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문제 정의
- 본 연구는 동물 복제 및 형질 전환 동물 생산 등의 연구에 기초자료를 제공하고자 재래산양의 도축장 유래 체외성숙 난자에 단위 발생을 유도하여 활성화 방법에 따른 단위 발생란의 체외 발달율을 조사하여 최적의 활성화 방법의 체계를 확립하고자 실시하였다.
- 본 연구는 동물 복제 및 형질 전환 동물 생산 등의 연구에 기초자료를 제공하고자 재래산양의 체내 및 도축장 유래 체외성숙 난자에 단위 발생을 유도하여 회수난자의 조건과 활성화방법이 단위 발생란의 체외발달율에 미치는 영향을 조사하여 최적의 활성화 방법을 확립하고자 실시하였다.
제안 방법
- 30 kv/cm, 20μsec, 1회 통전하여 활성화를 유도하였다. Laser system(MTM, Switzerland)을 이용한 단위 발생 유기는 Park 등(2001)의 zona drilling 방법을 응용하여 실시하였다. 즉, laser system 이 부착된 도립현미경하에서 laser 전용 렌즈(×400)로 난자의 투명대와 가까운 세포질 또는 투명대에 맞춘 다음 40∼60 μsec의 강도로 laser를 2∼3회 투과시켰다.
- PGF2α(Lutalyse, Upjohn, USA)는 8일째에 FSH와 함께 10 mg 투여하고 CIDR 제거는 10일째에 제거와 동시에 hCG(Chorulon, Intervet, Netherland) 400∼600 IU를 투여하여 과배란을 유도하였다.
- 난자의 회수를 위한 과배란 유기는 먼저 발정동기화를 위하여 progesterone 제제인 CIDR(Progesterone 0.3 g, Eazi Breed, InterAg, New Zealand)를 10일간 질 내에 삽입하고, 과배란 처리는 FSH(Folltropin-V, Vetrepharm, Canada)를 CIDR 삽입 8, 9, 10일째에 12시간 간격으로 70 mg을 감량법으로 투여하였다. PGF2α(Lutalyse, Upjohn, USA)는 8일째에 FSH와 함께 10 mg 투여하고 CIDR 제거는 10일째에 제거와 동시에 hCG(Chorulon, Intervet, Netherland) 400∼600 IU를 투여하여 과배란을 유도하였다.
- 단위 발생란의 체외배양은 0.8% BSA가 첨가된 mSOF 배양액(5% CO2, 5% O2, 90% N2, 96～88% humidity, 38.5℃)에서 7∼8일간 배양을 실시하였다.
- 단위 발생유기는 먼저 화학적 방법으로 ionomycin(2.5 μM) 용액에서 5분간 처리한 후 30 mg/ml 농도의 FAFBSA 용액에서 3분간 세척한 다음 2 mM의 6-DMAP 용액에서 4시간 동안 처리하는 관행적인 방법을 기본으로 하여 ionomycin 5분 6-DMAP 2시간처리, ionomycin 1분, 6-DMAP 2시간 및 4시간 동안 처리하였다.
- 5 μM) 용액에서 5분간 처리한 후 30 mg/ml 농도의 FAFBSA 용액에서 3분간 세척한 다음 2 mM의 6-DMAP 용액에서 4시간 동안 처리하는 관행적인 방법을 기본으로 하여 ionomycin 5분 6-DMAP 2시간처리, ionomycin 1분, 6-DMAP 2시간 및 4시간 동안 처리하였다. 또한 물리적인 방법으로 전기자극, 전기 자극 및 6-DMAP 2시간, laser자극 및 6-DMAP를 2시간 처리하여 단위 발생을 유도하였다. 전기 자극은 전기 세포융합장치(BTX, USA)로 실시하였으며, 이때 배지는 0.
- 체내 성숙난자의 회수는 hCG 투여 후 35∼40시간에 외과적인 방법으로 산양의 복정중선을 절개하여 난관을 관류하여 회수하였다. 먼저 과배란 처리한 산양을 약 24시간 절식시킨다음 2% xylazine(Rompun, 바이엘, 한국)을 체중 kg당 0.2 mg 씩 근육주사하여 진정마취시키고, Zoletil 50(VIRBAC Lab. France)을 정맥주사하여 마취를 유도하였다. 마취가 도입된 산양은 복정중선을 절개하여 catheter(Tom Cat, Kendall Co.
- PGF2α(Lutalyse, Upjohn, USA)는 8일째에 FSH와 함께 10 mg 투여하고 CIDR 제거는 10일째에 제거와 동시에 hCG(Chorulon, Intervet, Netherland) 400∼600 IU를 투여하여 과배란을 유도하였다. 본 연구는 산양의 번식기인 10～2월 사이에 실시하였으며 PGF2a를 투여한 다음날부터 발정관찰을 실시하였다.
- 전기의 세기는 직류전류(DC)로 2.30 kv/cm, 20μsec, 1회 통전하여 활성화를 유도하였다.
- 즉, laser system 이 부착된 도립현미경하에서 laser 전용 렌즈(×400)로 난자의 투명대와 가까운 세포질 또는 투명대에 맞춘 다음 40∼60 μsec의 강도로 laser를 2∼3회 투과시켰다.
- 체내 성숙난자의 회수는 hCG 투여 후 35∼40시간에 외과적인 방법으로 산양의 복정중선을 절개하여 난관을 관류하여 회수하였다.
- 체내 성숙난자의 회수는 체중 15∼25 kg 전․후의 성숙한 미경산 재래산양에 과배란을 유기하여 난자를 외과적 방법으로 회수하였다.
- 체외성숙 배양액은 TCM-199 배양액에 10% FBS, sodium pyruvate(0.2 mM/ml), streptomycin(100μg/ml), penicillin G(100 μg/ml)와 LH(10 μg/ml), FSH(10 μg/ml), estradiol-17β(1 μg/ml), cysteamine(0.1 mM/ml) 및 cystine(0.2 mM/ml) 를 첨가하여 사용하였으며, 체외성숙 배양액을 4-well dish에 0.5 ml씩 분주하여 38.5℃ CO2 배양기(5% CO2, 95% air, 96～98% 습도)에서 20시간 전 배양을 실시하여 평형을 유도한 후 well 당 10∼15개씩의 난포란을 옮겨 배양기내에서 20∼22시간 동안 배양을 실시함으로써 체외성숙을 유도하였다.
- 활성화 처리는 전기자극, laser 자극법과 ionomycin + 6-DMAP를 처리하여 단위 발생을 유도하였으며, 단위 발생란의 배양은 mSOF 배양액으로 6∼8일 동안 체외배양을 실시하였다.
대상 데이터
- 본 연구에서 언급하지 않은 모든 시약은 Sigma Aldrich Korea에서 구입하여 사용하였다. 도축장 유래 미성숙 난포란의 회수는 난소를 적출하여 penicillin G(100 μg/ml)와 streptomycin(100 μg/ml)이 함유된 생리식염수(28～30℃)가 들어 있는 보온병에 담아 5시간 이내에 실험실로 운반하여 난소 표면의 이물질과 조직을 제거한 후 생리식염수로 2∼3회 세척하였다.
- 채집한 난포란은 10% FBS(Gibco, U.S.A.)가 첨가된 TCM-199(Gibco, U.S.A.)배양액으로 4∼5회 세척한 다음 난구세포의 부착정도와 세포질이 충실한 것만 선별하여 사용하였다.
- 체내성숙 난자 회수를 위한 산양은 생후 10～15개월령의 체중이 15～25 kg 전후의 성숙한 미경산 재래산양으로서 본대학교 종합농장(위도, 35°10')에서 사육하면서 본 연구에 사용하였다.
데이터처리
- 실험결과의 통계학적 분석은 SAS package를 이용하여 실시하였으며, GLM(General Linear Model) procedure를 적용하여 각 요인의 least square mean을 구하여 요인간의 유의차를 검정하였다.
성능/효과
- 05)으로 높았다(Table 1). Ionomycin과 6-DMAP의 적정 처리 시간을 검토하고자 ionomycin 5분+6-DMAP 4시간(73.1%) 및 ionomycin 5분+6-DMAP 2시간(72.0%) 처리하였을 때 분할율은 차이가 없었으며, 배반포기로의 발달율도 각각 22.2 및 21.0%로서 차이가 없었다(Table 2). Ionomycin 1분+6-DMAP 4시간 및 ionomycin 1분+6-DMAP 2시간 처라하였을 때도 분할율은 차이가 없었으며, 배반포기로의 발달율도 25.
- 도축장 유래 체외성숙 난자와 체내성숙 난자를 ionomycin과 6-DMAP처리를 하였을 때 분할은 차이가 없었으며, 배반포기로의 발달율은 체외 성숙난자(20.0%)보다 체내성숙 난자(41.3%)가 유의적(P<0.05)으로 높았다.
- 도축장유래 체외성숙 난자(72.7%)와 체내성숙 난자(82.1%)를 ionomycin과 6-DMAP처리를 하였을 때 분할은 차이가 없었으며, 배반포기로의 발달율은 체외 성숙난자(20.0%)보다 체내성숙 난자(41.3%)가 유의적(p<0.05)으로 높았다(Table 1).
- 초음파 자극 후 CHX를 40 ug/ml를 2시간 처리하였을 때 분할율이 69%였으며, 배반포기로의 발달율도 36%로서 대조구(15%)보다 유의적으로 높았다고 하였다. 따라서 본 연구의 laser 자극에 의한 활성화 처리도 이와 유사한 원리라고 생각되어 실시를 하였으나, 낮은 분할율을 보였다. 초음파 자극 등 물리적 자극에 의한 활성화 처리는 앞으로 좀 더 세밀한 검토가 필요한 것으로 생각된다.
- 따라서 산양의 난자는 넓은 범위의 ionomycin 농도에서도 활성화가 일어나는 것을 볼 수 있다. 본 연구 결과보다는 다소 높은 성적이나 체외 성숙시간과 ionomycin과 6-DMAP간의 처리간격 등이 본 연구와는 차이가 있고, 본 연구의 체내 성숙난자의 경우는 분할율뿐만 아니라 배반포기로의 발달율도 매우 높게 나타났다. 또한 Liu 등(2011)도 산양 복제란을 융합 후 활성화처리를 2 및 3시간 후에 처리하였을 때는 배반포기로의 발달율이 17 및 20%로서 차이가 없다고 하였다.
- 일반적으로 산양의 난자는 다른 동물에 비하여 전기의 세기가 높은 편이다. 본 연구에서 일정수준 이상으로 전기 세기를 높이면 분할율은 높아지지만, 배반포기로의 발달율은 오히려 낮은 경향을 보였다.
- 뿐만 아니라 체외성숙란을 2.5 uM 농도의 ionomycin 1분 처리 후 6-DMAP를 2, 4 및 6시간 처리 하였을 때 처리구(88∼94%)간에 차이가 없었으며, 6-DMAP 농도는 2 및 4 mM에 처리하였을 때가 90% 이상으로서 0.5및 1 mM보다 유의적으로 높았다고 하였다.
- 재래산양은 유용단백질 생산을 위한 형질전환 복제동물 생산관련 연구에 있어서 생체반응기로서 적합한 동물이나, 현재의 복제산양 생산 효율은 다른 종에 비하여 매우 낮은 실정이다. 이러한 문제점을 해결하기 위해서는 무엇보다도 양질의 난자의 대량 확보 방안, 핵이식기법 개발, 핵이식란의 활성화 효율 개선, 산양 수정란의 배양 체계 확립, 이식기법의 개발 등이 시급한 실정이다 이상의 결과로 볼 때 재래산양의 활성화 처리는 기존의 여러 가지 방법에 비하여 ionomycin과 6-DMAP 병용 처리가 적합하며, 처리 시간은 각각 1분(ionomycin) 및 2시간(6-DMAP)이 적합한 것으로 생각된다.
- 재래산양은 유용단백질 생산을 위한 형질전환 복제동물 생산관련 연구에 있어서 생체반응기로서 적합한 동물이나, 현재의 복제산양 생산 효율은 다른 종에 비하여 매우 낮은 실정이다. 이러한 문제점을 해결하기 위해서는 무엇보다도 양질의 난자의 대량 확보 방안, 핵이식기법 개발, 핵이식란의 활성화 효율 개선, 산양 수정란의 배양 체계 확립, 이식기법의 개발 등이 시급한 실정이다 이상의 결과로 볼 때 재래산양의 활성화 처리는 기존의 여러 가지 방법에 비하여 ionomycin과 6-DMAP 병용 처리가 적합하며, 처리 시간은 각각 1분(ionomycin) 및 2시간(6-DMAP)이 적합한 것으로 생각된다.
- 각종 물질을 내부로의 이송을 보다 쉽게 만들어 세포내의 흡수를 촉진한다고 하였다. 초음파 자극 후 CHX를 40 ug/ml를 2시간 처리하였을 때 분할율이 69%였으며, 배반포기로의 발달율도 36%로서 대조구(15%)보다 유의적으로 높았다고 하였다. 따라서 본 연구의 laser 자극에 의한 활성화 처리도 이와 유사한 원리라고 생각되어 실시를 하였으나, 낮은 분할율을 보였다.
- 활성화 처리 방법에 있어서 전기자극 및 전기자극+DMAP 2시간 처리하였을 때 분할율은 62.0 및 64.0%로서 차이가 없었으나, laser+6-DMAP 2시간 처리하였을 때 10.0%보다는 유의적(p<0.05)으로 높았다.
- 활성화 처리 방법에 있어서 전기자극 및 전기자극+DMAP 2시간 처리하였을 때 분할율은 62.0 및 64.0%로서 차이가 없었으나, laser+6-DMAP 2시간 처리하였을때의 10.0%보다는 유의적(p<0.05)으로 높았다.
후속연구
- 재래산양은 우리나라 고유의 유전자원으로서 형질전환 복제와 같은 첨단생명공학 연구에 매우 적합한 동물이다. 근년에 와서 산양을 이용한 연구의 필요성이 점차 확대되고 있는 실정이며, 이를 위해서는 무엇보다도 도축장 유래 난포란의 이용과 같은 난자의 대량 확보 방안이 시급히 마련되어야 할 것이다. 재래산양은 계절번식을 하는 특성을 갖고 있으면서 사육두수가 적고 소나 돼지처럼 도축체계가 확립되어 있지 못하여 일시에 난자의 다량 확보가 불가능한 실정이다(박 등, 2004).
- 따라서 본 연구의 laser 자극에 의한 활성화 처리도 이와 유사한 원리라고 생각되어 실시를 하였으나, 낮은 분할율을 보였다. 초음파 자극 등 물리적 자극에 의한 활성화 처리는 앞으로 좀 더 세밀한 검토가 필요한 것으로 생각된다.
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