[논문]가물치(Channa argus)로부터 평활근 수축활성 펩타이드의 정제

고혜진; 박남규

doi:10.5657/kfas.2012.0114

가물치(Channa argus)로부터 평활근 수축활성 펩타이드의 정제
Isolation of a Novel Neuropeptide with Contractile Activity on the Smooth Muscle from the Snakehead Channa argus 원문보기

한국수산과학회지 = Korean journal of fisheries and aquatic sciences, v.45 no.2, 2012년, pp.114 - 121

Abstract ▼ AI-Helper

A novel neuropeptide was isolated from the skin of the snakehead Channa argus using the dorsal retractor muscle (DRM) of a starfish Asterina pectinifera as a bioassay system. The amino acid sequence of the purified peptide was analyzed using automated sequencing and MALDI-TOF mass spectrophotometry. The primary structure of the purified peptide was determined to be Pro-Ala-Leu-Ala-Leu. To investigate the complete primary structure of this peptide, Pro- Ala-Leu-Ala-Leu-OH and Pro-Ala-Leu-Ala-Leu-NH2 were synthesized. The chemical and pharmacological properties of the synthetic peptides were compared with those of the native peptide. Both the native peptide and synthetic Pro-Ala- Leu-Ala-Leu-OH had identical behaviors on the reverse-phase and cation-exchange HPLC chromatograms. Synthetic Pro-Ala-Leu-Ala-Leu-OH showed contractile activity on the DRM, and the threshold concentration of this peptide was approximately $10^{-8}$ M. The maximal contractile effect ($E_{max}$) of this peptide was $294{\pm}45.4$% at $10^{-5}$ M.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

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문제 정의

본 연구에서는 가물치 피부 추출물로부터 불가사리 DRM 에 대해 강한 수축활성을 나타내는 pentapeptide를 처음으로 정제하였다. 이 펩타이드는 C-말단이 free한 -COOH 형태인 PALAL-OH로 판명되었으며, 이 물질은 기존에 알려진 다른 신경성 펩타이드들과 상동성을 갖지 않는 새로운 물질로 판명되었다.
본 연구에서는 가물치의 피부 추출물을 사용하여 불가사리 dorsal retractor muscle (DRM)에 대한 수축활성을 지표로 하여 새로운 신경성 펩타이드를 정제하였다.

제안 방법

의 수축활성을 조사하기 위해 불가사리 DRM을 이용하였다. DRM에서 펩타이드들의 수축활성을 조사하기 위해, 펩타이드를 10^-12 M에서 10^-5 M까지 농도 의존적으로 투여하였다(Fig. 5). PALAL-OH는 불가사리 DRM에 대해 10^-8 M에서부터 약한 수축활성을 보였으며, 농도 의존적으로 활성이 증가하여 E_max값은 10^-5 M에서 294.
Fig. 2B의 활성 획분을 분석용 Capcellpak C18 column (4.6×250 mm, 5 μm, Shiseido, Japan)을 사용하였으며, A용매로는 0.1% TFA를 포함하는 H2O (pH 2.2)와 B용매로는 0.1% TFA를 포함하는 100% CH3CN (pH 2.2)을 이용하여 B용매 gradient로 정제하였다: gradient, 25-45% CH3CN (60 min); 유속, 1.0 mL/min; fraction volume, 4.0 mL.
가물치 피부로부터 정제한 pentapeptide의 C-말단 modification 여부를 알아보기 위해 PALAL-OH (S₁)와 PALAL-NH₂(S₂)을 합성하였다. 합성물인 S₁과 S₂분자량의 이론치와 실측치는 각각 잘 일치하였다(Table 2).
가물치 피부조직 추출물 및 HPLC 정제 단계에서 얻은 획분 및 합성유도체들의 수축활성을 측정하기 위해 불가사리 DRM을 사용하였다. 불가사리의 배면과 복면을 분리하여 배면을 뒤집은 다음 5개 팔을 따라 중앙을 가로지르는 DRM을 mess로 분리한 후, 20 mm정도의 단편으로 만든다.
가물치 피부조직을 산 추출법으로 추출한 후 여러 단계에 걸쳐 유기용매를 첨가하여 고분자량의 단백질 및 지방을 제거하였다. 그 후 Sep-Pak C₁₈ cartridge를 이용하여 부분정제한 각각의 추출물(D.
2B의 black bar). 계속해서 분석용 역상 column과 DEAE-5PW column을 이용하여 분리를 한 결과, 0-0.05 M NaCl에서 용출된 획분에서 수축활성을 나타내었으며, 활성을 지닌 획분을 다른 종류의 역상 column에 적용하여 분리하였다. 그 결과, 19.
가물치 피부조직을 산 추출법으로 추출한 후 여러 단계에 걸쳐 유기용매를 첨가하여 고분자량의 단백질 및 지방을 제거하였다. 그 후 Sep-Pak C₁₈ cartridge를 이용하여 부분정제한 각각의 추출물(D.W., RM 10, RM 60, RM 100)을 각각 불가사리 DRM과 금붕어 장관에 대해 수축활성을 측정하였다. 추출물의 불가사리 DRM에 대해 수축활성은 RM 60이 가장 강하였고, D.
상층액을 처음 분리한 상층액과 함께 농축시킨 다음, 시료:ethanol =1:5(v/v)의 비율이 되게 ethanol을 첨가하여 4℃에서 15분 동안 8,000×g로 원심분리하여 침전물을 제거하였다. 그리고 상층액은 농축하여 시료:CH₃CN=1:3(v/v)의 비율이 되게 CH₃CN을 첨가하였다. 4℃에서 20분 동안 10,000×g로 원심분리하여 침전물을 제거한 뒤, 얻어진 상층액에 시료:ethanol=1:5(v/v)의 비율이 되게 ethanol을 첨가하여 4℃에서 20분 동안 10,000×g로 원심분리하여 침전물을 제거하였다.
상층액을 농축한 뒤 시료:ethanol=1:5(v/v)의 비율이 되게 ethanol을 첨가한 후, 4℃에서 20분 동안 10,000×g로 원심분리하여 얻어진 상층액을 농축하였다. 농축된 상층액을 충분히 평형화시킨 Sep-pak C₁₈ cartridge에 시료를 주입하여 0.1% TFA가 포함된 H₂O(D.W.), 10% methanol (RM10), 60% methanol (RM60)과 100% methanol (RM100)로 물질들을 각각 용출시켜 각 획분의 1/500에 해당하는 양을 사용하여 불가사리 DRM과 금붕어 장관에 대해 수축활성을 측정하였다(Fig. 1).
1B). 따라서 근 수축활성 펩타이드를 정제하기 위해 불가사리 DRM에 대해 강한 수축활성을 나타낸 RM 60을 사용하여 정제하였다.
절취한 장관의 결체조직을 제거하고, 5 mm정도의 장관 단편을 만들어 2 mL 반응조에 고정시켰다. 모든 과정은 55 mM Mg²⁺ artificial sea water (인공 해수, ASW)하에서 행하였으며, 조성은 다음과 같다: (mM) NaCl 445, KCl 10, CaCl₂.2H₂O 10, MgCl₂.6H₂O 55, Glucose 10, and Tris-HCl (pH 7.8) 10. 준비된 장관은 아래쪽은 2 mL의 반응조에 고정시키고 위쪽은 physiography system (NEC-Sanei, Tokyo, Japan)의 isometric transducer에 연결하여 1.
0 cm 길이로 적출한다. 모세혈관 및 adipose등을 제거한 후, 장관의 길이가 약 0.5-1.0 cm가 되도록 단편을 만들었다. 이 과정은 완충액상에서 행하였으며, 조성은 다음과 같다: (mM), NaCl 110, KCl 2, CaCl₂.
불가사리 DRM에 대해 강한 수축활성을 보인 RM60은 연속된 9단계의 HPLC 정제단계를 걸쳐 neuropeptide를 정제하였다. RM60은 분취용 Capcellpak C₁₈ column을 이용하여 분리하였다.
불가사리 DRM에 대해 약 19% CH3CN에서 용출된 peak에서 수축활성을 나타내었으며, 최종적으로 동일한 C18 column (4.6×250 mm)을 사용하여 19% CH3CN의 isocratic 조건으로 0.5 mL/min의 유속에서 19.7 min의 머무름 시간에 해당되는 하나의 순수한 물질을 정제하였다(Fig. 3A).
수축활성 측정은 실온에서 반응조 내에 공기를 주입시켜 주면서 안정화시킨 후, 5×10-7 M carbachol (CCh)을 투여하여 활성화시켰다.
수축활성을 나타낸 획분 21과 22를 농축하여 Superdex Peptide HR 10/30 column (10×300 mm, Pharmacia, Sweden)을 이용하여 0.1% TFA를 포함하는 30% CH3CN으로 용출시켰으며, 불가사리 DRM에 대해 27.4-29.8분에서 수축활성을 나타냈다.
수축활성 측정은 실온에서 반응조 내에 공기를 주입시켜 주면서 안정화시킨 후, 5×10^-7 M carbachol (CCh)을 투여하여 활성화시켰다. 시료들은 반응조에 주입한 후 수축 활성을 측정하였다.
이후 준비된 각 HPLC 정제 단계에서 얻은 획분들 및 합성 펩타이드들을 농도 의존적으로 투여하였다. 시료들은 주입한 후 수축활성을 측정하여 physiograph상에 기록하였다. 합성물의 수축활성은 5×10^-7 M의 Ach의 최대수축에 대한 상대적 수축 %로서 나타냈다.
0 g이 유지되면 5×10^-7 M의 acetylcholine (Ach)을 15분 간격으로 3회 투여하여 활성화시켰다. 이후 준비된 각 HPLC 정제 단계에서 얻은 획분들 및 합성 펩타이드들을 농도 의존적으로 투여하였다. 시료들은 주입한 후 수축활성을 측정하여 physiograph상에 기록하였다.
C-말단에 amide화된 형태의 펩타이드를 합성하기 위해 Fmoc-NH₂-PAL-resin을, C-말단이 free한 경우는 Fmoc-amino acid-Wang-resin을 사용하였다. 정제한 물질의 정확한 일차구조를 조사하기 위해 C말단이 amide화되어 있는 타입과 free한 상태인 2가지 타입을 합성하였다. 합성 펩타이드에 연결되어 있는 수지와 측쇄(side chain)의 보호기를 제거하기 위해서 절단시약 [TFA (5 mL) : m-cresol (0.
8) 10. 준비된 DRM을 physiography system (NEC-Sanei, Tokyo, Japan)의 반응조의 지지대에 고정시키고, 위쪽은 isometric transducer에 연결하여 resting tension이 1.0 g이 되도록 30분간 평형화시켰다. 조직의 tension이 1.
천연 및 합성 펩타이드들의 분자량은 부경대학교 공동실험실습관에 있는 MALDI-TOF mass spectrometer (Voyager-DE^TM PRO spectrometer, Perseptive Biosystems, USA)를 사용하여 측정하였다. 정제한 펩타이드의 아미노산 서열을 결정하기 위해서 한국 기초 과학지원연구원의 Procise^Ⓡ cLC Sequencing System Model 492 cLC (Apply Biosystem, Fostercity, CA, USA)를 사용하여 Edman 분해법으로 분석하였다.
천연물과 합성물과의 동일성을 알아보기 위해 천연물과 C-말단이 free한 -OH 형태 (PALAL-OH (S1)) 및 amide화된 -NH2형태 (PALAL-NH2 (S2))를 각각 218TP54 protein & peptide C18 column (4.6×250 mm, 5 μm, Grace Vydac, USA)에 19% CH3CN의 isocratic 조건에서 0.5 mL /min의 유속으로 용출시켜 비교하였다.
최종적으로 이 활성 peak를 218TP54 protein & peptide C18 column으로 19% CH3CN isocratic 조건으로 분리하였으며, 19.7 min의 머무름 시간을 가지는 하나의 활성 peak를 정제하였다(Fig. 3A).
합성물의 수축활성은 5×10^-7 M의 Ach의 최대수축에 대한 상대적 수축 %로서 나타냈다. 한편, 반응의 크기는 ED₅₀ (최고 수축의 50%를 나타낼 때의 농도) 및 E_max (최고수축활성값)로서 비교하였다. ED₅₀값은 least square method로 계산하였다.
합성한 PALAL-OH과 PALAL-NH₂의 수축활성을 조사하기 위해 불가사리 DRM을 이용하였다. DRM에서 펩타이드들의 수축활성을 조사하기 위해, 펩타이드를 10^-12 M에서 10^-5 M까지 농도 의존적으로 투여하였다(Fig.
5 g의 장력을 준 뒤, 실온에서 60분 동안 15분간 간격으로 완충액을 교체하면서 안정화시켰다. 활성측정은 실온에서 반응조 내에 공기를 주입하면서 안정화 시킨 후, 시료를 반응조에 주입한 후 수축활성을 측정하였다.

대상 데이터

Sep-Pak C₁₈ cartridge는 Waters사(Miliford, MA, USA)에서, HPLC용의 H₂O 및 acetonitrile (CH₃CN)은 TEDIA사(Ohio, USA)에서 구입하였다. 그 이외의 모든 시약은 특급을 사용하였다.
실험에 사용한 가물치(Channa argus, 체장 50-70 cm)는 2009년 8월에 부산시 소재 부전시장에서 구입하였다. 살아있는 상태의 가물치로부터는 피부조직을 분리한 후, 액체질소로 급속 동결시켜서 실험에 사용하기 전까지 -70℃에 보관하였다.
합성 펩타이드들은 218TP510 Protein & peptide C18 (9.2×250 mm, 5 μm, Grace Vydac, USA)을 사용하여 정제하였으며, 분리조건은 다음과 같다: 5-25% CH3CN (40 min); 온도, 40 ℃; 유속, 3.0 mL /min.

데이터처리

통계적 처리는 student’s t-test로서 했다.

이론/모형

한편, 반응의 크기는 ED₅₀ (최고 수축의 50%를 나타낼 때의 농도) 및 E_max (최고수축활성값)로서 비교하였다. ED₅₀값은 least square method로 계산하였다.
Fmoc-법을 사용하여 고상법으로 펩타이드를 합성하였다(Park et al., 1995). C-말단에 amide화된 형태의 펩타이드를 합성하기 위해 Fmoc-NH₂-PAL-resin을, C-말단이 free한 경우는 Fmoc-amino acid-Wang-resin을 사용하였다.
PRO spectrometer, Perseptive Biosystems, USA)를 사용하여 측정하였다. 정제한 펩타이드의 아미노산 서열을 결정하기 위해서 한국 기초 과학지원연구원의 Procise^Ⓡ cLC Sequencing System Model 492 cLC (Apply Biosystem, Fostercity, CA, USA)를 사용하여 Edman 분해법으로 분석하였다.

성능/효과

PALAL-OH는 불가사리 DRM에 대해 10-8 M에서부터 약한 수축활성을 보였으며, 농도 의존적으로 활성이 증가하여 Emax값은 10-5 M에서 294.8±45.4%였으며, ED50값은 PALAL-OH는 10-6 M로 나타났다.
8 min에서 활성을 나타냈다. 계속해서 활성획분을 다시 음이온 column에 적용하여 분리한 결과, 0.03-0.04 M의 NaCl에서 활성을 나타내었으며, 활성 획분을 역상 column으로 약 19% CH₃CN으로 분리하였다. 최종적으로 이 활성 peak를 218TP54 protein & peptide C₁₈ column으로 19% CH₃CN isocratic 조건으로 분리하였으며, 19.
05 M NaCl에서 용출된 획분에서 수축활성을 나타내었으며, 활성을 지닌 획분을 다른 종류의 역상 column에 적용하여 분리하였다. 그 결과, 19.8-20.6% CH₃CN에서 활성획분이 용출되었다. 이 활성획분은 분자량 column으로 분리하였는데, 머무름 시간 27.
3C). 또한 이 펩타이드와 지금까지 알려진 모든 수축활성 펩타이드들과의 상동성(homology)을 조사하기 위해 National Center for Biotechnology Information (NCBI, USA) protein-protein network BLAST Data Bank를 이용하여 검색한 결과, 전혀 상동성이 없는 새로운 평활근 수축성 펩타이드로 밝혀졌다(Table 1).
5 min에서 용출되었다. 또한, 천연물/합성물의 혼합물(N+S₁)을 위와 같은 역상 HPLC조건으로 적용한 결과, 동일한 머무름시간 19.5 min에서 하나의 peak로 용출되었다 (Fig. 4A). 천연물 (N)과 합성물 PALAL-NH₂ (S₂)의 혼합물 (N+S₂)을 동일한 역상 HPLC조건으로 적용한 결과, 천연물 (N)은 머무름시간 19.
2A의 black bar). 이 활성획분을 모두 농축하여 SP-5PW column에 적용하여 분리한 다음 수축활성을 측정한 결과, column에 결합되지 않은 0 M NaCl에서 용출된 획분 2번에서 불가사리 DRM에 대해 활성을 나타냈으며, column에 결합된 많은 물질들을 효과적으로 제거하였다(Fig. 2B의 black bar). 계속해서 분석용 역상 column과 DEAE-5PW column을 이용하여 분리를 한 결과, 0-0.
5 and Table 3). 이러한 결과로 미루어 보아, PALAL-OH의 free한 C-말단이 수축활성을 나타내는 데 있어서 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다. 또한, 다른 실험동물의 장관에 대한 PALAL-OH의 활성을 알아보기 위하여 먹장어, 금붕어 및 가물치 장관을 사용하여 측정하였지만, 각 조직에 대해 PALAL-OH는 불가사리 DRM에서와 달리 어떠한 활성도 나타내지 않았다(data not shown).
4B). 이러한 결과로 미루어보아 천연물은 C-말단이 free한 형태인 PALAL-OH와 동일함을 알 수 있었다. 따라서 이 pentapeptide의 완전한 일차구조는 Pro-Ala-Leu-Ala-Leu-OH(PALAL-OH)이다.
4A). 천연물 (N)과 합성물 PALAL-NH₂ (S₂)의 혼합물 (N+S₂)을 동일한 역상 HPLC조건으로 적용한 결과, 천연물 (N)은 머무름시간 19.5 min, 합성물 S₂는 11 min에서 각각 다른 머무름시간을 가지고 용출되었다(Fig. 4B). 이러한 결과로 미루어보아 천연물은 C-말단이 free한 형태인 PALAL-OH와 동일함을 알 수 있었다.
천연물 (N)과 합성물인 S1 및 S2를 218TP54 protein & peptide C18 column에 각각 주입하여 19% CH3CN의 isocratic 조건으로 확인한 결과, 천연물과 PALAL-OH (S1)는 각각 머무름시간 19.5 min에서 용출되었다.
최종적으로 정제한 물질의 일차구조를 알아보기 위해 에드만 서열 분석을 한 결과, 정제된 물질은 하나의 Pro과 Ala-Leu 의 반복 서열을 가진 Pro-Ala-Leu-Ala-Leu인 pentapeptide였다. 또한, 분자량을 측정한 결과, m/z 484.
, RM 10, RM 60, RM 100)을 각각 불가사리 DRM과 금붕어 장관에 대해 수축활성을 측정하였다. 추출물의 불가사리 DRM에 대해 수축활성은 RM 60이 가장 강하였고, D.W.층과 RM 10층의 경우 다소 약하였으며. RM 100에서는 어떠한 활성도 관찰되지 않았다(Fig.

후속연구

비록 PALAL-OH는 먹장어, 금붕어뿐만 아니라 가물치 장관 평활근에 대해 반응을 나타내지 않았지만, 가물치 생체뿐만 아니라 다른 실험동물에 대해 평활근 수축활성이 아닌 아직까지 규명되지 않은 다른 특이적 생리활성을 나타낼 것이라 생각되어진다. 따라서, 신경성 펩타이드들이 나타내는 기능을 측정할 수 있는 다양한 생리활성 측정법에 적용시켜 PALAL-OH의 기능을 측정해 볼 필요가 있다고 생각된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	Neuropeptide는 어떤 역할을 담당하는가?	신경성 펩타이드들(neuropeptides)은 1962년 낙지의 타액선으로부터 eledosin이 발견된 이후(Erspamer and Anastasi, 1962) 무척추 하등동물에서부터 인간에 이르기까지 다양한 생물의 조직으로부터 발견되어졌다(Krieger, 1986). Neuropeptide는 보통 4-30개정도의 아미노산으로 구성된 물질로 생체 내에서 호르몬 혹은 비호르몬으로서 다양한 기관 및 조직에 따라 평활근의 운동조절, 혈관의 수축 및 이완, 통증전달 및 혈압조절 등의 역할을 담당하고 있는 neuromodulator 및 neurotransmitter이다(Brown, 1994; Shuttleworth et al., 1995; Zadina et al.
	가물치는 미국산 물고기 중 어떤 종과 유사하게 생겨 혼동되기 쉬운가?	가물치(Channa argus)는 농어목(Perciformes) 가물치과의 등목어류에 속하는 토종 민물고기로, 연못이나 늪처럼 흐리고 고여 있는 저수지나 늪 등 주로 탁한 물이 있는 얕은 곳을 좋아해서 깊이가 1미터 안팎이고 물풀이 우거진 곳에 서식한다(Okada, 1960; Courtenay and Williams, 2004). 또한 가물치는 육식성으로 주로 물고기, 개구리, 갑각류 및 수서곤충 등을 잡아먹으며, 먹이가 부족하면 동족인 가물치 새끼도 잡아 먹는다고 알려져 있으며(Dukravets and Machulin, 1978; Okada, 1960), 미국산 물고기인 Bowfin Amia calva과 Burbot Lota lota와 유사하게 생겨 혼동되기 쉽다. 한편 가물치는 성장속도가 무척 빨라 한국에서는 식용으로 활용하기 위해 양어장에서 기르는 중요한 어종 중의 하나이다.
	신경성 펩타이드들은 언제, 무엇으로부터 처음 발견되었는가?	신경성 펩타이드들(neuropeptides)은 1962년 낙지의 타액선으로부터 eledosin이 발견된 이후(Erspamer and Anastasi, 1962) 무척추 하등동물에서부터 인간에 이르기까지 다양한 생물의 조직으로부터 발견되어졌다(Krieger, 1986). Neuropeptide는 보통 4-30개정도의 아미노산으로 구성된 물질로 생체 내에서 호르몬 혹은 비호르몬으로서 다양한 기관 및 조직에 따라 평활근의 운동조절, 혈관의 수축 및 이완, 통증전달 및 혈압조절 등의 역할을 담당하고 있는 neuromodulator 및 neurotransmitter이다(Brown, 1994; Shuttleworth et al.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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