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Luminol-H2O2-Cu(II) 시스템을 이용한 방향족 아미노산의 화학발광법적 정량
Determination of aromatic amino acids by chemiluminometric assay with Luminol-H2O2-Cu(II) system 원문보기

분석과학 = Analytical science & technology, v.25 no.3, 2012년, pp.171 - 177  

김경민 (경북대학교 화학과) ,  김영호 (경북대학교 차세대에너지기술연구소) ,  이상학 (경북대학교 화학과)

초록
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Luminol-$H_2O_2$-Cu(II) 시스템을 이용한 화학발광법을 사용하여 방향족 아미노산인 트립토판, 타이로신페닐알라닌의 정량분석을 하였다. 세 종류의 방향족 아미노산(트립토판, 타이로신, 페닐알라닌)을 luminol-$H_2O_2$-Cu(II) 시스템에 첨가하였을 때 아미노산이 존재하지 않을 때보다 화학발광세기가 더욱 증가하는 현상을 관찰하였으며, 이러한 현상을 이용하여 각 방향족 아미노산을 정량분석 하였다. 방향족 아미노산의 최적분석 조건을 조사하기 위하여, Cu(II) 이온 촉매에 의한 루미놀과산화수소의 화학발광반응에 미치는 아미노산의 반응속도론적 영향을 조사하였고 과산화수소와 Cu(II) 이온의 농도 그리고 pH와 완충용액의 영향을 조사하였다. 루미놀 화학발광 시스템의 최적 분석조건 하에서 수용액 중의 방향족 아미노산 정량분석을 위해 얻은 검정곡선에서 직선성이 성립하는 농도 범위는 각각 트립토판은 $1.0{\times}10^{-6}{\sim}2.0{\times}10^{-5}\;M$, 타이로신은 $1.0{\times}10^{-6}{\sim}2.0{\times}10^{-5}\;M$ 그리고 페닐알라닌은 $2.0{\times}10^{-6}{\sim}2.0{\times}10^{-5}\;M$이었으며, 이 구간에서 각 아미노산에 대한 상대표준편차(n = 4)는 순차적으로 3.21%, 2.64% 그리고 2.48%이었다. 그리고 각 아미노산의 검출한계($3{\sigma}/s$)는 트립토판 $6.8{\times}10^{-7}\;M$, 타이로신 $5.7{\times}10^{-7}\;M$, 페닐알라닌 $9.6{\times}10^{-7}\;M$이었다.

Abstract AI-Helper 아이콘AI-Helper

A determination method of aromatic amino acids such as trytophan (Trp), tyrosine (Tyr), and phenylalanine (Phe) using luminol-$H_2O_2$-Cu(II) system has been presented. In the presence of an aromatic amino acid, the enhanced chemiluminescence (CL) intensity of luminol-$H_2O_2$-...

주제어

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제안 방법

  • 아미노산이 Cu(II) 이온의 리간드로 작용하여 금속이온 촉매 활성에 영향을 미치는 현상을 이용하여 아미노산의 농도에 따른 화학발광세기의 변화량을 측정함으로써 아미노산을 정량분석하는 방법은 주로 FIA에 기반한 연구가 진행되어왔다.17-18 본 연구에서는 간단한 기기장치로 신속하게 분석할 수 있는 SFA(stopped-flow analysis)를 이용하여 실험을 진행하였다. 이와 같이 본 연구에서는 luminol-H2O2-Cu(II) 시스템을 이용하여 생물체의 20개 아미노산 중 방향족 곁사슬을 가진 트립토판(tryptophan, Trp), 타이로신(tyrosine, Tyr), 그리고 페닐알라닌(phenylalanine, Phe)을 신속하고 고감도로 정량분석 하였다.
  • 20 루미놀 화학발광 시스템은 촉매의 종류에 따라 화학발광신호의 프로파일이 다양한 형태를 나타내며, 이는 분석 감도와 정밀도에 직접적인 영향을 미치기 때문에 트립토판의 존재 하에서 다양한 촉매에 대한 430 nm 파장에서 빛의 방출세기를 60초간 측정하였으며, 그 결과를 Fig. 1에 나타내었다. Fe(CN)63−와 Co(II)-EDTA 같은 착물 형태의 촉매는 상대적으로 자유금속이온으로 존재하는 Cu(II)나 나노입자가 콜로이드 형태로 존재하는 AgNPs보다 화학발광의 지속시간이 길고 안정적이었지만, 반응 용액 내 아미노산의 존재여부에 따른 화학발광 세기 변화가 거의 없었다.
  • Luminol-H2O2-Cu(II) 시스템에 아미노산을 주입하였을 때 아미노산이 Cu(II)와 착물을 형성하는 과정에 의해 화학발광 세기가 증가하는 현상을 이용하여 방향족 아미노산인 트립토판, 타이로신, 그리고 페닐알라닌의 정량분석을 하였다. 본 연구의 화학발광법을 이용한 방향족 아미노산 정량법은 광원이 필요 없기 때문에 측정 장치의 소형화에 용이하며, 배치 형태의 SFA를 이용하여 비교적 간단한 기기장치를 사용하여 신속하게 분석할 수 있다.
  • 0 nm로 조절하였으며, 미디언 보정(median smooth)을 통해 바탕잡음을 보정하였다. UV-1800 spectrophotometer (Shimadzu, 일본)를 사용하여 UV-Vis 흡수스펙트럼을 측정하였고, 완충용액의 pH 조절은 pH 미터(Mettler-toledo MP 220, 미국)를 사용하였다. 화학발광과 흡광도 측정은 표준규격의 1 cm × 1 cm 석영재질의 셀을 사용하였다.
  • 루미놀 표준용액의 저장용기는 알루미늄 호일로 감싸서 외부 빛의 노출을 차단하였으며, 과산화수소 저장용액과 동일하게 4 ℃가 유지되는 냉장고에 보관하였다. pH 조절을 위하여 사용된 완충용액은 0.1 M의 붕산(H3BO3), 탄산수소나트륨(NaHCO3), 인산이수소칼륨(KH2PO4), 그리고 트리스(Tris, (HOCH2)3CNH2) 50 mL 용액에 1 M NaOH용액을 각각 일정 비율로 더하여 원하는 pH로 조절하였으며, pH 미터를 사용하여 최종적으로 pH를 확인하였다. Co(II)-EDTA용액은 Co(NO3)2·6H2O(Alfa)과 Na2EDTA(Junsei), 그리고 10mM Fe(CN)63− 저장용액은 K3Fe(CN)6 (Junsei)를 증류수에 녹여 준비하였다.
  • 각 아미노산의 농도를 2 × 10−5 M로 고정하고 Cu(II) 농도를 2 × 10−7~1 × 10−4 M 범위에서 변화시키면서 화학발광 세기를 측정하였다.
  • 루미놀 화학발광 시스템에 아미노산을 첨가하였을 때 화학발광 세기가 증가하는 현상을 이용하여 앞 실험에서 최적화된 조건으로 각 세가지 방향족 아미노산의 농도를 1 × 10−8~2 × 10−4 M 범위로 조절해 가면서 화학발광 세기를 4회 측정하였고, 검정범위 내에서 정밀도(RSD), 검출한계(3σ/s), 검정곡선식, 그리고 직선성을 나타내는 상관계수(R)를 도출하였으며, 그 결과를 Table 2에 나타내었다.
  • 루미놀 화학발광 시스템을 이용한 아미노산 정량을 위해 다음과 같은 절차에 의해서 실험을 진행하였다. 마이크로 피펫을 사용하여 방향족 아미노산 표준용액, Cu(II) 이온, 완충용액, 루미놀 순으로 각각 0.4 mL를 셀에 주입하고, 과산화수소 0.4 mL를 주입한 후 화학 발광의 세기를 측정하였다. 시약의 주입 순서에 따라 화학발광의 세기와 지속시간이 큰 차이를 나타내었다.
  • 산화제 농도가 화학발광 반응에 미치는 영향을 알아보기 위해 과산화수소의 농도를 2 × 10−6~2 × 10−3 M 범위로 조절해 가면서 화학발광 세기를 측정하였고 그 결과를 Fig. 6에 나타내었다.
  • 25 또한 pH 변화는 아미노산의 전하에도 영향을 주어 Cu(II) 이온 촉매와의 상호작용에도 영향을 미칠 수 있다. 아미노산 존재 하에서 루미놀 화학발광 시스템의 pH에 따른 영향을 조사하기 위해 붕산염 완충용액을 사용하여 pH 10~13.5 범위 내에서 조절해 가면서 화학발광 세기를 각각 측정하였고 그 결과를 Fig. 4에 나타내었다. 특징적인 것은 아미노산을 첨가하였을 때 바탕신호 세기보다 신호 세기가 증가함을 확인할 수 있었으며 또한 아미노산을 첨가하지 않았을 때와 비교하여 pH 11~12.
  • 17-18 본 연구에서는 간단한 기기장치로 신속하게 분석할 수 있는 SFA(stopped-flow analysis)를 이용하여 실험을 진행하였다. 이와 같이 본 연구에서는 luminol-H2O2-Cu(II) 시스템을 이용하여 생물체의 20개 아미노산 중 방향족 곁사슬을 가진 트립토판(tryptophan, Trp), 타이로신(tyrosine, Tyr), 그리고 페닐알라닌(phenylalanine, Phe)을 신속하고 고감도로 정량분석 하였다.
  • 각각 루미놀, 과산화수소, 방향족 아미노산 용액, Cu(II) 이온, 그리고 완충용액을 어떠한 순서로 주입하느냐에 따라 화학발광의 세기와 지속시간에 영향을 주었다. 화학적 조성에 따른 영향을 조사하기 전 시약의 주입 순서를 최적화하고자 Table 1과 같이 동일한 농도의 용액을 3가지 다른 순서로 시약을 주입하였을 때, 각각의 화학발광 세기와 4번 반복 측정한 신호의 상대표준편차를 비교하였다. 각 용액을 ‘절차 1’(트립토판 표준용액, Cu(II) 이온, 완충용액, 루미놀, 그리고 과산화수소) 순으로 주입하였을 때, 바탕신호 대비 분석신호의 화학발광 세기 증가량이 157%로 ‘절차 2’의 102%와 ‘절차 3’의 134%보다 컸다.

대상 데이터

  • Co(II)-EDTA용액은 Co(NO3)2·6H2O(Alfa)과 Na2EDTA(Junsei), 그리고 10mM Fe(CN)63− 저장용액은 K3Fe(CN)6 (Junsei)를 증류수에 녹여 준비하였다. AgNPs(Ag-nano particles) 용액은 1 mM AgNO3 (Junsei) 용액과 2 mM NaBH4(Merck) 용액을 사용하여 합성하였다.19
  • Co(II)-EDTA용액은 Co(NO3)2·6H2O(Alfa)과 Na2EDTA(Junsei), 그리고 10mM Fe(CN)63− 저장용액은 K3Fe(CN)6 (Junsei)를 증류수에 녹여 준비하였다.
  • 본 실험에 사용한 방향족 아미노산 저장용액은 각각 트립토판, 타이로신 그리고 페닐알라닌(Sigma-Aldrich)을 1 × 10−3 M NaOH 용액에 녹여 5 × 10−3 M, 루미놀 용액은 0.0366 g 루미놀(Sigma-Aldrich)을 1× 10−3 M NaOH 용액에 녹여 2 × 10−3 M, Cu(II) 이온 저장용액은 CuSO4(Duksan)를 탈이온수에 녹여 1 × 10−2 M, 과산화수소 저장용액은 과산화수소(Junsei)를 사용하여 1 M로 제조하였고, 과산화수소 저장용액은 1주일을 주기로 새로 만든 것을 사용하였다.
  • 본 실험에 화학발광을 측정하기 위해 사용한 장비는 Model F-4500 Spectrofluorometer (Hitachi, 일본)이며, 광원을 꺼놓은 상태에서 실험을 수행하였다. 시료에서 방출되는 화학발광의 검출은 Model R928 (Hamamatsu, 일본)의 광전증배관(photomultiplier tube, PMT)을 사용하였다.
  • 본 실험에 화학발광을 측정하기 위해 사용한 장비는 Model F-4500 Spectrofluorometer (Hitachi, 일본)이며, 광원을 꺼놓은 상태에서 실험을 수행하였다. 시료에서 방출되는 화학발광의 검출은 Model R928 (Hamamatsu, 일본)의 광전증배관(photomultiplier tube, PMT)을 사용하였다. 모든 실험에서 PMT에 걸리는 전압을 700 V로, 검출기 입구의 슬릿(emission slit)은 5.

데이터처리

  • 시약의 주입 순서에 따라 화학발광의 세기와 지속시간이 큰 차이를 나타내었다. 상기 세 가지 방향족 아미노산 용액을 루미놀 화학발광 시스템을 이용하여 340~550 nm 파장 범위에서 방출스펙트럼 측정(wavelength-scan) 결과 화학발광신호의 최고 지점이 430 nm에서 나타남을 확인하였고, 본 실험에서 측정한 모든 화학발광 세기는 430 nm에서의 빛 세기를 1초 간격으로 60초 동안 측정(time-scan)한 뒤 1~5 초간 신호세기의 평균값을 적용하였으며, 각 측정은 3회 이상 수행하여 평균값과 표준편차를 산출하였다.
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질의응답

핵심어 질문 논문에서 추출한 답변
아미노산이란 무엇인가? 아미노산은 모든 생물체의 조직을 구성하는 주요 성분이며 생체반응을 활성화하는 효소나 면역을 담당하는 항체를 구성하는 단백질의 기본 단위체이다. 또한 아미노산은 세로토닌과 멜라토닌 등 신경전달물질이나 티록신과 인돌아세트산(indole acetic acid) 등 호르몬을 합성하기 위한 유도체, 그리고 뉴클레오티드(nucleotide), 헴(heme) 및 엽록소 등의 질소를 포함하는 거대 생체분자의 합성에 필요한 전구체로 사용되는 등 생물체 내에서 매우 다양하고 중요한 역할을 담당하고 있다.
아미노산은 어떠한 역할을 담당하는가? 아미노산은 모든 생물체의 조직을 구성하는 주요 성분이며 생체반응을 활성화하는 효소나 면역을 담당하는 항체를 구성하는 단백질의 기본 단위체이다. 또한 아미노산은 세로토닌과 멜라토닌 등 신경전달물질이나 티록신과 인돌아세트산(indole acetic acid) 등 호르몬을 합성하기 위한 유도체, 그리고 뉴클레오티드(nucleotide), 헴(heme) 및 엽록소 등의 질소를 포함하는 거대 생체분자의 합성에 필요한 전구체로 사용되는 등 생물체 내에서 매우 다양하고 중요한 역할을 담당하고 있다. 아미노산은 펩티드와 단백질의 구성 성분이기 때문에, 아미노산의 분석을 통하여 얻은 각 아미노산의 정성 및 정량적 결과는 펩티드와 단백질의 구조분석을 수행하는데 중요한 정보를 제공한다.
극미량의 아미노산 시료를 고감도로 신속하게 분석하는 기술이 생물 및 생물기반 응용분야에서 매우 중요한 기술로 대두되어 온 이유는 무엇인가? 또한 아미노산은 세로토닌과 멜라토닌 등 신경전달물질이나 티록신과 인돌아세트산(indole acetic acid) 등 호르몬을 합성하기 위한 유도체, 그리고 뉴클레오티드(nucleotide), 헴(heme) 및 엽록소 등의 질소를 포함하는 거대 생체분자의 합성에 필요한 전구체로 사용되는 등 생물체 내에서 매우 다양하고 중요한 역할을 담당하고 있다. 아미노산은 펩티드와 단백질의 구성 성분이기 때문에, 아미노산의 분석을 통하여 얻은 각 아미노산의 정성 및 정량적 결과는 펩티드와 단백질의 구조분석을 수행하는데 중요한 정보를 제공한다.1-5 따라서 극미량의 아미노산 시료를 고감도로 신속하게 분석하는 기술은 생물 및 생물기반 응용분야에서 매우 중요한 기술로 대두되어 왔다.
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참고문헌 (25)

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