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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 미생물 생태학적 측면과 공중위생 및 임상의학적 측면에서 농장에서 발생하는 미생물들의 다약제 내성화에 대한 문제해결을 위한 기초연구로서, 충남지역의 소, 돼지, 닭을 사육하는 축산 농가를 무작위로 선정하여 가축의 분변 및 퇴비에서 채취한 검체로부터 분리된 균주에 대해 항생제 내성률을 검토하였다.
- 돈분의 경우 항생제의 사용이 다른 농가에 비해 많은 것으로 추정되는 새끼 돼지 사육시설 돈분 시료에서 다제 내성균주의 검출이 높게 나타났다. 또한 닭의 경우도 돼지와 동일하게 사료에 항생제가 다수 포함되어 있으며, 가축이 사료를 소화한 후에 흡수되지 않은 항생제는 분변을 통하여 환경에의 노출가능성을 제시해준다.
제안 방법
- 대장균의 분리는 채취한 각각의 시료 1 mg을 멸균생리식염수(0.85% NaCl)에 넣고 충분히 교반 후 Membrane Filter(dia 47 mm, pore size 0.45 µm)로 여과한 다음 여과지를 MacConkey Agar(Difco) 배지에 접종하였다.
- 채취한 각각의 시료 1 mg을 멸균생리식염수(0.85% NaCl)에 넣고 충분히 교반한 다음 상등액을 멸균된 희석수로 10배수 희석한 후 각 단계별 1ml를 N/A(Difco BactoTM Nutrient Agar) 배지에 도말하였다. 35℃에서 24시간 배양 후 집락의 모양, 색깔 등의 특성을 관찰하여 각 시료별 15~20개의 특정 집락(colony)을 선별한 다음 각 집락 별로 3차에 걸쳐 N/A배지에 계대 배양을 하면서 균주를 순수 분리하였다.
- 85% NaCl)에 넣고 충분히 교반한 다음 상등액을 멸균된 희석수로 10배수 희석한 후 각 단계별 1ml를 N/A(Difco BactoTM Nutrient Agar) 배지에 도말하였다. 35℃에서 24시간 배양 후 집락의 모양, 색깔 등의 특성을 관찰하여 각 시료별 15~20개의 특정 집락(colony)을 선별한 다음 각 집락 별로 3차에 걸쳐 N/A배지에 계대 배양을 하면서 균주를 순수 분리하였다.13)
- 35±1℃에서 24±1시간 동안 배양한 후 적갈색 또는 핑크색의 집락을 Durham Tube가 포함된 유당배지(Lactose Broth)에 접종하여 35±1℃에서 48±1시간 배양한 다음 가스 발생이 확인되는 균주에 대해 Gram Staining을 실시하여 Gram(−), 무아포성 간균이 증명되면 완전시험을 통해 최종 확인하였다.
- 항생제 감수성 검사는 분리 균주를 Mcfarland Turbidity 0.5 Standard17)에 맞추어 멸균생리식염수(0.85% NaCl)에 혼탁시켜 Mueller-Hinton Agar Plate에 100 µl씩 일정하게 분주 후 도말한 다음, 벡톤 비비엘 센스디스크 감수성 시험테스트 디스크(BD BBLTM Sensi-DiscTM)를 일정간격으로 플레이트 상에 적용하였다.
- 가축분변유래 항생제 내성균주 분포도 조사를 위하여 돼지, 소, 닭 농가에서 채취한 각각의 분변시료 중에 있는 호기성세균과 대장균을 분리하여 각각 13종 및 8종의 항생제에 대한 내성 검사를 실시하였다. 1개의 시료검체 당 2균주에 대하여 항생제 감수성 시험을 실시한 후 감수성 경향이 동일할 경우에는 1개를 항생제 내성 결과로 이용하였다.
- 가축분변유래 항생제 내성균주 분포도 조사를 위하여 돼지, 소, 닭 농가에서 채취한 각각의 분변시료 중에 있는 호기성세균과 대장균을 분리하여 각각 13종 및 8종의 항생제에 대한 내성 검사를 실시하였다. 1개의 시료검체 당 2균주에 대하여 항생제 감수성 시험을 실시한 후 감수성 경향이 동일할 경우에는 1개를 항생제 내성 결과로 이용하였다. 항생제 검사는 국가 항생제 내성 안전관리사업에서 정한 항생물질을 균주별 검사 대상 물질로 결정하였으며, 감수성 검사는 디스크 확산법(Disc diffusion method)으로 실시하였다.
- 85% NaCl)에 혼탁시켜 Mueller-Hinton Agar Plate에 100 µl씩 일정하게 분주 후 도말한 다음, 벡톤 비비엘 센스디스크 감수성 시험테스트 디스크(BD BBLTM Sensi-DiscTM)를 일정간격으로 플레이트 상에 적용하였다. 항생제 디스크를 올려놓은 후 15분 이내에 평판배지를 35℃에서 16~18시간동안 배양하여 육안으로 완전히 억제된 곳까지만 mm단위로 저지원의 직경을 측정하여 감수성 여부를 결정하였다. 항생제의 종류 및 항생제 디스크의 농도는 Table 1에 나타내었다.
- 본 연구에서는 항생제 내성균주에 대한 생태유해성이나 공중보건위해성의 측면에서 가축분변 및 퇴비로부터 일반세균과 E. coli 균주를 분리하여 항생제 내성균 분포와 현황을 통해 가축분변 및 퇴비중의 항생제 다재내성균의 오염실태를 조사하여 다음과 같은 결론을 도출하였다.
대상 데이터
- 충남 A지역 축산 농가의 주요 축종인 소, 돼지, 닭 농가를 대상으로 시료를 채취하였다. 각각의 농장으로부터 신선한 돈분, 우분, 계분과 각각의 퇴비 샘플을 무균 팩에 각각 약 300 g씩 채취하였다.
- 충남 A지역 축산 농가의 주요 축종인 소, 돼지, 닭 농가를 대상으로 시료를 채취하였다. 각각의 농장으로부터 신선한 돈분, 우분, 계분과 각각의 퇴비 샘플을 무균 팩에 각각 약 300 g씩 채취하였다. 퇴비는 퇴비 저장소에서 1-2일 경과된 시료를 대상으로 하였다.
- 각각의 농장으로부터 신선한 돈분, 우분, 계분과 각각의 퇴비 샘플을 무균 팩에 각각 약 300 g씩 채취하였다. 퇴비는 퇴비 저장소에서 1-2일 경과된 시료를 대상으로 하였다. 채취된 시료는 냉장상태로 실험실로 운반한 후, 냉장보관하면서 24시간 이내에 균주의 분리 시험에 사용하였다.
이론/모형
- 1개의 시료검체 당 2균주에 대하여 항생제 감수성 시험을 실시한 후 감수성 경향이 동일할 경우에는 1개를 항생제 내성 결과로 이용하였다. 항생제 검사는 국가 항생제 내성 안전관리사업에서 정한 항생물질을 균주별 검사 대상 물질로 결정하였으며, 감수성 검사는 디스크 확산법(Disc diffusion method)으로 실시하였다.16)
성능/효과
- 각각의 가축분뇨 및 퇴비로부터 분리한 호기성 세균 67균주에 대한 항생제 내성 검사에 따른 내성률을 검사한 결과 13종의 항생제에 내성을 보이지 않는 균주는 16.4%로 나타났으며, 1종 이상의 항생제에 내성을 보이는 균주가 83.6%로 매우 높게 나타났다. 2종 이상의 항생제 내성은 56.
- 6%로 매우 높게 나타났다. 2종 이상의 항생제 내성은 56.7%, 3종 이상의 내성은 31.3%, 4종 이상의 내성은 29.9%를 차지하였고 항생제 5종 이상에 내성을 보이는 다제 내성 균주도 17.9%로 높게 나타났으며, 6종 및 7종 이상에 내성을 보이는 다재내성은 각각 10.4%, 7.5%였고 돈분에서 2개, 돈분 퇴비에서 분리된 1개의 균주가 8종 이상의 항생제에 내성을 보이는 다제 내성 균주로 4.5%를 차지하는 것으로 조사되었으며, 9종 이상의 항생제에 내성을 보이는 균주도 1.5%를 차지하는 것으로 나타났다.
- 호기성세균의 항생제 내성률 결과는 Table 2에 나타내었다. 13종의 항생제중 호기성세균은 Lincomycin(L2)에 대한 내성률이 79.1%로 가장 높게 나타났으며 평균 19.3%의 항생제 내성률을 나타냈다. 그 외 Nalidixic acid(NA30)가 34.
- 반면, Ampicillin(AM10), Ciprofloxacin(CIP5), Sulfathiazole(ST.25), Vancomycin(VA30)에 대해서는 10% 이하의 낮은 내성률을 나타냈으며, Gentamicin(GM10), Amoxicilline(AMC30) 등에는 내성이 없는 것으로 나타났다.
- 돈분으로 부터 분리한 11종 균주 중 Lincomycin(L2)에 대한 내성률이 45.5%로 가장 높게 나타났으며 평균 18.2%의 항생제 내성률을 보였다. 그 외 Oxytetracycline(T30), Vancomycin(VA30), Tetracycline(TE30)이 27.
- 우분으로 부터 분리한 15종의 균주 중 Lincomycin(L2)에 대한 내성률이 93.3%로 가장 높게 나타났으며 평균 14.9%의 항생제 내성률을 보였다. 그 외 Streptomycin(S10)이 33.
- 계분으로 부터 분리한 13종의 균주 중 Lincomycin(L2)에 대한 내성률이 100%로 가장 높게 나타났으며 평균 35.5%의 항생제 내성률을 보였다. 그 외 Tetracycline(TE30)과 Oxytetracycline(T30) 92.
- 돈분퇴비로 부터 분리한 12종의 균주 중 Lincomycin(L2)과 Nalidixic acid(NA30)에 대한 내성률이 각각 75.0%로 가장 높게 나타났으며 평균 23.1%의 항생제 내성률을 보였다. 그 외 Sulfamethizole(TH.
- 우분퇴비로 부터 분리한 16종의 균주 중 Lincomycin(L2)에 대한 내성률이 75.0%로 가장 높게 나타났으며 평균 8.2%의 항생제 내성률을 보였다. 그 외 Streptomycin(S10)이 27.
- 가축 분변에서 분리한 대장균의 항생제 내성률은 Table 4와 같다. Tetracycline(TE30)과 Oxytetracycline(T30)에 대한 내성률이 67.6%로 가장 높게 나타났으며, 그외 Ampicillin(AM10)이 61.8%, Sulfamethizole(TH.25)이 55.9%, Streptomycin(S10)이 52.9%, Nalidixic acid(NA30)이 17.6%, Amoxicilline(AMC30)이 14.7% 등의 순으로 나타났다. 반면, Ciprofloxacin(CIP5)이 8.
- 8%로 가장 낮은 내성률을 나타내었다. 또한, 항생제 계열별 내성현황은 각각 Tetracyclines계 67.6%, Penicillins계 38.2%, Aminoglycoside계 52.9%, Sulfonamide계 55.9%로 나타났다.
- 각각의 시료로부터 분리된 대장균 34균주를 대상으로 8종의 항생제에 대한 내성검사를 한 결과 항생제에 대해 내성을 보이지 않는 균주는 26.5%로 나타났으며, 1종 이상의 항생제에 내성을 갖는 균주가 73.5%로 나타났다. 2종 및 3종 이상에 대한 다재 내성균은 각각 73.
- 1%로 나타났다. 또한, 6종 이상의 항생제에 내성을 갖는 균주도 11.8%였으며 7종과 8종 이상에 대한 다재내성균도 각각 8.8%, 2.9%인 것으로 조사되었다.
- 돈분으로부터 분리한 대장균 8종의 균주를 대상으로 항생제 8종의 내성 검사 결과 Tetracycline, Oxytetracycline, Sulfamethizole, Ampicilin에서 100% 내성을 보였으며, Streptomycin이 75.0%, Amoxicilline이 25.0%, Nalidixic acid 12.5% 등의 순으로 나타났다. 반면, Ciprofloxacin에는 내성이 없는 것으로 나타났다.
- 돈분퇴비로 부터 분리한 대장균 12종의 균주를 대상으로 항생제 8종의 내성 검사 결과 Tetracycline, Oxytetracycline에 100% 내성을 보였으며, Streptomycin과 Ampicilin이 91.7%, Sulfamethizole 50.0%, Ciprofloxacin과 Nalidixic acid이 25.0% 등의 순으로 나타났다. 반면, Amoxicilline에는 내성룰이 16.
- 계분으로 부터 분리한 대장균 1종의 균주를 대상으로 항생제 8종의 내성 검사 결과 Tetracycline, Oxytetracycline, Sulfamethizole, Streptomycin, Ampicilin, Amoxicilline에 내성을 보였으며, Quinolones 계인 Ciprofloxacin, Nalidixic acid에는 내성이 없는 것으로 나타났다.
- 계분퇴비로 부터 분리한 대장균 11종의 균주를 대상으로 항생제 8종의 내성 검사 결과 Tetracycline, Oxytetracycline, Nalidixic acid, Sulfamethizole에 18.2% 내성을 보였으며, Ampicilin이 9.1%로 나타났다. 반면, Amoxicillin, Ciprofloxacin, Streptomycin에는 내성이 없는 것으로 나타났다.
- 우분으로 부터 분리한 대장균 1종의 균주를 대상으로 항생제 8종의 내성 검사 결과 Sulfonamides계인 Sulfamethizole에만 내성을 보였으며, 나머지 항생제에는 내성이 없는 것으로 나타났다.
- 우분퇴비로 부터 분리한 대장균 1종의 균주를 대상으로 항생제 8종의 내성 검사 결과 우분에서 분리한 대장균과 동일하게 Sulfonamides계인 Sulfamethizole에만 내성을 보였으며, 나머지 항생제에는 내성이 없는 것으로 나타났다.
- 분리된 호기성세균 67균주에 대한 항생제 및 가축 시료별 내성 검사 결과 가축분변유래 항생제 내성균주의 분포비율은 계분이 35.5%로 가장 높았으며 돈분퇴비 23.1%, 돈분 18.2%, 우분 14.9%, 우분퇴비 8.2% 순으로 감소하였다. 가축분변만으로 비교하면 내성균주의 분포비율은 계분, 돈분, 우분 순으로 나타났다.
- 항생제 별로 내성률을 살펴보면 Lincomycin(L2) 내성균주의 분포 비율은 전 검체에서 평균 77.8%로 높게 나타났으며, Vancomycin(VA30) 내성균주는 돈 분에서만 27.3%의 높은 내성률을 나타내었다. 또한 Gentamycin(GM10)의 내성균주의 경우는 모든 검체에서 내성이 없는 것으로 나타났다.
- 3%의 높은 내성률을 나타내었다. 또한 Gentamycin(GM10)의 내성균주의 경우는 모든 검체에서 내성이 없는 것으로 나타났다. Ciprofloxacin(CIP5)의 내성균주는 돈분, 돈분퇴비, 우분, 우분퇴비에서는 내성이 없는 것으로 나타났으며, 계분에서만 15.
- 또한 Gentamycin(GM10)의 내성균주의 경우는 모든 검체에서 내성이 없는 것으로 나타났다. Ciprofloxacin(CIP5)의 내성균주는 돈분, 돈분퇴비, 우분, 우분퇴비에서는 내성이 없는 것으로 나타났으며, 계분에서만 15.4%의 내성을 나타냈다.
- 축산농가에서 사용량이 가장 많은 Tetracyclines계 항생제에 대한 내성률은 돈분에서 27.3%, 계분에선 92.3%의 높은 값을 나타내었다.
- 돈분의 경우 항생제의 사용이 다른 농가에 비해 많은 것으로 추정되는 새끼 돼지 사육시설 돈분 시료에서 다제 내성균주의 검출이 높게 나타났다. 또한 닭의 경우도 돼지와 동일하게 사료에 항생제가 다수 포함되어 있으며, 가축이 사료를 소화한 후에 흡수되지 않은 항생제는 분변을 통하여 환경에의 노출가능성을 제시해준다.
- 각각의 가축분변 시료 및 퇴비에서 분리한 대장균 34균주의 항생제계열 및 가축시료별 내성검사 결과 가축분변유래 항생제 내성균주의 분포비율은 계분이 75.0%로 가장 높았으며 돈분 64.1%, 돈분퇴비 62.5%, 우분과 우분퇴비가 각각 12.5% 순으로 감소하였다. 가축분변으로 보았을 때 내성균주의 분포비율은 계분, 돈분, 우분 순으로 나타났다.
- 5% 순으로 감소하였다. 가축분변으로 보았을 때 내성균주의 분포비율은 계분, 돈분, 우분 순으로 나타났다. 또한 우분과 우분퇴비에서는 Sulfamethizole을 제외한 7종의 항생제에 대해서는 내성이 없는 것으로 나타났다.
- 가축분변으로 보았을 때 내성균주의 분포비율은 계분, 돈분, 우분 순으로 나타났다. 또한 우분과 우분퇴비에서는 Sulfamethizole을 제외한 7종의 항생제에 대해서는 내성이 없는 것으로 나타났다. 축산농가에서항생제계열별사용량이가장많은 Tetracyclines 계, Penicillins 계, Sulfonamides 계 항생제에 대한 내성률이 높은 값을 나타내었다.
- 또한 우분과 우분퇴비에서는 Sulfamethizole을 제외한 7종의 항생제에 대해서는 내성이 없는 것으로 나타났다. 축산농가에서항생제계열별사용량이가장많은 Tetracyclines 계, Penicillins 계, Sulfonamides 계 항생제에 대한 내성률이 높은 값을 나타내었다.
- 1. 가축분변유래 호기성세균과 대장균의 항생제 내성검사 결과 1종 이상의 항생제에 내성을 갖는 균주가 각각 83.6%, 73.5%로 나타났다. 5종 이상의 항생제에 내성을 갖는 균주도 각각 17.
- 5%로 나타났다. 5종 이상의 항생제에 내성을 갖는 균주도 각각 17.9%, 44.1%로 높은 내성률을 보였다. 따라서 축산폐수 처리시 내성균 처리공정 도입이 요구된다.
- 2. 항생제 감수성 정도를 검사한 결과 가축분변유래 호기성세균의 항생제 내성균주의 분포비율은 계분이 35.5%로 가장 높았으며 돈분퇴비 23.1%, 돈분 18.2%, 우분 14.9%, 우분퇴비 8.2% 순으로 나타났다.
- 3. 가축분변유래 호기성세균의 항생제별 내성률은 Lincomycin이 79.1%로 가장 높게 나타났으며, 평균 19.3%의 내성률을 나타내었다.
- 4. 대장균의 항생제 내성 검사 결과 가축 분변에서 분리한 대장균은 8종의 검사 항생제 중 Tetracycline(TE30)과 Oxytetracycline(T30)의 내성률이 67.6%로 가장 높게 나타났다. 이는 식품의약품안전청 “국가항생제내성안전관리사업”에서 조사된 '08년 대장균의 Tetracycline 내성실태 결과와 유사하였다.
- 5. 분리된 대장균의 내성균주 분포는 계분 75.0%, 돈분 64.1%, 돈분퇴비 62.5%, 우분 및 우분퇴비가 12.2%로 나타났다.
- 5%로 나타났다. 2종 및 3종 이상에 대한 다재 내성균은 각각 73.5%이였고 4종 이상의 항생제에 내성이 있는 다제 내성균은 70.6%, 5종 이상은 44.1%로 나타났다. 또한, 6종 이상의 항생제에 내성을 갖는 균주도 11.
후속연구
- 향후 항생제 사용량과 내성율과의 직접적인 연관성을 조사하기 위해서는 시료 채취 농가의 항생제 사용에 대한 정보를 파악함과 동시에 내성률을 검토하고 동일 농가에 대해 반복적인 조사가 필요할 것으로 사료되며, 외국의 경우와 같이 지속적인 모니터링과 이에 대한 대책의 필요성이 요구된다. 또한 내성률 결과와 같이 다제 내성균주의 수질환경으로의 전이가 우려되므로 축산폐수처리에 항생제 내성균의 처리방안과 축산 환경개선의 필요성이 매우 높다.
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