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제안 방법
- 16S rDNA는 제조는 Wizard genomic DNA purification kit를 이용하여 gDNA를 분리하고, 프라이머[정방향: 5'-TCA CCA AGG CRA CGA TGC G-3', 역방향: 5'-CGT ATT CAC CGC GGC ATG-3']를 사용하여 PCR [94℃에서 5분; 이후, 94℃에서 30 초(denaturation), 54℃에서 40 초(annealing), 및 72℃에서 90 초(extension)의 30 사이클]을 수행하여 1100 bp의 PCR 산물을 얻고 이를 T-easy 벡터에 접합(ligation)시 킨 후 JM 109 (Promega 사)에 형질전환(transformation)하였다.
- KH-07 균주의 동정은 먼저 그람 염색, Voges-Prokauer, indole, methyl red, 질산환원력, oxidase, urease, catalase 시험, citrate, casein, gelatin, starch, glucose, arabinose, xylose, amygdalin 이용성 시험, 16S rDNA를 sequence를 분석하여 분석하였다. 10)
- 16S rDNA는 제조는 Wizard genomic DNA purification kit를 이용하여 gDNA를 분리하고, 프라이머[정방향: 5'-TCA CCA AGG CRA CGA TGC G-3', 역방향: 5'-CGT ATT CAC CGC GGC ATG-3']를 사용하여 PCR [94℃에서 5분; 이후, 94℃에서 30 초(denaturation), 54℃에서 40 초(annealing), 및 72℃에서 90 초(extension)의 30 사이클]을 수행하여 1100 bp의 PCR 산물을 얻고 이를 T-easy 벡터에 접합(ligation)시 킨 후 JM 109 (Promega 사)에 형질전환(transformation)하였다. Positive clone에서 플라스미드를 다시 분리해 내어 T7, SP6 프라이머를 이용하여 서열분석하였다.
- 간장 손상 보호 효과 − 랫트(웅성, 180~200 g) 1군을 5마리로 하여 100그램당 20% 사염화탄소(올리브유로 희석)을 1 sml 씩 경구투여하고 30분 후에 생리식염수, 녹용추출물, Py-92 녹용발효추출물, KH-07 녹용발효추출물을 100 mg/ kg 경구투여하였다.
- 그러나, Py-92 로 발효시킨 녹용은 이취를 나타냈다. 그러므로 녹용의 추출율을 높이면서 효능이 극대화되는 균주를 왕겨 및 쌀겨 Bacillus 속 균주로 검색하였다. 녹용발효가 우수하면서 이 취가 가장 적은 균주는 KH-07 였다.
- 녹용 및 발효녹용의 간장 손상 보호 효과 − 사염화탄소로 생쥐에 간손상을 유발시켜 녹용추출물 및 발효녹용추출물의 간장보호효과를 측정하였다(Table IV).
- 녹용 및 발효녹용의 분변의 수분 함량에 미치는 영향 − 녹용추출물 및 발효녹용추출물을 생쥐에 투여하여 분변중의 수분 함량 변화에 대해 조사하였다(Table V).
- 녹용 분해 균주의 분리 및 동정 − 왕겨 및 쌀겨(약 0.5 g) 를 tryptic soy broth(50 ml)에 현탁하고, 상등액을 다시 tryptic soy broth로 100배 희석하여 tryptic soy agar 배지에 이식하고 24시간 동안 37℃에서 배양하여 자라나온 콜로니에 녹용발효균주 검색 배지(50 mg의 녹용 덩어리를 증류수 2 ml에 넣고 멸균한 것)에 이식하고, 48시간 내에 녹용분해 (녹용덩어리붕해)하는 균주를 녹용분해균주 양성으로 하였다.
- 간장 손상 보호 효과 − 랫트(웅성, 180~200 g) 1군을 5마리로 하여 100그램당 20% 사염화탄소(올리브유로 희석)을 1 sml 씩 경구투여하고 30분 후에 생리식염수, 녹용추출물, Py-92 녹용발효추출물, KH-07 녹용발효추출물을 100 mg/ kg 경구투여하였다. 사염화탄소 투여 24시간 후에 심장으로부터 채혈하여 혈중 AST 및 ALT 농도를 측정하였다. 12)
- 설사 발생율 및 수분함량 측정 − 생쥐(ICR 웅성, 20~22 g) 를 한군 5마리로 하여 생리식염수 0.5 ml에 현탁한 녹용과 녹용 발효물을 각각 0.5 g/kg 또는 1 g/kg씩 경구투여하여 설사발생율 및 분변 중 수분함량을 측정하였다.
- 항피로 효과 측정 − 25 × 40 × 17 cm의 투명한 플라스틱 용기에 증류수를 14 cm까지 채우고 항온조의 온도를 18℃ 로 유지하면서 10개의 수영조에서 생쥐를 넣고 동시에 수 영시간을 측정하였다. 수영실험은 생쥐(ICR 웅성 20~25 g) 의 체중을 재고 체중에 8%의 납줄을 달아 목의 배면 부위에 고정하고, 생리식염수, 녹용추출물, Py-92 녹용발효추출물, KH-07 녹용발효추출물을 20 mg/kg 및 50 mg/kg 경구 투여하고 30분이 경과한 시점에서 동시에 수영을 시켰으며, 수영 종료시간은 코가 수면 아래로 잠길 때까지(수영이 5초가 진행 될 때까지)의 수영시간을 측정하여 수영가능시간으로 하여 계산하였다. 종료된 생쥐의 혈액을 즉시 채취하여 아산제약(주)의 크레아틴정량키트를 이용하여 혈중 크레아틴 양을 측정하였다.
- 이 Bacillus 균주를 이용하여 7일간 발효시키고, 상등액을 얻어 동결건조하여 추출 수율을 계산했다. 녹용을 수욕에서 추출했을 때 4%였으나, Py-92로 발효시켰을 때는 17%, KH07 균주로 발효시켰을 때는 34%였다.
- 이를 극복하기 위해 이취의 생성이 낮은 녹용발효 균주 KH-07를 왕겨(the husks of Oryza sativa)로부터 분리하였다. 이 균주로 녹용을 발효하여 녹용의 생리활성인 성장촉진작용, 조혈작용, 단백질 합성촉진작용, 면역활성증가작용 등의 활성을 반영할 수 있는 항피로효과와 녹용의 부작용인 설사발생율을 줄일 수 있는지를 생쥐를 이용하여 조사하였다.
- 이를 극복하기 위해 이취의 생성이 낮은 녹용발효 균주 KH-07를 왕겨(the husks of Oryza sativa)로부터 분리하였다. 이 균주로 녹용을 발효하여 녹용의 생리활성인 성장촉진작용, 조혈작용, 단백질 합성촉진작용, 면역활성증가작용 등의 활성을 반영할 수 있는 항피로효과와 녹용의 부작용인 설사발생율을 줄일 수 있는지를 생쥐를 이용하여 조사하였다.
- 수영실험은 생쥐(ICR 웅성 20~25 g) 의 체중을 재고 체중에 8%의 납줄을 달아 목의 배면 부위에 고정하고, 생리식염수, 녹용추출물, Py-92 녹용발효추출물, KH-07 녹용발효추출물을 20 mg/kg 및 50 mg/kg 경구 투여하고 30분이 경과한 시점에서 동시에 수영을 시켰으며, 수영 종료시간은 코가 수면 아래로 잠길 때까지(수영이 5초가 진행 될 때까지)의 수영시간을 측정하여 수영가능시간으로 하여 계산하였다. 종료된 생쥐의 혈액을 즉시 채취하여 아산제약(주)의 크레아틴정량키트를 이용하여 혈중 크레아틴 양을 측정하였다. 11)
- 항피로 효과 − 녹용추출물 및 발효녹용 추출물의 항피로 효과를 생쥐에 수영시간을 측정하는 방법으로 측정하였다 (Table III).
- 항피로 효과 측정 − 25 × 40 × 17 cm의 투명한 플라스틱 용기에 증류수를 14 cm까지 채우고 항온조의 온도를 18℃ 로 유지하면서 10개의 수영조에서 생쥐를 넣고 동시에 수 영시간을 측정하였다.
대상 데이터
- 실험재료 및 시약 − 녹용은 뉴질랜드산을 구입하였다. CCl4는 Sigma 사 (미국)으로부터 구입하였고, tryptic soy broth, tryptic soy agar는 B.D. (미국)으로부터 구입하였으며, Wizard genomic DNA purification kit 및 T-easy 벡터는 Promega 사 (미국), creatinine, aspartate aminotransferase (AST) 및 alanine aminotransferase (ALT) assay kit는 아산 제약(주)로부터 구입하였다.
- KH-07 발효녹용 추출물은 녹용(10 g)을 물 100 ml를 넣고 멸균하고, kH-07 균주를 1 × 104 CFU를 이식하여 7일간 배양하고 그 상등액을 동결건조한 것으로 사용하였다(수율 34%).
- 1%). Py92 발효 녹용추출물은 녹용(10 g)을 물 100 ml를 넣고 멸균하고, Py-92 균주를 1x104 CFU를 이식하여 7 일간 배양하고 그 상등액을 동결건조한 것으로 사용하였다(수율 17%). KH-07 발효녹용 추출물은 녹용(10 g)을 물 100 ml를 넣고 멸균하고, kH-07 균주를 1 × 104 CFU를 이식하여 7일간 배양하고 그 상등액을 동결건조한 것으로 사용하였다(수율 34%).
- 5 g) 를 tryptic soy broth(50 ml)에 현탁하고, 상등액을 다시 tryptic soy broth로 100배 희석하여 tryptic soy agar 배지에 이식하고 24시간 동안 37℃에서 배양하여 자라나온 콜로니에 녹용발효균주 검색 배지(50 mg의 녹용 덩어리를 증류수 2 ml에 넣고 멸균한 것)에 이식하고, 48시간 내에 녹용분해 (녹용덩어리붕해)하는 균주를 녹용분해균주 양성으로 하였다. 녹용 분해 활성을 갖는 균주를 21개 선별하고, 이 중에서 녹용분해하면서 이취가 가장 적은 균주 KH-07를 선별 했다. 이 균주는 한국종균협회 한국미생물보존세터(KCCM)에 기탁하였으며, 수탁번호는 KCCM 10885P이다.
- 녹용추출물의 제조 − 녹용추출물은 녹용(10 g)에 증류수 100 ml를 넣어 수욕상에서 4시간 추출하고 그 상등액을 동결건조한 것을 실험에 사용하였다(수율 4.1%).
- 5 g/kg 또는 1 g/kg씩 경구투여하여 설사발생율 및 분변 중 수분함량을 측정하였다. 대조약물로는 망초를 사용하였다.
- 실험재료 및 시약 − 녹용은 뉴질랜드산을 구입하였다.
- 녹용 분해 활성을 갖는 균주를 21개 선별하고, 이 중에서 녹용분해하면서 이취가 가장 적은 균주 KH-07를 선별 했다. 이 균주는 한국종균협회 한국미생물보존세터(KCCM)에 기탁하였으며, 수탁번호는 KCCM 10885P이다.
데이터처리
- 통계 − 대조군에 대한 실험군의 통계학적 유의성은 Student's two-tailed t-test로 분석하였다(p < 0.05).
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