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문제 정의
- 이에 본 연구는 팽화발효홍삼이 당뇨쥐의 혈당관련 지표개선에 미치는 영향을 평가하기 위하여 streptozotocin으로 유도한 당뇨쥐에게 발효 유산균의 종류를 달리하여 제조한 팽화발효홍삼농축액을 각각 5주간 경구투여하고 혈당변화 및 관련 지표성분 함량, 경구당부하 검사, 혈청 지질농도 등을 조사하고 일반홍삼과 비교 검토하여 기능성 팽화발효홍삼으로서의 활용을 위한 기초자료를 얻고자 수행하였다.
가설 설정
- Fig. 1. Effects of puffed and fermented red ginseng on blood glucose level and area under the blood glucose curve after oral glucose tolerance test in STZ-induced diabetic rats. Experimental conditions are same as the annotation of Table 2.
제안 방법
- 2 mL씩 복강주사 하였다. STZ 주사 후 7일에 혈당치가 350 mg/dL 내외되는 쥐를 선별하여, 난괴법(randomized block design)으로 실험군당 10마리씩 임의배치하여 총 5주간 사육하였다. 실험군은 당뇨유발 쥐들에 0.
- delbrueckii ATCC 9649를 각각 MRS 배지(Difco, Detroit, MI, USA)에 접종하여 37°C에서 24시간 배양 후 두 균주를 혼합하여 다시 37°C에서 24시간 배양한 균주와 Enterococcus faecalis ATCC 29212를 동일 배지에서 37°C에서 24시간 배양한 균주를 위의 팽화홍삼액에 각각 5% 접종하여 37°C에서 8일간 발효하였다.
- 발효가 완료된 후 각 시료를 90°C에서 30분간 살균하고 2차 여과 및 진공감압 농축하여 60°Bx로 조정한 팽화발효홍삼농축액을 제조하였으며, 일반홍삼농축액은 팽화 및 발효과정을 생략하고 홍삼의 추출, 여과, 농축 및 살균 등의 과정을 거쳐 고형분량 60°Bx로 제조하였다.
- 사육실의 환경은 항온(23±1°C) 및 항습(50±5%) 조건을 유지하였고, 조명은 12시간 light/dark cycle(08:00～20:00)로 일정하게 조절하였다.
- 실험기간 동안 식이와 식수는 자유섭취(ad libitum)하도록 하였고, 체중은 1주일에 한 번씩 일정한 시간에 실험동물저울(GF-2000, AND, Anyang, Gyeonggi, Korea)을 이용하여 측정하였으며, 식이섭취량은 매일 일정한 시간에 공급하고 남은 식이를 4°C에서 냉장보관 한 후 1주일에 한 번 측정하였다. 식이효율(feed efficiency ratio, FER)은 체중증가량을 동일 기간 동안의 식이섭취량으로 나누어 계산하였다.
- STZ 주사 후 7일에 혈당치가 350 mg/dL 내외되는 쥐를 선별하여, 난괴법(randomized block design)으로 실험군당 10마리씩 임의배치하여 총 5주간 사육하였다. 실험군은 당뇨유발 쥐들에 0.85% NaCl 1 mL를 경구투여한 당뇨대조군(DC), 일반홍삼농축액을 고형분량 300 mg/kg이 되도록 희석하여 1 mL를 경구투여한 일반홍삼군(RG), 팽화홍삼추출액을 Bifidobacterium breve와 Lactobacillus delbrueckii의 혼합균주로 발효하여 제조한 팽화발효홍삼농축액을 고형분량 300 mg/kg 용량으로 희석하여 1 mL를 경구투여한 팽화발효홍삼군-1(BL) 및 Enterococcus faecalis 균주를 이용하여 제조한 팽화발효홍삼농축액을 고형분 300 mg/kg 용량으로 희석하여 1 mL 경구투여한 팽화발효홍삼군-2(EF) 등 4처리군으로 설정하였으며, NaCl을 비롯한 각 시료의 경구투여는 매일 1회 5주동안 수행하였다.
- 실험기간 동안 식이와 식수는 자유섭취(ad libitum)하도록 하였고, 체중은 1주일에 한 번씩 일정한 시간에 실험동물저울(GF-2000, AND, Anyang, Gyeonggi, Korea)을 이용하여 측정하였으며, 식이섭취량은 매일 일정한 시간에 공급하고 남은 식이를 4°C에서 냉장보관 한 후 1주일에 한 번 측정하였다.
- 6×250 mm)을 사용하였고, Jasco MD-2010 Plus detector(Jasco)를 이용하여 UV 302 nm에서 분석하였다. 이동상으로는 물(A)과 acetonitrilie(B)의 gradient system을 사용하였으며 A를 기준으로 80%(0분), 80%(20분), 70%(40분), 55%(60분), 20%(80분), 0%(90분), 20%(100분)이었다. Oven의 온도는 30°C였으며 injection volume 10 μL, flow rate는 1.
- 인슐린의존성 당뇨병과 유사한 실험모델을 만들기 위해서 streptozotocin(STZ, Sigma Chemical Co. Ltd., St. Louis, MO, USA)을 주사하여 당뇨를 유발시켰다. 평균체중 320 g 내외의 SD계 수컷흰쥐를 공시하여 실험개시 전 STZ를 체중 kg당 47.
- 분리한 혈청은 -70°C에서 냉동보관하면서 분석에 이용하였다. 채혈이 끝난 후각 장기조직(간, 신장, 비장, 정소, 췌장)을 적출하여 0.9%생리식염수에 세척한 다음 여과지로 물기를 제거하고 무게를 측정하였다.
- 팽화발효홍삼이 STZ로 유도한 당뇨쥐의 내당능에 미치는 영향을 알아보고자 포도당을 경구투여한 후 시간별로 채혈하여 혈당을 측정한 결과 및 혈당 곡선하면적(area under the curve, AUC)은 Fig. 1에 나타내었다. 포도당 투여 후 30분까지는 실험군간 유의한 차이를 보이지 않았고, 포도당투여 60분 후에는 모든 실험군에서 최고 혈당치를 보였으며, DC군(385.
- Louis, MO, USA)을 주사하여 당뇨를 유발시켰다. 평균체중 320 g 내외의 SD계 수컷흰쥐를 공시하여 실험개시 전 STZ를 체중 kg당 47.5 mg 농도로 0.1 M citrate buffer(pH 4.0)에 녹여서 0.2 mL씩 복강주사 하였다. STZ 주사 후 7일에 혈당치가 350 mg/dL 내외되는 쥐를 선별하여, 난괴법(randomized block design)으로 실험군당 10마리씩 임의배치하여 총 5주간 사육하였다.
- 혈당농도는 실험기간 동안 매주 혈당측정기(Accu-Chek ⓡActive 601, Roche, Mannheim, Germany)를 이용하여 측정하였고, 경구내당능 검사는 실험시료 투여 5주째 실험동물을 12시간 절식시켜 꼬리정맥에서 채혈하여 공복 시 혈당농도를 측정한 후 포도당용액(1 g/kg BW)을 경구투여하고 30, 60, 120, 180분 후 혈당을 측정하였다. 경구내당능 검사결과 혈당 곡선하면적(area under the curve, AUC)은 Sigma Plot 8.
대상 데이터
- 실험동물은 3주령 된 Sprague-Dawley(SD)계 수컷 흰쥐를 (주)한림실험동물(Hwaseong, Gyeonggi, Korea)에서 구입하였으며, 실험기간 중 식이는 흰쥐용 일반 고형사료(AIN93G)(24)를 기본식이(basal diet)로 하였고, 실험 전 1주일 동안 고형사료로 적응기를 거친 후 본 실험에 사용하였다. 사육실의 환경은 항온(23±1°C) 및 항습(50±5%) 조건을 유지하였고, 조명은 12시간 light/dark cycle(08:00～20:00)로 일정하게 조절하였다.
데이터처리
- 4)Values within a column with different superscript letters are significantly different at p<0.05 by Tukey's multiple range test.
- 6)Values within a column with different superscript letters are significantly different at p<0.05 by Tukey's multiple range test.
- 각 군의 결과값에 대해 one-way ANOVA(analysis of variance) 분석 후 Tukey's multiple range test를 이용하여 p<0.05 수준에서 유의성 검정을 실시하였다.
- Active 601, Roche, Mannheim, Germany)를 이용하여 측정하였고, 경구내당능 검사는 실험시료 투여 5주째 실험동물을 12시간 절식시켜 꼬리정맥에서 채혈하여 공복 시 혈당농도를 측정한 후 포도당용액(1 g/kg BW)을 경구투여하고 30, 60, 120, 180분 후 혈당을 측정하였다. 경구내당능 검사결과 혈당 곡선하면적(area under the curve, AUC)은 Sigma Plot 8.0 program(Jandel Scientific, San Rafael, CA, USA)을 사용하여 계산하였다.
- 본 연구에서 얻어진 결과는 SPSS(statistical package for social sciences, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) software package(version 17.0)를 이용하여 통계분석 하였으며, 분석 결과는 mean±SE(standard error)로 나타내었다.
이론/모형
- 인슐린 및 C-peptide 농도는 electrochemiluminescence immunoassay(ECLIA) 검사법을 이용하여 각각 Modular analytics E170(Roche, Mannheim, Germany)으로 측정하였으며, 인슐린저항성은 Homeostasis Model Assessment-Insulin Resistance(HOMAIR)를 이용하여 계산하였다(26). 당화혈색소(HbA1c)는 turbidimetric immunoassay(TIA) 검사법을 이용하여 Integra 400(Roche, Basel, Switzerland)으로 측정하였다.
- 실험에 사용한 각 시료의 주요 ginsenoside 함량을 조사하기 위하여 Shin(23)의 방법에 준하여 각 홍삼농축액 시료 1 g을 증류수 100 mL에 용해하여 0.45 μm membrane filter로 여과한 후 HPLC(Jasco, Tokyo, Japan)로 분석하였다.
- 실험종료 후 분리한 공복 시 혈청의 생화학치는 Han 등(25)의 연구에 준하여 혈당, 총콜레스테롤(total cholesterol, TC) 및 고밀도지단백-콜레스테롤(high density lipoproteincholesterol, HDL-C) 농도는 각각 enzymatic colorimetry 검사법을 이용하였고, 저밀도지단백-콜레스테롤(low density lipoprotein-cholesterol, LDL-C) 농도는 enzyme immunoassay(EIA) 검사법을 이용하였으며, 중성지방(triglyceride, TG) 농도는 lipase, glycerokinase(GK), L-α-glycerol phosphate oxidase(GPO) colorimetry 검사법을 이용하여 자동혈액분석기(ADVIA 1650, Bayer, Shiga, Japan)로 각각 측정하였다.
- 실험종료 후 분리한 공복 시 혈청의 생화학치는 Han 등(25)의 연구에 준하여 혈당, 총콜레스테롤(total cholesterol, TC) 및 고밀도지단백-콜레스테롤(high density lipoproteincholesterol, HDL-C) 농도는 각각 enzymatic colorimetry 검사법을 이용하였고, 저밀도지단백-콜레스테롤(low density lipoprotein-cholesterol, LDL-C) 농도는 enzyme immunoassay(EIA) 검사법을 이용하였으며, 중성지방(triglyceride, TG) 농도는 lipase, glycerokinase(GK), L-α-glycerol phosphate oxidase(GPO) colorimetry 검사법을 이용하여 자동혈액분석기(ADVIA 1650, Bayer, Shiga, Japan)로 각각 측정하였다. 인슐린 및 C-peptide 농도는 electrochemiluminescence immunoassay(ECLIA) 검사법을 이용하여 각각 Modular analytics E170(Roche, Mannheim, Germany)으로 측정하였으며, 인슐린저항성은 Homeostasis Model Assessment-Insulin Resistance(HOMAIR)를 이용하여 계산하였다(26). 당화혈색소(HbA1c)는 turbidimetric immunoassay(TIA) 검사법을 이용하여 Integra 400(Roche, Basel, Switzerland)으로 측정하였다.
성능/효과
- 120분 후의 혈당수준은 DC군(258.6 mg/dL)보다 RG 및 EF군(223.6, 213.7 mg/dL)이 유의한 감소경향을 보였고(p<0.05), BL군(185.4 mg/dL)은 실험군 중 통계적으로 가장 낮은 농도를 나타내었다(p<0.05).
- LDL-콜레스테롤 농도는 BL군(8.96 mg/dL)이 DC군(14.05 mg/dL)보다 유의적인 감소 결과를 보였으며(p<0.05), 중성지방(TG) 농도는 실험시료 투여군이 대조군보다 낮은 경향을 보였으나 군별 유의적인 차이는 나타나지 않았다.
- 05). STZ에 의한 당뇨쥐에서는 인슐린의 분비가 감소되면서 당 대사의 불균형을 초래하며 간장, 신장 및 심장이 비대하는데(30,31), 본 연구에서 팽화발효홍삼 및 일반홍삼의 투여는 대조군과 유의적인 차이를 보이지 않아 장기무게에 큰 영향을 주지 않은 것으로 드러났으며, 이에 따라 시료 투여에 의한 독성이 거의 나타나지 않는 것으로 사료되었다.
- 05). 경구당부하 검사 결과는 실험기간 중의 시료투여가 얼마나 체내에 내당능이 조성되었는가를 알아볼 수 있는 지표로서(39) 이상의 결과 Bifidobacterium breve와 Lactobacillus delbrueckii의 혼합균주를 사용한 팽화발효홍삼의 지속적인 투여는 당뇨유도쥐에게 상당한 정도의 내당능 조성에 기여한 것으로 확인되었다.
- 05). 공복혈당치는 실험기간 중 혈당변화 및 경구당부하 검사 결과와 유사한 경향으로 BL군의 혈당강하 효과를 확인할 수있었으며, 인슐린 분비도 감소시킨 것으로 드러났다. 이는 BL군에 투여한 팽화발효홍삼의 ginsenoside가 유산균 발효에 의해 체내 흡수율이 높은 상태로 전환되어 혈당저하 및 인슐린 분비 감소에 유의한 작용을 한 것으로 사료된다.
- 본 연구에서 팽화홍삼을 발효한 결과 ginsenoside가 저분자로 전환되는 것을 확인하였으며, 특히 Bifidobacterium breve와 Lactobacillus delbrueckii의 혼합균주를 사용할 경우 Enterococcus faecalis 균주를 사용할 때보다 발효능이 더욱 높아지는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 이들 유산균주를 이용한 팽화발효홍삼은 체내에 흡수되기 쉬운 형태로써 홍삼의 효능을 증진시킬 수 있을 것으로 판단된다.
- 05). 또한 기준혈당(reference blood glucose) 대비 실험 5주 후 혈당상승률은 DC, RG, EF군이 각각 18, 18, 10%로 다소 증가한 반면, BL군은 -12%로 다소 감소한 것으로 나타났다.
- 이와 관련하여 Lee 등(36)은 STZ 당뇨쥐에게 배양인삼분말 첨가식이가 혈당저하 효과를 나타낸다고 하였으며, Kim 등(37)은 홍삼이 STZ 투여에 의한 고혈당 유발 시 혈당강하작용이 있음을 보고한 바 있다. 본 연구결과 일반홍삼군(RG)은 대조군(DC)에 비해 혈당강하 정도가 미미하였는데, 유의한 효과의 확인을 위해 시료 투여량을 증가시킬 필요가 있을 것으로 판단되며, 선행연구에서 혈당강하효과가 확인된 유산균 3종(38) 중 간균 형태인 Bifidobacterium과 Lactobacillus의 혼합배양균주 및 구균 형태인 Enterococcus 균주를 각각 이용하여 발효 제조한 팽화발효홍삼의 경우, 대조군보다 혈당감소 정도가 비교적 적은 EF군에 비해 유의한 혈당감소 효과가 나타난 BL군의 결과를 통하여 팽화홍삼의 발효 시 Bifidobacterium breve와 Lactobacillus delbrueckii의 혼합균주 사용은 혈당강하능을 증진시키는데 큰 도움을 줄 수 있을 것으로 사료되었다.
- 최근 연구된 보고들에 의하면 ginsenoside가 체내에서 장내의 미생물에 의해서 전환되어지고, 이 과정에서 저분자화 된 구조들이 흡수되어 그 효능을 나타내는 것으로 알려져 있다(27,28). 본 연구에서 팽화홍삼을 발효한 결과 ginsenoside가 저분자로 전환되는 것을 확인하였으며, 특히 Bifidobacterium breve와 Lactobacillus delbrueckii의 혼합균주를 사용할 경우 Enterococcus faecalis 균주를 사용할 때보다 발효능이 더욱 높아지는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 이들 유산균주를 이용한 팽화발효홍삼은 체내에 흡수되기 쉬운 형태로써 홍삼의 효능을 증진시킬 수 있을 것으로 판단된다.
- 이중 증체량은당뇨대조군(DC)이 홍삼 및 팽화발효홍삼 투여군(RG, BL, EF)에 비해 평균 37% 가량 낮았는데 이는 STZ가 췌장 내 β-세포를 선택적으로 파괴함으로써 인슐린의 합성이 저하 되며 이로 인해 초래되는 당 대사의 불균형, 체지방의 과잉 분해 및 체단백의 지속적인 소실로 인해 다소간의 체중감소현상이 나타난 것으로 보인다(29). 본 연구의 결과로 볼 때 팽화발효홍삼은 체중증가 억제와 관련하여 뚜렷한 효능을 나타내지는 않는 것으로 사료된다.
- 비장무게(0.19～0.25 g) 및 정소무게(0.81～0.95 g)는 실험군간 유의적인 차이가 없었고, 췌장무게는 EF군(0.22 g)이 BL군(0.16 g)보다 유의하게 높았다(p<0.05).
- 팽화발효홍삼이 STZ로 유도한 당뇨쥐의 체중, 증체량, 식이섭취량 및 식이효율에 미치는 영향은 Table 2와 같다. 실험종료 시 체중(356.2～402.7 g), 일당 증체량(0.91～1.73 g), 일당 식이섭취량(16.15～18.11 g) 및 식이효율(0.05～0.10)은 실험군 간에 유의적인 차이를 보이지 않았다. 이중 증체량은당뇨대조군(DC)이 홍삼 및 팽화발효홍삼 투여군(RG, BL, EF)에 비해 평균 37% 가량 낮았는데 이는 STZ가 췌장 내 β-세포를 선택적으로 파괴함으로써 인슐린의 합성이 저하 되며 이로 인해 초래되는 당 대사의 불균형, 체지방의 과잉 분해 및 체단백의 지속적인 소실로 인해 다소간의 체중감소현상이 나타난 것으로 보인다(29).
- 실험종료 후 공복혈당치는 BL군이 7.10 mmol/L로 DC군(14.59 mmol/L) 및 RG군(12.56 mmol/L)보다 유의하게 낮았으며(p<0.05), 혈청 인슐린 농도는 DC군(14.94 μU/mL)과 BL군(10.12 μU/mL) 간에 유의적인 차이가 있었다(p<0.05).
- 이상에서 STZ로 유도한 당뇨쥐에게 유산균 Bifidobacterium breve와 Lactobacillus delbrueckii의 혼합배양균주를 사용하여 제조한 팽화발효홍삼을 투여했을 때 뚜렷한 혈당 강하 효과 및 혈당관련 지표성분과 혈청 지질농도 개선 효과를 확인할 수 있었다. 일반홍삼과 팽화발효홍삼의 더욱 명확한 효능 비교를 위해서 시료 투여수준 및 발효 균주의 다각화 등의 보완연구가 필요할 것으로 생각되며, 향후 이들 기능성 소재를 이용하여 당뇨 개선을 위한 다양한 활용제품의 개발이 가능할 것으로 기대된다.
- 인슐린을 분비하는 췌장 β-세포의 기능을 알 수 있는 Cpeptide 함량은 팽화발효홍삼 투여군(BL, EF)이 각각 189.65, 168.16 pmol/L로 당뇨대조군(132.12 pmol/L)에 비해 평균 47 pmol/L 가량 높았으나 실험군간 유의적인 차이는 나타나지 않았다.
- 인슐린저항성(HOMAIR)을 살펴보면 DC군(9.69)에 비해 팽화발효홍삼 투여군(BL, EF)이 유의하게 낮았으며(p<0.05), 이중 BL군(3.19)은 EF군(5.64)보다도 유의적으로 낮은 것으로 나타났다(p<0.05).
- 본 실험에 사용한 3종의 홍삼농축액의 주요 ginsenoside 함량은 Table 1에 제시하였다. 일반홍삼농축액에 비해 팽화홍삼농축액 시료들에서 Rg1, Rh1, Rb1, Rb2, Rc 등과 같은 고분자의 사포닌들은 유의적으로 감소하고, Rg3, Compound-K 등 저분자의 대사체 사포닌은 유의하게 증가함을 확인하였다. 최근 연구된 보고들에 의하면 ginsenoside가 체내에서 장내의 미생물에 의해서 전환되어지고, 이 과정에서 저분자화 된 구조들이 흡수되어 그 효능을 나타내는 것으로 알려져 있다(27,28).
- 장기간 평균 혈당 관리의 지표인 당화혈색소 함량은 BL군(5.37%)이 DC 및 RG군(7.13, 6.68%)보다 유의하게 낮아(p<0.05) 팽화발효홍삼의 혈당조절 효과를 확인할 수 있었다.
- 포도당 투여 후 30분까지는 실험군간 유의한 차이를 보이지 않았고, 포도당투여 60분 후에는 모든 실험군에서 최고 혈당치를 보였으며, DC군(385.3 mg/dL)과 RG군(369.4 mg/dL)에 비해 BL군(332.5 mg/dL)의 혈당이 유의적으로 낮게 나타났다(p<0.05).
- 혈중 총콜레스테롤(TC) 농도는 DC군(89.25 mg/dL)에 비해 홍삼 및 팽화발효 홍삼 투여군(RG, BL, EF)이 각각 73.17, 68.53, 70.02 mg/dL로 통계적으로 유의하게 낮았으며(p<0.05), HDL-콜레스테롤 농도는 실험군간 유의한 차이가 없었다.
- 홍삼 및 팽화발효홍삼 투여군 중 BL군은 실험 1～5주 동안 280.9～329.6 mg/dL의 범위로 DC군(363.3～419.7 mg/dL) 및 RG군(359.4～417.9 mg/dL)의 혈당치보다 2주째를 제외하고 통계적으로 유의하게 낮았으며(p<0.05), 실험 5주째의 BL군의 혈당은 295.2 mg/dL로 DC군(403.8 mg/dL) 및 RG군(401.4 mg/dL)뿐만 아니라 EF군(379.2 mg/dL)보다도 유의하게 낮은 결과를 보였다(p<0.05).
후속연구
- 이와 관련하여 Lee 등(36)의 연구에서는 배양인삼분말 5% 및 10%를 식이에 첨가 시 당뇨쥐의 지질대사의 개선을 보고하였고, Yamamoto(46)는 인삼 사포닌 성분이 혈중 콜레스테롤의 저하 및 배설을 촉진한다고 보고한 바 있다. 본 연구에서 사용된 팽화발효홍삼도 혈중 TC 및 LDL-콜레스테롤 농도를 유의적으로 낮추어, 이의 지속적인 투여는 혈청 지질 조성을 개선하여 당뇨에 의한 여러 합병증을 예방하는데 매우 효과적일 것으로 사료된다.
- 이상에서 STZ로 유도한 당뇨쥐에게 유산균 Bifidobacterium breve와 Lactobacillus delbrueckii의 혼합배양균주를 사용하여 제조한 팽화발효홍삼을 투여했을 때 뚜렷한 혈당 강하 효과 및 혈당관련 지표성분과 혈청 지질농도 개선 효과를 확인할 수 있었다. 일반홍삼과 팽화발효홍삼의 더욱 명확한 효능 비교를 위해서 시료 투여수준 및 발효 균주의 다각화 등의 보완연구가 필요할 것으로 생각되며, 향후 이들 기능성 소재를 이용하여 당뇨 개선을 위한 다양한 활용제품의 개발이 가능할 것으로 기대된다.
- 인슐린저항성이 있는 사람에서는 심혈관질환 및 당뇨병에 의한 사망률이 증가한다(42). 즉 혈당조절과 합병증 관리를 위해서는 인슐린 분비능뿐만 아니라 인슐린저항성을 고려한 치료법의 선택이 매우 중요하므로(43) 본 연구의 결과와 같이 팽화발효홍삼에 의한 인슐린저항성의 개선이 당뇨병 치료에 도움이 될 것으로 판단된다.
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