유래해서 나누어지는가?	일반적으로 성체 줄기세포는 hematopetic-, mesenchymal-, neural-, skin-, umbilical cord- 유래로 나뉘어진다. 이중 mesenchymal stem cells(MSCs)은 비교적 분리가 수월하며, 다양한 조직(골수, 지방, 진피 등)에서 추출할 수 있는 장점을 가지고 있다(Magatti 등, 2008) 그러나 MSCs의 경우 성체에서 추출함으로써 체외에서 장기간 배양 시 세포의 특성이 변하거나 줄기세포 능이 감소할 수 있는 위험성이 있는 것으로 알려져 있다(Røsland 등, 2009).
	DMSO란 무엇인가?	세포 동결 시 가장 일반적으로 사용되는 동결 보호제인 dimethyl sulfoxide(DMSO)는 사람에서 이 동결 보호제가 첨가된 세포를 이식하였을 때 저혈압, 심장부정맥, 오심 등 각종 부작용을 유발할 수 있는 것으로 알려져 있다(Davis 등, 1990; Zambelli 등, 1998). 따라서 본 연구에서는 이러한 DMSO 동결 보호제의 독성을 규명하고, 이를 개선하기 위하여 apoptosis에 관여하는 주요 경로인 미토콘드리아 내에서 시토크롬 c(cytochrome c)의 방출과 동시에 세포질(cytoplasm)에 존재하는 apoptotic protease activation factor(Apaf1)와 Caspase(cysteine-aspartic acid specific proteases) 9의 결합에 의한 apoptosome의 형성에 의한 Caspase-3과 -7의 절단 활성(Thornberry 등, 1997)에 의한 핵단 백질 절단 경로를 분석함으로써 세포 사멸에 미치는 농도별 DMSO의 효과를 돼지 골수 유래 중간엽 줄기세포(porcine bone marrow derived mesenchymal stem cells(MSCs), pBM- MSCs) 를 사용하여 분석하였다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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