접골목(接骨木)추출물 및 약침액에 의한 MIF 활성 조절능이 생쥐의 제2형 Collagen 유발 관절염에 미치는 영향 Effect of Suppressing the Activation of Macrophage Migration Inhibitory Factor by $Sambucus$$williamsii$$H_{ANCE}$ Extract & Pharmacopuncture Solution on Type II Collagen-induced Arthritis원문보기
Objectives : The purpose of this study is to evaluate effect of suppressing the expression of cyclo-oxygenase-type-2 (COX-2) as a consequence of inhibition macrophage migration inhibitory factor (MIF) activation by $Sambucus$$williamsii$$Hance$ (SWH) pharmacopunctu...
Objectives : The purpose of this study is to evaluate effect of suppressing the expression of cyclo-oxygenase-type-2 (COX-2) as a consequence of inhibition macrophage migration inhibitory factor (MIF) activation by $Sambucus$$williamsii$$Hance$ (SWH) pharmacopunctureon rheumatoid arthritis (RA). Methods : In vitro test, synoviocytes extracted from type II collagen-induced arthritis (CIA) mouse's knee joint were cultivated After that, each well of synoviocytes was mixed with the extract of SWH at the dosage of $0.4mg/m{\ell}$, $0.6mg/m{\ell}$, $0.8mg/m{\ell}$, and $1.0mg/m{\ell}$ respectively, and cultivated for 24 hours after the addition. Reverse transcriptase - polymerase chain reaction (RT-PCR) is used to investigate the expression of MIF, Tumor necrosis factor (TNF)-${\alpha}$, COX-2 mRNA. $In$$vivo$ test, thirty DBA female mice were used, and each ten mice were allocated into three group; normal group, CIA-elicitated group, and group treated with SWH pharmacopuncture on it's the point of $ST_{35}$ after CIA elicitation. It is investigated that change of mice foot thickness, histologic change of sliced synovial joint of mouse, and extent change of MIF, TNF-${\alpha}$, COX-2 in synovial membrane. Results : $In$$vitro$ test, the expressions of cytokine(MIF, TNF-${\alpha}$, COX-2) mRNAs related to RA were dose-dependent decreased. In the SWH pharmacopuncture group, foot thickness and histologic change of sliced synovial joint were decreased comparing with CIA-elicitated group's change. In the SWH pharmacopuncture group, the suppression of MIF, TNF-${\alpha}$, COX-2 in synovial membrane was clearly shown comparing with CIA-elicitated group's change. Conclusions : It might be suggested that SWH pharmacopuncture mitigate tissue damage originated from rheumatoid arthritis by suppressing the expression of COX-2 as a consequence of inhibition MIF activation.
Objectives : The purpose of this study is to evaluate effect of suppressing the expression of cyclo-oxygenase-type-2 (COX-2) as a consequence of inhibition macrophage migration inhibitory factor (MIF) activation by $Sambucus$$williamsii$$Hance$ (SWH) pharmacopunctureon rheumatoid arthritis (RA). Methods : In vitro test, synoviocytes extracted from type II collagen-induced arthritis (CIA) mouse's knee joint were cultivated After that, each well of synoviocytes was mixed with the extract of SWH at the dosage of $0.4mg/m{\ell}$, $0.6mg/m{\ell}$, $0.8mg/m{\ell}$, and $1.0mg/m{\ell}$ respectively, and cultivated for 24 hours after the addition. Reverse transcriptase - polymerase chain reaction (RT-PCR) is used to investigate the expression of MIF, Tumor necrosis factor (TNF)-${\alpha}$, COX-2 mRNA. $In$$vivo$ test, thirty DBA female mice were used, and each ten mice were allocated into three group; normal group, CIA-elicitated group, and group treated with SWH pharmacopuncture on it's the point of $ST_{35}$ after CIA elicitation. It is investigated that change of mice foot thickness, histologic change of sliced synovial joint of mouse, and extent change of MIF, TNF-${\alpha}$, COX-2 in synovial membrane. Results : $In$$vitro$ test, the expressions of cytokine(MIF, TNF-${\alpha}$, COX-2) mRNAs related to RA were dose-dependent decreased. In the SWH pharmacopuncture group, foot thickness and histologic change of sliced synovial joint were decreased comparing with CIA-elicitated group's change. In the SWH pharmacopuncture group, the suppression of MIF, TNF-${\alpha}$, COX-2 in synovial membrane was clearly shown comparing with CIA-elicitated group's change. Conclusions : It might be suggested that SWH pharmacopuncture mitigate tissue damage originated from rheumatoid arthritis by suppressing the expression of COX-2 as a consequence of inhibition MIF activation.
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문제 정의
이에 저자는 류마토이드 관절염에서 다양한 cytokine의 변화들 중 윤활액내의 type II collagen 역가 증가4), MIF의 증가5), proinflammatory cytokine인 IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, GM-CSF, TNF-α의 증가6,7), 염증성 전사인자인 Nuclear factor (NF)-κB 활성과 염증효소 COX-2와 inducible nitric oxide synthase (iNOS)의 증가8,9), 단백분해효소 (matrix metalloproteinase; MMP)의 증가 등10,11)이 일어나는데, 이러한 물질의 분비 증가가 심각한 관절손상을 유도하는 비정상적인 과민면역반응에 주목하여 연구를 진행하게 되었다.
이에 저자는 제2형 collagen 유발 관절염 model의 생쥐를 대상으로 하여, in vitro상에서 接骨木抽出物이 류마토이드 관절염 관련 cytokine (MIF, TNF-α, COX-2) mRNA 유전자발현에 미치는 영향을 조사하였고, in vivo상에서 인체의 犢鼻(ST35)에 상응하는 부위로 接骨木藥鍼을 시술한 후 足蹠浮腫의 변화, 윤활관절막의 일반적인 형태변화, 윤활관절막 내의 MIF, TNF-α와 COX-2의 생성 변화를 관찰하여 초기 류마토이드 관절염의 완화 효과에 관한 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
Avidin biotin complex (DAKO)에 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후 0.05%3,3'-diaminobenzidine (DAB)과 0.01% HCl이 포함된 0.05 M tris-HCl 완충용액(pH 7.4)에서 발색시킨 후, hematoxylin으로 대조염색하여 광학현미경으로 관찰하였다.
CIA 유발 3일부터 21일까지 接骨木약침액 50 ㎕/㎏을 인체의 犢鼻穴(ST35)에 상응하는 CIA 유발 생쥐의 슬관절부위에 Hamilton syringe (Sigma, USA)를 이용하여 매일 시술하였다.
CIA의 유발을 위한 1차 접종을 CII와 CFA 혼합액 50 ㎕를 꼬리연결 근육부위에 피내주사를 통해 실시하였으며, 1차 접종 2주 후에 CII와 CFA 혼합액 25 ㎕를 발바닥에 추가 접종하여 CIA를 유발하였다. CIA 유발 후 1주일간격으로 발의 두께 변화를 dial thickness cage (Mitutoyo, Japan)로 측정하였다.
CIA 유발 후 21일 후 각 군을 sodium pentobarbital 용액으로 마취하고 vascular rinse와 10% 중성 포르말린용액(neutral buffered formalin : NBF)으로 심장관류고정을 실시하였다. 적출된 무릎관절을 탈회액(decalcification solution, BBC, UK)에 24시간 처리하고 세척한 후 통상적인 방법으로 파라핀에 포매하여5 ㎛ 두께로 연속절편을 만들었다.
CII와 4 ㎎/㎖의 complete Freund’s adjuvant containing mycobacterium tuberculosis strain H37RA (CFA, Chondrex)를 동량으로 섞은 후 균질기를 이용하여 1,000 rpm의 속도로 혼합하였다. CIA의 유발을 위한 1차 접종을 CII와 CFA 혼합액 50 ㎕를 꼬리연결 근육부위에 피내주사를 통해 실시하였으며, 1차 접종 2주 후에 CII와 CFA 혼합액 25 ㎕를 발바닥에 추가 접종하여 CIA를 유발하였다. CIA 유발 후 1주일간격으로 발의 두께 변화를 dial thickness cage (Mitutoyo, Japan)로 측정하였다.
COX-2의 조직 내 분포를 조사하기 위해 mouse anti-mouse COX-2 (1 : 500, Santa Cruz Biotec, USA)를 이용한 면역조직화학적 염색을 실시하였다.
RT-PCR kit (Premega, USA)를 이용하여 cDNA를 합성한 후 MIF, TNF-α 그리고 COX-2 primer를 PCR machine으로 반응시켰다(Table 1). PCR 산물은 1-2% agarose gel상에서 전기영동하여 relative intensity로 측정하였다. 한편 RT-PCR의 정확성을 평가하기 위하여 internal standard인 β-actin의 증폭을 동시에 실시하였다.
RT-PCR kit (Premega, USA)를 이용하여 cDNA를 합성한 후 MIF, TNF-α 그리고 COX-2 primer를 PCR machine으로 반응시켰다(Table 1).
한편 RT-PCR의 정확성을 평가하기 위하여 internal standard인 β-actin의 증폭을 동시에 실시하였다. mRNA 발현의 relative intensity는 Optimas 5.2 (Optima, USA)를 이용한 영상분석 (image analysis)을 통해 비교하였다.
接骨木 약침액은 GMP 기준에 따른 설비가 되어 있는 대한약침학회(서울, 한국)를 방문하여 接骨木 세척 및 침출, 接骨木 달이기(약재 200g, 증류수 1.4ℓ), 증류 냉각액 모으기, 여과(0.1 ㎛ celluose 여과막 사용), 등장액 조절, 무기염류 제거 및 pH 조절, 밀봉, 고압 멸균(2기압, 121℃) 후 포장순의 공정으로 제조하였다.
接骨木약침의 MIF 활성 조절을 통한 COX-2 생성 억제가 류마토이드 관절염에 미치는 영향을 조사하기 위하여 활성 산소 소거실험을 통한 接骨木추출물의 항산화효과를 확인한 후, in vitro상에서 接骨木추출물이 류마토이드 관절염 관련 cytokine (MIF, TNF-α, COX-2) mRNA 유전자발현에 미치는 영향을 조사하였으며, in vivo상에서 CIA유발 DBA 생쥐에게 인체의 犢鼻(ST35)에 상응하는 부위로 接骨木藥침액을 시술한 후 足蹠浮腫의 변화, 윤활관절막의 일반적인 형태변화, 윤활관절막 내의 MIF, TNF-α와 COX-2의 생성 변화를 관찰하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
接骨木의 RA에 대한 치료효과를 조사하기 위해 CIA모델 생쥐를 대상으로 하여 in vitro 실험상에서 接骨木추출물의 MIF, TNF-α, COX-2 mRNA 활성 억제를 조사하였고, in vivo 실험상에서 CIA mouse의 犢鼻(ST35)에 接骨木약침을 시술하여 이후 足蹠 浮腫, 윤활관절막의 변화와 더불어 윤활관절막 내의 MIF, TNF-α, COX-2의 변화를 조사하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
윤활관절세포 - 5×105cells/well을 6 well에 plating하고 12시간 후에 phorbol-12- myristate -13-acetate (PMA, 1 ng/㎖)를 1시간 처리하여 RA 관련 cytokine mRNA 발현을 유도하였다. 接骨木추출물 0.4, 0.6, 0.8 및 1.0 ㎎/㎖을 농도별로 첨가하여 24시간동안 배양한 후, 수거한 RNA를 trizol reagent (Sigma, USA)를 사용하여 추출한 다음 fluorometer (Introgen, USA)로 RNA를 정량하였다. RT-PCR kit (Premega, USA)를 이용하여 cDNA를 합성한 후 MIF, TNF-α 그리고 COX-2 primer를 PCR machine으로 반응시켰다(Table 1).
接骨木추출물의 첨가량 결정을 위해 MTT assay를 실시하였는데, 接骨木추출물 10 ㎎/㎖까지는 세포 생존율의 변화가 일어나지 않아 0.4, 0.6, 0.8 및 1.0 ㎎/㎖를 첨가량으로 결정하였다. 接骨木抽出物이 류마토이드 관절염 유발을 주도하는 cytokine인 MIF, 전염증효소 TNF-α 및 염증효소인 COX-2 mRNA 발현에 미치는 영향을 조사하기 위해 역전사중합효소연쇄반응법(reverse transcriptase-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 실시하였다.
관절염을 유발하지 않은 정상군, collagen-induced arthritis (CIA) 유발한 대조군, CIA 유발 후 接骨木藥鍼을 투여한 실험군(SWH군)으로 나누었으며, 각 군에 10마리씩 배정하였다.
우선 절편을 blocking serum인 10% normal goat serum (1 : 20, DAKO, Denmark)에서 12시간 동안 반응시켜 비특이적 면역반응을 억제하였다. 그리고 1차 항체인 rabbit anti mouse MIF (1 : 200, Santa Cruz Biotec, USA)에 4℃ humidified chamber에서 72시간 동안 반응시켰으며, biotinylated goat anti-rabbit IgG (DAKO)에 4℃ humidified chamber에서 24시간 link 하였다. Avidin biotin complex (DAKO)에 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후 0.
적출된 무릎관절을 탈회액(decalcification solution, BBC, UK)에 24시간 처리하고 세척한 후 통상적인 방법으로 파라핀에 포매하여5 ㎛ 두께로 연속절편을 만들었다. 만들어진 연속절편은 hematoxylin과 eosin으로 염색하여 표본을 제작하였다. 한편 윤활관절막의 자유면 기저부에서 모세혈관의 분포 변화를 조사하기 위해서 mallory azan 염색을, 윤활관절막 내 섬유화를 조사하기 위해 van Gieson’s picric acid-fuchsin 염색을 실시하였다.
1% collagenase에 37℃에서 1시간동안 처리 한 다음 3,000 rpm에 5 분간 원심분리하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 10% fetal bovine serum (FBS; Sigma, USA)이 함유된 DMEM를 사용하여 배양하였다. 오염방지를 위해 항생제로 100 unit/㎖ penicillin (Sigma, USA), 100 ㎍/㎖ streptomycin (Gibco/BRL, USA)을 첨가하였다. 세포는 플라스크의 80% 정도 자랐을 때 PBS로 씻어주고, trypsin-EDTA (Gibco/BRL)를 처리하여 계대 배양하였다.
항산화 능력을 측정하기 위해 riboflavin을 이용한 활성산소 소거실험을 실시하였다. 우선 photocell에 40 mM buffer 2.6 ㎖, nitroblue tetrazolium 100 ㎕, EDTA/cyanide 200 ㎕, riboflavin 100 ㎕ 및 항산화 정도를 측정할 농도별(0.2, 0.4, 0.6, 0.8 및 1.0 ㎎/㎖) 接骨木추출물 100 ㎕을 넣고 3번 섞어주었다. Abs 560 nm에서 autozero를 잡고 light box에서 1분 동안 조사한 후 흡광도를 측정하였다.
우선 관절주변 근육을 제거하여 윤활관절주머니를 개방한 후 0.1% collagenase가 포함된 Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM, USA)에 2시간 동안 반응하여 윤활관절막을 분리하고 세절하였다.
초기 CIA 유도 cytokine인 MIF의 윤활관절막 내 분포변화를 조사하기 위해 항체를 이용한 면역조직화학적 염색을 실시하였다. 우선 절편을 blocking serum인 10% normal goat serum (1 : 20, DAKO, Denmark)에서 12시간 동안 반응시켜 비특이적 면역반응을 억제하였다. 그리고 1차 항체인 rabbit anti mouse MIF (1 : 200, Santa Cruz Biotec, USA)에 4℃ humidified chamber에서 72시간 동안 반응시켰으며, biotinylated goat anti-rabbit IgG (DAKO)에 4℃ humidified chamber에서 24시간 link 하였다.
CIA 유발 후 21일 후 각 군을 sodium pentobarbital 용액으로 마취하고 vascular rinse와 10% 중성 포르말린용액(neutral buffered formalin : NBF)으로 심장관류고정을 실시하였다. 적출된 무릎관절을 탈회액(decalcification solution, BBC, UK)에 24시간 처리하고 세척한 후 통상적인 방법으로 파라핀에 포매하여5 ㎛ 두께로 연속절편을 만들었다. 만들어진 연속절편은 hematoxylin과 eosin으로 염색하여 표본을 제작하였다.
전염증효소인 TNF-α활성 변화를 조사하기 위해 mouse anti-mouse TNF-α (1 : 500, Santa Cruz Biotec, USA)를 이용한 면역조직화학적 염색을 실시하였다.
초기 CIA 유도 cytokine인 MIF의 윤활관절막 내 분포변화를 조사하기 위해 항체를 이용한 면역조직화학적 염색을 실시하였다. 우선 절편을 blocking serum인 10% normal goat serum (1 : 20, DAKO, Denmark)에서 12시간 동안 반응시켜 비특이적 면역반응을 억제하였다.
한편 RT-PCR의 정확성을 평가하기 위하여 internal standard인 β-actin의 증폭을 동시에 실시하였다.
한편 윤활관절막의 자유면 기저부에서 모세혈관의 분포 변화를 조사하기 위해서 mallory azan 염색을, 윤활관절막 내 섬유화를 조사하기 위해 van Gieson’s picric acid-fuchsin 염색을 실시하였다.
항산화 능력을 측정하기 위해 riboflavin을 이용한 활성산소 소거실험을 실시하였다. 우선 photocell에 40 mM buffer 2.
대상 데이터
제Ⅱ형 collagen을 쥐에게 피내주사하여 관절염이 발생함을 1977년 Trendem18) 등이 처음 보고한 이래, 설치류에서 제Ⅱ형 CIA은 임상적·조직학적·면역학적으로 사람의 류마토이드 관절염과 유사하여, 이 질환의 질병과 병태연구에 많이 이용되고 있다19). 따라서 본 실험에서도 이러한 제Ⅱ형 CIA유발 DBA mouse를 사용하였다.
실험에 사용한 생쥐 무릎 윤활관절세포는 관절염이 유발된 암컷 DBA 생쥐 무릎관절에서 적출하였다. 우선 관절주변 근육을 제거하여 윤활관절주머니를 개방한 후 0.
배지는 2일마다 교환하여 주었다. 실험에는 3~5회 계대배양 세포를 사용하였다.
약침액 주입기는 10 ㎕의 Hamilton syringe (Sigma, USA)를 사용하였다.
오리엔트(한국)에서 분양 받은 태령 6주된 DBA 암컷 생쥐를 무균사육장치 내에서 2주일 동안 적응시킨 후 체중 20g된 생쥐를 선별하여 사용하였다.
通經活絡, 消風散寒, 消腫止痛의 효능이 있어, 脚氣, 膝痛, 足浮腫, 족관절 류머티즘, 屈伸不利, 痛風, 膝無力 등의 주치범위를 가지고 있다20). 이에 저자는 슬관절질환에 효과가 좋은 犢鼻(ST35)를 선택하여 실험하였다.
데이터처리
본 실험의 결과는 ANOVA test (SPSS14KO, SPSS. USA)를 통해 검증하였으며 신뢰도 95% 이상(p<0.05)일 때 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
유전자 발현의 relative intensity와 면역조직화학의 수치화를 위해 optimas 5.2를 이용한 영상분석 (image analysis)을 실시하였다. 본 실험의 결과는 ANOVA test (SPSS14KO, SPSS.
Abs 560 nm에서 autozero를 잡고 light box에서 1분 동안 조사한 후 흡광도를 측정하였다. 이 작업을 10번 반복하여 평균값을 계산하였다.
이론/모형
接骨木抽出物이 류마토이드 관절염 유발을 주도하는 cytokine인 MIF, 전염증효소 TNF-α 및 염증효소인 COX-2 mRNA 발현에 미치는 영향을 조사하기 위해 역전사중합효소연쇄반응법(reverse transcriptase-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 실시하였다.
성능/효과
1. In vitro상에서 接骨木抽出物이 처리된 윤활관절세포에서는 류마토이드 관절염 관련 cytokine(MIF, TNF-α, COX-2) mRNA 유전자 발현이 농도의존적으로 감소하였다.
2. In vivo상에서 接骨木약침액이 시술된 CIA 유발생쥐에서 대조군에 비해 足蹠浮腫이 유의성 있게 감소하였고, 윤활관절막의 두께감소 및 혈관분포감소, 윤활관절막 내의 섬유화의 감소를 볼 수 있었다.
3. In vivo상에서 接骨木약침액이 시술된 CIA 유발생쥐에서 대조군에 비해 윤활관절막 내의 MIF, TNF-α, COX-2 양성반응이 유의성 있게 감소하였다.
COX-2 양성반응의 영상분석 결과 대조군은 정상군에 비해 578% 증가하였으나, 실험군(SWH군)은 1145±40 particles로서 대조군 2720±56 particles에 비해 58% 감소함으로써 유의성(p<0.05) 있는 감소를 나타내었다(Table 3, Fig. 4C).
MIF 양성반응의 영상분석 결과 대조군은 정상군에 비해 534% 증가하였으나, 실험군(SWH군)은 577±13 particles로서 대조군 1681±72 particles에 비해 66%감소함으로써 유의성(p<0.05) 있는 감소를 나타내었다(Table 3, Fig. 4A).
PMA 자극으로 유도된 윤활관절세포에서의 COX-2 mRNA 발현은 증가하였으며, 실험군에서는 PMA 자극시 발현되는 COX-2 mRNA 발현량에 비해 0.4 ㎎/㎖에서 5%, 0.6 ㎎/㎖서 14%, 0.8 ㎎/㎖에서 17% 및 1.0 ㎎/㎖에서 54%로 각각 감소함으로써 실험군인 SWH군에서 대조군에 비하여 농도의존적으로 감소하는 경향을 보였다(Fig. 2).
PMA 자극으로 유도된 윤활관절세포에서의 MIF mRNA 발현은 증가하였으며, 실험군에서는 PMA 자극 시 발현되는 MIF mRNA 발현량에 비해 0.4 ㎎/㎖에서 17%, 0.6 ㎎/㎖서 23%, 0.8 ㎎/㎖에서 32% 및 1.0 ㎎/㎖에서 58%로 각각 감소함으로써 실험군인 SWH군에서 대조군에 비하여 농도의존적으로 감소하는 경향을 보였다(Fig. 2).
PMA 자극으로 유도된 윤활관절세포에서의 TNF-α mRNA 발현은 증가하였으며, 실험군에서는 PMA 자극 시 발현되는 TNF-α mRNA 발현량에 비해 0.4 ㎎/㎖에서 31%, 0.6 ㎎/㎖서 45%, 0.8 ㎎/㎖에서 50% 및 1.0 ㎎/㎖에서 68%로 각각 감소하므로써 실험군인 SWH 군에서 대조군에 비하여 농도의존적으로 감소하는 경향을 보였다(Fig. 2).
TNF-α 양성반응의 영상분석 결과 대조군은 정상군에 비해 444% 증가하였으나, 실험군(SWH군)은 1264±45 particles로서 대조군 1963±58 particles에 비해 36% 감소함으로써 유의성(p<0.05) 있는 감소를 나타내었다(Table 3, Fig. 4B).
관절염 유발 후 윤활관절막 내 주된 형태학적 변화중 하나는 섬유화와 섬유화를 주도하는 섬유모세포 침적 증가였다. 섬유화는 일부 지방층을 제외한 윤활관절막의 모든 지역에서 관찰되었고, 이런 섬유화 부위에서는 세포가장자리가 잘 발달된 섬유모세포의 분포가 증가하였다.
특히 모든 지역에서 일어난 섬유화는 FLS에서의 IL-1β 신호기전에 의한 것으로 collagen fiber의 합성촉진과 collagenase의 합성 또한 유도하고27), 관절염 유발 시 중성호성백혈구, 단핵구 및 림프구 등에 대한 주화작용28), 관절내 연골과 연골하 골조직의 파괴29) 및 prostaglandin 등의 염증매개물질의 분비를 자극한다30). 본 실험의 CIA유발군(대조군)에서도 윤활관절막 내에서 FLS의 세포과형성, 혈관신생성 증가, 섬유화 증가를 확인할 수 있었다.
실험군은 대조군에 비하여 제7일(3.56±0.12mm), 14일(3.03±0.09mm) 및 제 21일(2.29± 0.13mm)차에서 각각 유의성(p<0.05) 있는 감소를 나타내었다(Table 2).
관절염 유발 후 윤활관절막의 자유면 (apical surface)에서 관찰되는 주된 형태학적 변화는 윤활관절세포과형성으로 인한 윤활관절막 자유면의 두께증가였다. 윤활강 쪽으로 많은 돌기를 내어 마치 세포질이 이탈한 것처럼 보이는 윤활관절세포의 출현도 증가하여 윤활관절막의 자유면 표면이 전반적으로 거칠게 나타났다. 또한 자유면쪽으로 침윤하는 림프구의 증가도 관찰되었다.
그러나 실험군(SWH군)에서는 윤활관절막의 자유면 두께증가가 감소하였다. 윤활강쪽에서 많은 세포질 돌기를 내는 윤활세포들의 출현도 감소한 것으로 관찰되어, 대체적으로 윤활관절막이 매끄로운 표면상태로 관찰되었다. 또한 윤활관절막 자유면쪽으로 림프구 침윤도 줄었다(Fig.
이에 반해 실험군(SWH군)에서는 CIA 동물모델의 足蹠浮腫이 유의성 있게 감소하였고 윤활관절막에서 FLS의 세포과형성, 혈관신생성, 섬유화 등이 감소되어 나타났다. 이는 MIF 활성 억제에 의한 것으로 接骨木추출물이 PMA로 자극된 윤활관절세포에서 MIF mRNA의 발현을 농도 의존적으로 억제한다는 in vitro의 결과와 CIA 동물모델을 통해 接骨木약침 후 MIF 양성반응세포의 유의성 있는 분포감소가 관찰된 in vivo 결과를 통해 확인할 수 있었다. 이러한 接骨木藥鍼의 MIF 활성 억제는 NF-κB 활성을 저해함으로써 TNF-α의 생성을 억제하고 결국, 염증효소 COX-2 작용을 차단하게 되어 염증으로 유발되는 윤활관절막 내 조직 손상을 막았다.
이상의 결과로 接骨木약침은 MIF의 활성 억제를 통해 초기 류마토이드 관절염의 진행을 차단하고 순차적으로 TNF-α의 생성을 억제하고 염증효소인 COX-2작용을 차단함으로써 항염증작용을 통해 류마토이드 관절염로 기인된 조직 손상을 완화시키는 치료 효과를 보이는 것으로 생각된다.
이에 반해 실험군(SWH군)에서는 CIA 동물모델의 足蹠浮腫이 유의성 있게 감소하였고 윤활관절막에서 FLS의 세포과형성, 혈관신생성, 섬유화 등이 감소되어 나타났다. 이는 MIF 활성 억제에 의한 것으로 接骨木추출물이 PMA로 자극된 윤활관절세포에서 MIF mRNA의 발현을 농도 의존적으로 억제한다는 in vitro의 결과와 CIA 동물모델을 통해 接骨木약침 후 MIF 양성반응세포의 유의성 있는 분포감소가 관찰된 in vivo 결과를 통해 확인할 수 있었다.
전염증효소 TNF-α의 양성반응세포의 분포는 관절염 유발 후 증가하는 반면, 실험군(SWH군)에서는 감소하였다.
정상군의 윤활관절막 내 지방조직 사이에서 적은 수로 분포한 혈관은 관절염 유발 후 증가되는 양상을 보였는데, 특히 윤활관절막의 자유면 기저부의 윤활세포주변에서 직경이 큰 모세혈관의 출현이 증가하였다. 그러나 실험군(SWH군)에서는 일부 윤활관절막의 자유면에서만 모세혈관의 급속한 출현 증가가 관찰되었을 뿐, 그외 지역에서는 정상군과 유사한 분포양상을 보였다(Fig.
한의학적인 원인 및 치료에서 류마토이드 관절염을 風寒濕熱의 邪氣에 의한 경우와, 正氣의 虛弱에서 비롯된 경우의 두 가지 큰 범주로 나누어 접근하였을때, 接骨木은 性味가 甘苦하고, 平하며, 袪風, 利濕, 活血, 止痛하는 효능이 있어 風濕筋骨疼痛, 腰痛, 水腫, 風痒, 隱疹, 産後血暈, 跌打腫痛, 骨折, 創傷出血 등에 사용할 수 있는 본초의 특성을 감안하였을 때, 접골목 약침은 위의 실험적 결과와 종합하여 風寒濕熱의 邪氣에 의한 류마토이드 관절염의 치료제로서 보다 더 적합할 것으로 사료된다.
후속연구
그리고, 接骨木약침을 골절치유 실험 model에 활용하여 조직학적 골절부위의 뼈기질 생성 증가여부와 면역학적으로 MIF, TNF-α 등의 cytokine의 변화에 미치는 영향을 연구하여 接骨木약침을 CIA model에 활용하였을 때 얻은 cytokine의 변화와 비교해 보는 것도 흥미로울 것으로 사료된다.
또한 기존의 연구에서 다양한 한약재들이 실험적 결과를 통하여 류마토이드 관절염에 치료 효과를 보인다는 보고들은 있었지만 각각의 약재의 효능을 서로 비교한 연구는 부족한 실정이다. 앞으로의 연구는 류마토이드 관절염에 있어 각각의 약재 효능비교를 통해 보다 더 우수한 치료효과의 약재를 선택해 나가는 방향이 필요하다고 생각되며, 이를 바탕으로 실제 환자를 대상으로 한 임상적 연구도 보다 더 활발히 진행해 나가야 할 것으로 생각된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
한의학적으로 볼 때 류머토이드 관절염의 원인은 무엇인가?
한의학에서 문헌적으로 기술된 증상으로 볼 때 류머토이드 관절염은 痺, 風痺, 痛風,歷節風, 白虎風, 白虎歷節風 등의 범주에 속한다12). 원인은 外因으로 風寒濕의 六淫之氣, 환경적인 요소와 內因으로는 七情과 臟腑의 불균형으로 인한 痰濕과 瘀血의 병리적 산물이 관여한다13).
류마토이드 관절염이란?
류마토이드 관절염(rheumatoid arthritis, RA)은 인구의 0.8% 정도에서 유발되는 원인 불명의 만성적인 전신성 질환으로1,2), 만성 진행성 활막의 염증과 관절 구조의 파괴가 생기며 유전적 소인이 있는 숙주에서 다양한 면역반응을 나타내는 질환이다2).
류머토이드 관절염은 한의학적으로 어떤 범주에 속하는가?
한의학에서 문헌적으로 기술된 증상으로 볼 때 류머토이드 관절염은 痺, 風痺, 痛風,歷節風, 白虎風, 白虎歷節風 등의 범주에 속한다12). 원인은 外因으로 風寒濕의 六淫之氣, 환경적인 요소와 內因으로는 七情과 臟腑의 불균형으로 인한 痰濕과 瘀血의 병리적 산물이 관여한다13).
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