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문제 정의
- 본 연구에서는 최근 천연물 이용 추세에 따라 민간에서도 위장병 치료에 사용되는 오리나무을 선택하여 열수 추출물이H. pylori의 저해 효과와 여러 실험 위궤양 및 위염 모델에서 기존의 치료제와 효능을 비교하여 기능성식품 재료로 개발하고자 하였다.
- 본 실험에서는 오리나무 열수추출물이 H. pylori 성장저해, H+/K+-ATPase 활성도 저해 및 흰쥐에서 실험적으로 유도한 급성위염, 위궤양에 미치는 영향에 대하여 실험하여 다음과 같은 결과를 얻었다. H.
제안 방법
- Brucella broth에 72시간 배양된 H. pylori(ATCC 43504)를 2,500 rpm으로 10분간 원심분리하여 흡광도가 1.2가 되도록 현탁 시킨 후, 현탁액 200 ml를 취해 20 ml로 제조된 columbia blood agar 배지에 도말한 후, 여러 농도의 오리나무 열수추출물을 첨가한 멸균된 지름 8 mm paper disc(Advantec, Japan)를 올려놓고 10% CO2 조건하에서 37°C로 72시간 배양 후 disc 주위의 clear zone 생성유무로 항균활성을 확인하였다.
- -ATPase는 수소이온을 위의 내부로 분비시키는 작용을 하는 효소로 gastric acid로 분비시키는 마지막 작용을 하는 효소로 위궤양이나 위염에 주요한 작용을 하는 효소이다. H+/K+-ATPase의 효소원은 수퇘지의 위 점막층의 microsome을 분리하여 사용하였으며, ATP로부터 유리된 무기인을 Sigma사(USA)의 Kit를 사용하여 정량하여 활성도를 측정하였다. 즉, 수퇘지 위 점막층으로부터 제조한 proton pump 효소(10 µg 단백질)에 여러 가지 농도의 오리나무 열수추출물과 비교 화학물질(Omeprazole)을 첨가하여 30분간 반응시킨 후 ATP로부터 유리된 무기인(Pi) 함량을 정량하여 proton pump 저해 정도를 측정하였다.
- H. pylori에 대한 in vitro 실험은 여과지 원판법과 요소 분해효소(urease) 활성측정법을 이용하여 오리나무 열수 추출물의 H. pylori에 대한 항균효과를 관찰하였다.
- HCl-ethanol 위 손상 실험 − 수컷 흰쥐 8마리를 1군으로 하여 36시간 절식시킨 후에 Mizui 등의 방법11)에 따라 오리나무 열수추출물을 0, 200, 500 mg/kg 농도로 0.5% carboxymethylcellulos (CMC)에 현탁 후 경구 투여하고, 이때 대조약물로는 omeprazole 100 mg/kg을 사용하였다.
- The inhibitory activities were determined by measuring the activity of H. pylori urease described in Materials and Methods.
- 5, 0 mg/ml 씩 첨가한 후 37˚C, 10% CO2 incubator에서 4일간 배양하면서 매 24시간마다 시료를 채취하여 uease 활성을 측정하였다. Urease activity의 측정은 urea와 phenol red를 포함한 urea broth (Difico, USA)와 배양액 또는 시료를 5:1 비율로 섞어 1시간 동안 반응시킨 후 540 nm 에서의 흡광도를 측정하여 urease activity를 결정하였다.
- 건조된 목부를 작게 파쇄한 뒤, 15배 용량의 물을 첨가하여 120°C에서 4시간 동안 끓여서 1회 추출한 뒤 다시 동량의 물을 첨가하여 위와 동일한 방법으로 2회 추출을 실시하였다.
- 에 따라 수컷 흰쥐 8마리를 1군으로 하여 36시간 절식시킨 후 오리나무 열수추출물을 경구투여하고 30분이 지난 다음 stress cage에 넣어 수온을 21 ± 1°C로 유지하면서 검상돌기가 물에 잠기도록 물 속에 넣고 8시간 동안 방치하였다. 그 후 ether 마취 하에서 위를 적출하고 2% formalin에 넣어 5분 동안 고정한 후 위의 대만부를 따라 절개한 다음 펼친 후에 발생된 궤양면적(mm2)을 측정하여 궤양 억제율을 계산하였다. 대조약물로는 omeprazole를 경구투여 하였다.
- 그 후 ether 마취 하에서 위를 적출하고 2% formalin에 넣어 5분 동안 고정한 후 위의 대만부를 따라 절개한 다음 펼친 후에 발생된 궤양면적(mm2)을 측정하여 궤양 억제율을 계산하였다. 대조약물로는 omeprazole를 경구투여 하였다.
- pylori 제균에 사용하고 있다. 따라서 오리나무가 항균작용을 나타냄과 동시에 proton pump를 저해한다면 이상적인 위장관 치료제 및 예방제로서의 가치를 지니게 될 것으로 사료되어 오리나무 열수 추출물에 의한 proton pump 활성 저해 정도를 측정하였다. 양성 대조군으로 proton pump의 대표적 저해제인 omeprazole을 사용하여 그 저해 정도를 관찰하였을 때 omeprazole에 의하여 농도 의존적으로 proton pump 활성이 저해됨을 확인하였다(Fig.
- 수침·구속 위궤양 실험 − Hayase와 Takeuchi의 방법12)에 따라 수컷 흰쥐 8마리를 1군으로 하여 36시간 절식시킨 후 오리나무 열수추출물을 경구투여하고 30분이 지난 다음 stress cage에 넣어 수온을 21 ± 1°C로 유지하면서 검상돌기가 물에 잠기도록 물 속에 넣고 8시간 동안 방치하였다.
- 실험동물 − 실험동물은 5주령 체중 150~170 g의 SpragueDawley계 수컷 흰쥐를 코아텍(평택) 에서 구입하여 사육기간 중 온도는 22±2°C, 상대습도는 40~70% 및 조명시간은 12시간을 유지한 animal chamber에서 1주간 고형배합사료(퓨리나)로 적응시킨 후 난괴법 (randomized complete block design)으로 8마리씩을 한 군으로, 음성대조군(생리식염수 1 ml 투여, CON), 저용량투여군(오리나무 열수 추출물 200 mg/kg/1 ml 투여, AJ200), 고용량투여군(오리나무 열수추출물 500 mg/kg/ml 투여, AJ500) 및 양성대조군(대조약물로 omeprazole 100 mg/kg/ml 투여, Ome)의 4군으로 분류하였다.
- 오리나무 열수추출물을 경구투여 한 후 30분에 indomethacin (25 mg/kg)을 피하주사하고 절식, 절수 하에서 7시간 동안 방치 후 ether로 마취하여 위를 적출하여 손상지수를 구하였다. 양성 대조약물로는 omeprazole 100 mg/kg을 경구투여 하였다.
- 에 준하여 실험하였다. 오리나무 열수추출물을 경구투여 한 후 30분에 indomethacin (25 mg/kg)을 피하주사하고 절식, 절수 하에서 7시간 동안 방치 후 ether로 마취하여 위를 적출하여 손상지수를 구하였다. 양성 대조약물로는 omeprazole 100 mg/kg을 경구투여 하였다.
- 오리나무 경구투여 1시간 후에 60% ethanol과 150 mM HCl (1 ml)을 경구 투여하고 절식, 절수하여 1시간 후에 ether 마취 하에 위를 적출하여 2% formalin 용액에 넣어 1시간 동안 고정시켰다. 이어서 위의 대만부를 따라 절개하여 펼친 후에 위손상 길이(mm)를 측정하여 그 합을 손상지수로 하였으며 사진을 촬영하였다.
- 즉, 수퇘지 위 점막층으로부터 제조한 proton pump 효소(10 µg 단백질)에 여러 가지 농도의 오리나무 열수추출물과 비교 화학물질(Omeprazole)을 첨가하여 30분간 반응시킨 후 ATP로부터 유리된 무기인(Pi) 함량을 정량하여 proton pump 저해 정도를 측정하였다.
- 최소 억제농도 판정은 brucella broth (Difico, USA)를 24well plate에 넣고 H. pylori 균액을 well 당 ~1 × 107 colony/ml 씩 가하고, 추출물을 well 당 1000, 500, 250, 125, 62.5, 0 mg/ml 씩 첨가한 후 37˚C, 10% CO2 incubator에서 4일간 배양하면서 매 24시간마다 시료를 채취하여 uease 활성을 측정하였다.
- 5% CMC에 현탁시켜 사용하였다. 투여방법은 위손상 유발법에 따라 경구투여 및 피하주사 중 적합한 방법을 선택하여 실시하였고 사료 및 음료수는 자유로이 섭취토록 하였다.
대상 데이터
- 2회 추출을 실시하여 얻어진 열수추출물을 rotary evaporator (BuCHI R-220, Switzerland)로 80~85°C에서 농축한 후 8일간 동결건조 (SamWon SFDTS10K, Korea)하여 오리나무 추출분말을 얻어 실험에 사용하였다.
- 실험재료 − 오리나무(어린가지 포함)는 경기도 화성시 쌍학리에서 2004년 2월에 채취하였다.
- 실험재료 − 오리나무(어린가지 포함)는 경기도 화성시 쌍학리에서 2004년 2월에 채취하였다. 오리나무의 껍질 부분을 제거한 뒤 음지에서 약 2개월 이상 건조한 후 추출에 사용하였으며 어린가지는 수피를 포함하여 추출에 사용하였다. 건조된 목부를 작게 파쇄한 뒤, 15배 용량의 물을 첨가하여 120°C에서 4시간 동안 끓여서 1회 추출한 뒤 다시 동량의 물을 첨가하여 위와 동일한 방법으로 2회 추출을 실시하였다.
이론/모형
- Indomethacin 위 손상 실험 − 수컷 흰쥐 5마리씩을 1군으로 하여 36시간 절식시킨 후 Urushidani 등의 방법10)에 준하여 실험하였다.
성능/효과
- 20) Omeprazole의 proton pump 저해작용은 수침·구속 스트레스에 의한 위산분비 항진작용을 크게 저해시켜 거의 완전히 위궤양을 저해시켰다.
- 21 ± 1°C수조에서 8시간 동안 수침·구속을 가한 후 흰쥐의 위점막 손상정도를 관찰하였을 때 오리나무 열수추출물을 전처리 하였을 때 대조약물인 omeprazole에 의한 보호효과(97%) 보다는 매우 약했으나, 200과 500 mg/kg 처리군에서 각각 29%와 39.5%가 저해되었으며, 궤양이 농도의존적으로 유의적으로 억제되었다.
- 17) 그리고 이러한 HCl-ethanol에 의한 위 손상 보호 작용은 위점막 표면에 도말하여 위점막에 대한 직접적인 자극을 차단하고 HCl-ethanol에 의한 위점막의 barrier를 보호하고 H+ 이온의 역확산을 방지하므로써 HCl에 의한 위운동 항진을 완화시켜 분비작용을 억제하는 것을 포함하여, 주로 산소 라디칼의 제거능에 기인한다고 알려져 있다.5) 본 연구에서는 질경이나 지유가 투여용량과 관계없이 HCl-ethanol에 의한 위 손상을 보호하는 것5,6)과는 달리 용량 의존적으로 HCl-ethanol 유도 급성 위염을 저해하였으며 이는 애엽추출물의 결과와 유사하게 나타났다. 오리나무 열수추출물은 비록 고농도가 요구되나 proton pump 저해작용도 나타내므로 HCl-ethanol 유도 급성 위염 저해작용에 위산분비 저해작용도 일부 관여할 것으로 사료되었다.
- HClalcohol 유도 급성위염에서 오리나무 열수추출물 전처리에 의하여 용량의존적으로 위병변 억제효과를 나타내었으며, 200 mg/kg과 500 mg/kg 용량에서 각각 50.1% (P<0.05)와 71.2% (P<0.001)가 저해되었다.
- Indomethacin 유도 위염 모델에 대한 오리나무 추출물의 효과 − CMC 현탁액을 먹인 대조군(NT)은 indomethacin으로 유도한 급성 궤양이 크게 나타났다(Fig. 4-A).
- 그리고 오리나무 열수추출물을 전처리 하였을 때 투여용량 모두에서 대조군과 비교하였을 때 용량의존적으로 위병변 억제효과를 나타내었으며(Fig 3-A), 오리나무 열수추출물 200 mg/kg과 500 mg/kg을 처리하였을 때는 각각 50.1% (P<0.05)와 71.2% (P<0.001)가 저해되었다(Fig. 3-B).
- 5-A와 같이 위궤양이 97% 정도가 저해되었다. 그리고 오리나무 열수추출물을 전처리하였을 때 농도의존적으로 궤양이 유의적으로 억제되었으며, 200과 500 mg/kg을 처리군에서 각각 29%와 39.5%가 저해되었다. 수침·구속 스트레스 위궤양은 미주신경을 흥분시켜 위산분비 항진, 위운동 항진, 혈류장애 등을 유발하고 이로 인하여 위궤양이 형성 된다고 보고되었다.
- 소화성 궤양은 발생빈도가 높은 질환임에도 불구하고 정확한 발생원인에 대해서는 잘 알려져 있지 않고, 만족할 만한 치료제가 없는 난치성 질환으로 알려져 있어, 이에 따라 다양한 천연물 유래 항궤양 효능을 가진 재료들이 활발하게 연구되고 있다. 대표적으로 애엽의 주정 추출물이 강력한 항궤양작용이 있음을 발견하였으며, 그 중 flavonoid 화합물인 eupatilin과 Jaceosidin이 유효 성분임을 확인하여 이를 상품명 스틸렌으로 개발되었다.4) 그외 현초, 인삼, 고삼, 도라지, 감잎, 양배추, 복분자, 지유 및 질경이 등 여러 식용 식물 및 약용식물들이 항궤양 효능을 가진 재료로 보고된 바 있다.
- 3 µg/ml 이었다. 비록 오리나무 열수추출물 고농도에 의하여 proton pump활성이 저해되더라도 오리나무 열수추출물을 건강기능식품으로 개발하게 되면 상대적으로 고용량을 경구로 투여하게 될 것이며, 위장 내의 농도가 쉽게 mg/ml 농도에 도달될 수 있을 것이므로 H. pylori가 성장저해와 함께 proton pump 활성 저해가 의미 있을 것으로 사료되었다.
- 따라서 오리나무가 항균작용을 나타냄과 동시에 proton pump를 저해한다면 이상적인 위장관 치료제 및 예방제로서의 가치를 지니게 될 것으로 사료되어 오리나무 열수 추출물에 의한 proton pump 활성 저해 정도를 측정하였다. 양성 대조군으로 proton pump의 대표적 저해제인 omeprazole을 사용하여 그 저해 정도를 관찰하였을 때 omeprazole에 의하여 농도 의존적으로 proton pump 활성이 저해됨을 확인하였다(Fig. 2-A). 오리나무 열수추출물에 대한 proton pump 저해 정도를 측정하였을 때 고농도인 500 µg/ml 농도에서 약 35% 내외의 저해작용을 나타내었으며, 이때 IC50 값은 약 806.
- 오리나무 열수추출물에 의하여 proton pump가 매우 약하게 저해되어 500 µg/ml 고농도에서 약 35% 내외의 proton pump 저해작용을 나타내었으며, 오리나무 열수추출물에 의한 proton pump IC50 값은 약 806.3 µg/ml이었다.
- 오리나무 열수추출물은 Fig. 1에서와 같이 500 µg/ml 에서부터 H. pylori에 대한 항균효과를 나타내어 24시간에서 500 µg/ml 농도에서 약 37.4%, 1,000 µg/ml 농도에서 61.4%가 성장이 저해되었으며, 48 시간 경과 후부터는 두 농도에서 H. pylori 성장이 거의 정지되었다.
- 5) 본 연구에서는 질경이나 지유가 투여용량과 관계없이 HCl-ethanol에 의한 위 손상을 보호하는 것5,6)과는 달리 용량 의존적으로 HCl-ethanol 유도 급성 위염을 저해하였으며 이는 애엽추출물의 결과와 유사하게 나타났다. 오리나무 열수추출물은 비록 고농도가 요구되나 proton pump 저해작용도 나타내므로 HCl-ethanol 유도 급성 위염 저해작용에 위산분비 저해작용도 일부 관여할 것으로 사료되었다.
- pylori의 증식을 억제할 수 있는 성분을 밝혀내기 위한 다양한 연구가 진행되었다. 유산균의 일종인 락토바실러스 균과 계란 노른자, 생약제인 복분자, 홍삼, 적포도주, 생강 및 녹차 등에서 H. pylori 세균 증식을 억제하는 성분이 규명되었다.7,13-14) 그러나 H.
- 이러한 결과는 수침·구속 스트레스에 위산분비가 위궤양 형성에 큰 영향을 미치는 것을 나타내는 것으로, 오리나무 열수추출물에 의하여 농도의존적으로 위산분비가 저해되어 부분적으로 위궤양 형성을 보호하는 것으로 사료되었다.
- 즉, 오리나무 열수추출물 처리 후 24시간에서 500 µg/ml 농도에서 약 37.4%, 1,000 µg/ml 농도에서 61.4%가 성장이 저해되었으며, 48시간 경과 후 부터는 두 농도에서 H. pylori 성장이 거의 정지되었다.
- 평판 실험의 경우 원판주변에 균이 성장하지 못하여 생성 되는 원형 부분의 크기를 측정하여 항균효과를 관찰하는 것이나 여러 농도 별로 측정하는 것이 오차가 크게 나타났으며 오리나무 열수추출물 농도 차에 따른 저해 정도는 잘 관찰할 수 없었다.
후속연구
- pylori 제균에 한약재 단독 사용 보다는 보조제로서 추천하였다.15) 비록 오리나무 열수추출물이 고농도에서 항균작용을 나타내고 H. pylori 증식을 in vitro에서 저해한다고 해서 in vivo에서 반드시 저해하지는 않을 수 있으나 지속적인 투여에 의하여 오리나무 열수추출물이 위장관 보호제로 작용하는 데 도움을 줄 수 있을 것으로 사료되었다.
- 5%가 저해되었으며, 궤양이 농도의존적으로 유의적으로 억제되었다. 앞으로 다양한 연구를 통하여 정확한 기전을 확인해야 할 것이나, 이상의 실험결과에서 오리나무 열수추출물에 의한 위염 및 위궤양 개선효과는 매우 약하지만 H. pylori 성장 저해 및 proton pump 저해 효능과 더불어 항산화 효과에 의할 것으로 예상되었다. 좀 더 상품화를 위한 연구를 통하여 앞으로 위염 및 위궤양 개선을 위한 건강기능성 식품으로 개발이 가능할 것이다.
- pylori 성장 저해 및 proton pump 저해 효능과 더불어 항산화 효과에 의할 것으로 예상되었다. 좀 더 상품화를 위한 연구를 통하여 앞으로 위염 및 위궤양 개선을 위한 건강기능성 식품으로 개발이 가능할 것이다.
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