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문제 정의
- 이를 근거로 각종 질병을 치료하고자하는 연구가 활발하게 진행되고 있다. 본 연구에서는 민간적으로 항염증 활성이 있다고 알려지는 181종의 국내 자생식물을 대상으로 프리라디칼 소거 작용, 과산화물 소거 작용, LPS에 의해 유도된 대식세포 내 NO 생성을 측정하여 우수한 항산화 및 항염증 효과를 지닌 천연물을 탐색하여 만성 염증성 질환 치료제로서의 이용 가능성을 제시하고자 한다.
제안 방법
- 9 mL을 가한다. 각 시료는 5가지 농도로 조제하였다. Vortex mixer로 10초간 진탕한 후 37oC에서 30분 동안 incubation 시킨 후, spectrophotometer를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 국내자생식물 181종, 228개 추출물의 최종농도를 12.5, 25, 50, 100 µg/mL로 정하여 free radical scavenging activity와 superoxide anion radical scavenging activity를 조사하였다(Table I).
- Vortex mixer로 10초간 진탕한 후 37oC에서 30분 동안 incubation 시킨 후, spectrophotometer를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료를 첨가하지 않은 음성 대조군과 비교하여 자유라디칼 소거활성은 백분율로 나타내고, 50% 저해 농도(IC50)값을 계산하였다.
- 즉, RAW 264.7 macrophage cell을 DMEM으로 medium 1 mL 당 5 × 104개만큼 배양시킨 다음, 1 mL 당 1 × 104개로 희석하여 96 well 에 160 µl 씩 넣고 2시간 동안 배양해서 cell이 부착되도록한 다음 LPS (1 µg/mL) 20 µl, (+) control인 L-NMMA (NO production inhibitory agent)을 포함한 각각의 시료를 20 µl 씩 넣고 20시간 배양시킨 후, 배양액에 생성되어 있는 NO의 양을 Griess reagent를 이용하여 정량하였다.
대상 데이터
- 기기 및 시약 − 항산화 측정 실험에 사용된 시약인 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl), L-ascorbic acid, hypoxanthine, xanthine oxidase, nitro blue tetrazolium (NBT), EDTA, allopurinol, Lipopolysaccaride (LPS), L-NMMA는 Sigma Aldrich (Milw., WI, USA)에서 구입하였다.
- 7 macrophage cell은 Korean Cell Line Bank (KCLB)으로부터 분양받아 사용하였으며, 세포배양을 위한 DMEM 배지에 1% 항생제(penicillin G/streptomycin)와 10% FBS (WEL GENE, Korea)을 첨가하여 사용하였다. 배양용기는 SPL LIFESCIENCE, (Kyeong-ki, Korea) 제품을 사용하였다. 이들 세포주는 37oC에서 5% CO2에 적응시켜 배양하였으며, 2~3일마다 계대 배양하면서 실험에 사용하였다.
- 세포주 및 배양 − 실험에 사용한 마우스 대식세포주 RAW 264.7 macrophage cell은 Korean Cell Line Bank (KCLB)으로부터 분양받아 사용하였으며, 세포배양을 위한 DMEM 배지에 1% 항생제(penicillin G/streptomycin)와 10% FBS (WEL GENE, Korea)을 첨가하여 사용하였다.
- 실험 재료 − 181종의 국내자생식물 메탄올 추출물은 한국식물추출물은행 (한국생명공학연구원)으로부터 건조된 시료를 구입하여 사용하였으며, 각 추출물은 중앙대학교 약학대학 생약학 연구실에 보관하고 있다.
- 이상 본 연구에서는 181종의 국내자생식물 중 228개의 부위별 메탄올 추출물을 대상으로 항산화 및 항염 활성을 탐색하였다. 그 결과, 최종 선정된 5종의 국내자생식물은 여러 가지 인자의 복합적인 작용에 의해 발생하리라 여겨지는 염증성 질환 치료제 개발의 기초 자료로서 활용 가치가 매우 높다고 판단된다.
이론/모형
- LPS 의해 유도된 NO 생성 억제 작용 측정 − NO 측정은 LPS (lipopoly-saccharide)를 이용, RAW 264.7 macrophage cell에서 NO synthase enzyme을 발현시키고 생성된 NO의 양을 Griess의 방법으로 측정하였다.
- Superoxide anion radical 소거능 측정 − Superoxide anion radical 소거능 측정은 nitroblue tetrazolium (NBT) 환원방법에 의해 측정하였다.
성능/효과
- 18) 장미과 식물인 조팝나무의 주요 화합물로는 β-sitosterol, campesterol, 3-O-acetyl pomolic acid methyl ester, p-hydroxy cinnamic acid methyl ester이고, 한방에서는 뿌리를 해열, 최토약, 말라리아에 사용하였으며, 민간에서는 해열, 학질에 달여먹은 것으로 전해진다.
- p>산화적 스트레스를 유발시키는 free radical은 수많은 화합물의 화학적 반응 및 여러 가지 산화, 환원 반응 등 내적 요인과 흡연, 음주, 스트레스, 대기오염 등 외적요인에 의해 생성되며,1,2) 생체 내에서 free radical 반응에 의해 생성되는 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)은 DNA 분절과 단백질의 불활성화 및 과산화 반응을 일으켜 생체기능을 저하시킴으로서 여러 질환을 유발하는 원인이 된다.3) 세포사이의 작용을 매개하는 산화질소(nitric oxide, NO)는 대식세포나 간세포에서 면역적인 자극에 의해 생성되고 항암 및 항균작용, 혈관 확장에 의한 혈액순환 개선 및 성기능 장애 개선 등의 순기능을 가지고 있으나,4,5) 여러 환경적 요인에 의해 과도하게 생성된 NO는 혈관투과성, 부종 등의 염증반응을 촉진시킬 뿐만 아니라 염증매개체의 생합성을 촉진하여 급성과 만성 염증에 대한 반응으로 조직의 손상 및 유전자 변이 등을 일으킬 수 있다.6-8) 이러한 결과로 동맥경화를 비롯한 고혈압, 관절염, 암이나 당뇨 등 만성 염증성 질환(chronic inflammatory disease)으로 발생하게 되고 임상에서는 이러한 질환이 차지하는 비중이 매우 높다.
- 5 이하의 IC50값을 나타낸 활성 추출물은 118개로 전체 중 절반 이상이 높은 저해활성을 나타내었으며, 속별 분포에서는 Quercus속 16개, Acer속 10개, Cornus속 10개, Rhus속 6개, 기타 순이었다. Free radical scavenging activity 및 superoxide anion radical scavenging activity 측정 결과, 모두 IC50값이 12.5 이하인 속 식물은 Alnus속, Quercus속, Cornus속, Rhus속으로 나타났다. Kim등17)은 총 폴리페놀의 양과 추출물의 항산화 활성과의 관련성을 단순 회귀분석을 통해 비교한 결과, 대부분 폴리페놀의 함량이 높을수록 항산화 활성이 높아 양의 상관관계(r=0.
- 5, 25, 50, 100 µg/mL로 정하여 free radical scavenging activity와 superoxide anion radical scavenging activity를 조사하였다(Table I). Free radical scavenging activity를 측정한 결과 12.5 이하의 IC50값을 나타낸 활성 추출물은 자두나무 줄기, 청시닥나무 잎, 물오리나무 수피, 좀사방오리나무 잎, 구실잣밤나무 줄기, 참죽나무 열매, 층층나무 잎, 곰의말채 나무 줄기, 말채나무 잎, 히어리 가지(잎), 말오줌때 열매, 소귀나무 가지, 굴피나무 열매, 돌배나무 줄기, 상수리나무 줄기, 갈참나무 줄기, 개가시나무 수피, 신갈나무 줄기, 참가시나무 잎, 굴참나무 줄기, 홍경천, 검양옻나무 줄기(잎), 정금나무 줄기, 졸참나무 줄기로 총 26개의 항산화 활성 추출물이 검색되었다. 속별 분포에서는 Quercus속 9개, Cornus 속 3개, 기타 순이었다.
- 속별 분포에서는 Quercus속 9개, Cornus 속 3개, 기타 순이었다. NBT/XO superoxdie 소거능을 측정한 결과 12.5 이하의 IC50값을 나타낸 활성 추출물은 118개로 전체 중 절반 이상이 높은 저해활성을 나타내었으며, 속별 분포에서는 Quercus속 16개, Acer속 10개, Cornus속 10개, Rhus속 6개, 기타 순이었다. Free radical scavenging activity 및 superoxide anion radical scavenging activity 측정 결과, 모두 IC50값이 12.
- 그 결과, 참가시나무 줄기 99 ± 1.8%, 조팝나무 잎 98 ± 0.9%, 물오리나무 수피 97 ± 1.1%, 개옻나무 잎 95 ± 1.6%, 좀사방오리나무 줄기 92 ± 0.7%의 순으로 저해 활성을 나타내어 NO합성 효소 억제제인 monomethyl-L-arginine (L-NMMA) 91 ± 0.7%보다 높은 NO 억제 활성을 나타내었다.
- 7%보다 높은 NO 억제 활성을 나타내었다. 또한, 개서어나무 줄기를 비롯한 7개의 추출물에서 80% 이상~92%미만의 활성을 그리고 말채나무 줄기 등 8개의 추출물에서 70% 이상~80% 미만의 활성을 나타내었다. 나머지 추출물은 70% 미만의 활성을 보였다.
- 이상과 같이, 두가지 항산화 결과를 기초로 우수한 그룹을 선별한 결과 총 99종의 추출물이 선정되었으며, 이들을 대상으로 최종농도 100 µg/mL로 정하여 Raw 264.7 macrophage cell 내 LPS 유도된 NO 억제 활성을 실시하였다(Table I).
후속연구
- 이상 본 연구에서는 181종의 국내자생식물 중 228개의 부위별 메탄올 추출물을 대상으로 항산화 및 항염 활성을 탐색하였다. 그 결과, 최종 선정된 5종의 국내자생식물은 여러 가지 인자의 복합적인 작용에 의해 발생하리라 여겨지는 염증성 질환 치료제 개발의 기초 자료로서 활용 가치가 매우 높다고 판단된다. 추가적인 연구로서, 이들 소재에 대한 활성 기반의 유효 화합물 규명이 필요하다고 사료되며, 이러한 화합물의 기전 연구를 통하여 동맥경화를 비롯한 고혈압, 암, 당뇨 그리고 관절염과 같은 염증성 질환(inflammation disease)의 예방과 치료에 효과적으로 사용할 수 있을 것으로 기대된다.
- 그 결과, 최종 선정된 5종의 국내자생식물은 여러 가지 인자의 복합적인 작용에 의해 발생하리라 여겨지는 염증성 질환 치료제 개발의 기초 자료로서 활용 가치가 매우 높다고 판단된다. 추가적인 연구로서, 이들 소재에 대한 활성 기반의 유효 화합물 규명이 필요하다고 사료되며, 이러한 화합물의 기전 연구를 통하여 동맥경화를 비롯한 고혈압, 암, 당뇨 그리고 관절염과 같은 염증성 질환(inflammation disease)의 예방과 치료에 효과적으로 사용할 수 있을 것으로 기대된다.
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