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문제 정의
- 본 연구에서는 신생아 질환과 사망 원인 중 첫 번째에 해당하는 설사의 주된 원인균인 Campylbactor jejuni에 대한 쇠비름 발효액의 항균 효과를 검증해 보고자 하였다. 민간요법과 한방에서 널리 이용되어온 쇠비름은 각종 항균 효과나 항염증, 항암 효과 등이 있는 것으로 알려져 있는 식용 식물로, 여기에서 식물성 유산균을 분리해 각종 프로바이오틱스와 더불어 쇠비름 발효액을 제조하였다.
- 쇠비름은 예로부터 민간요법과 한방에서 널리 사용되어온 식용 식물로 각종 항균효과나 항염증, 항암 효과 등이 있는 것으로 알려져 있고, 국내 야산 등지에서 널리 자생하고 있다(Bae JH 2004; Park 등 2011). 본 연구에서는 프로바이오틱스와 약용 식물로 활용되어 온 쇠비름으로부터 식물성 유래 유산균을 분리하여 쇠비름 추출물 발효액을 제조한 후, 이들이 신생아 장염 유발 미생물인 C. jejuni의 증식에 미치는 영향을 조사해 보고자 하였다.
제안 방법
- 45 ㎛, Millipore, USA)로 제균한 쇠비름 추출물과 쇠비름 발효액을 각각 10 ㎎/㎖, 20 ㎎/㎖의 농도로 첨가하였다. 10% CO2, 42℃의 미호기성 조건에서 48시간 배양하면서 600 ㎚에서 흡광도 변화를 측정하였다.
- 실험에 사용한 균주는 Table 1과 같이 한국농업미생물자원센터와 생명자원센터에서 분양 받아 MRS(Difco, USA)배지 또는 Brucella(Difco, USA) 배지에 계대 배양하였다. Campylbacter jejuni 균의 배양에는 4% fetal bovine serum(Gibco, USA)을 첨가한 Brucella broth(Difco, USA)를 이용하였으며, 미호기성 조건을 유지시켜 주기 위해서 CO2 incubator(SANYO, MCO-175, Japan)에서 10% CO2, 습도 95% 이상, 42℃ 온도를 유지하였다.
- Lactobacillus delbrueckii도 비교적 증식하였으나, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus rhamnosus 및Bifodobacterium longum 등은 쇠비름 추출액에서 잘 자라지 못함을 나타냈다. Fig. 1에서 선발된 두 종의 균주를 선택하여 쇠비름 추출액에 각각 1% 농도를 접종하고, 균의 증식을 도와주는 각종 영양성분들을 첨가해 주었다. 쇠비름 추출액에 탄수화물 급원으로 glucose를 농도별로 첨가하고, 무기질 및 비타민 등을 공급하기 위해 yeast extract를 사용하여 농도별로 첨가하였다.
- 05 N NaOH로부터 젖산의 함량(%)을 계산하였다. pH와 산도는 0, 6, 12, 36, 48시간 단위로 모니터링하였다. 모든 데이터는 3회 반복하여 평균과 표준편차로 표시하였으며, 분산 분석으로 통계 처리하였다.
- , Germany) 10,000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 얻은 상등액을 MRS 평판배지(Difco, USA)에 도말하고, 37℃에서 3일 동안 배양(incubator, HK-IB072, 한국종합기기제작소) 하였다. 가장 좋은 증식률을 보인 한 종의 집락을 선택하여 15회 반복 도말함으로 순수분리시키고, 15번째 배지 중 가장 좋은 증식률을 보인 한 colony를 선택하여 MRS broth에 접종하고 24시간 배양한 후 사용하였다.
- 경북 경산시의 인근 농가에서 재배한 쇠비름을 잘 씻어 말린 후 쇠비름 중량의 1.5%(w/w)에 해당하는 소금을 넣고 2배의 물을 첨가한 후 저온초음파병합추출기(SONIMEDI, Korea)를 이용하여 60℃, 620 kHz 초음파에서 6시간 압착, 추출하였다. 그리고 bottle top filter 0.
- 프로바이오틱스 증식을 도와주는 조건을 찾고, 가장 높은 증식률을 보인 균주를 선택하여 최종 쇠비름 발효액을 제조하였다. 대조군으로 사용한 쇠비름 발효액에는 상기의 영양 성분들을 제외한 나머지 균주만을 동일 농도로 첨가해 만들었다.
- 멸균 처리된 쇠비름 추출액에 yeast extract 2%, peptone 1%, potassium phosphate 0.1%를 각각 첨가하고, 쇠비름에서 분리한 균과 Leuconostoc mesenteroides를 각각 1%씩 접종한 후 37℃에서 3일간 발효시켰다. 접종 직후와 48시간 배양 뒤에 각각의 생균수를 계대희석법을 이용해 측정하고, 5℃ 냉장고에 2주 동안 보관하면서 살아남은 생균수를 계수하였다.
- 쇠비름 대조군(쇠비름 추출물에 쇠비름에서 분리한 균과 Leuconostoc mesenteroides 만을 접종한 것)과 쇠비름 발효액(쇠비름 추출물에 쇠비름에서 분리한 균과 Leuconostoc mesenteroides을 접종하고 증식에 필요한 각종 영양분을 첨가한 것)을 취해 pH meter(METTLER TOLEDO, pH meter 320, Shanghai)를 사용해 pH를 측정하였다. 산도는 대조군과 쇠비름 발효액 각각 1㎖를 취하여 증류수 9 ㎖를 가해 희석한 후 1% phenolphthalein 용액(DUKSAN, Korea) 2～3방울을 가하고, 0.05 N NaOH 용액(DUKSAN, Korea)으로 적정하였으며, 적정에 소비된 0.05 N NaOH로부터 젖산의 함량(%)을 계산하였다. pH와 산도는 0, 6, 12, 36, 48시간 단위로 모니터링하였다.
- 쇠비름 대조군(쇠비름 추출물에 쇠비름에서 분리한 균과 Leuconostoc mesenteroides 만을 접종한 것)과 쇠비름 발효액(쇠비름 추출물에 쇠비름에서 분리한 균과 Leuconostoc mesenteroides을 접종하고 증식에 필요한 각종 영양분을 첨가한 것)을 취해 pH meter(METTLER TOLEDO, pH meter 320, Shanghai)를 사용해 pH를 측정하였다. 산도는 대조군과 쇠비름 발효액 각각 1㎖를 취하여 증류수 9 ㎖를 가해 희석한 후 1% phenolphthalein 용액(DUKSAN, Korea) 2～3방울을 가하고, 0.
- 6과 같이 나타났다. 쇠비름 추출물과 쇠비름 발효액에 상기 실험에서 선택된 2가지 종류의 균주를 각각 1% 농도로 접종하고, 48시간 발효를 시킨 후 생균수를 측정하였다. 실험군인 쇠비름 발효액의 경우, 생균수의 수가 대조군(쇠비름 추출물에 각종 영양성분을 제외한 균주만 접종한 것)보다 높게 나타나, 1012 CFU/㎖까지 프로바이오틱스가 증식하고 있음을 알 수 있었다.
- 쇠비름 추출물에 1% 농도의 프로바이오틱스를 종류별로 접종하고, 여기에 glucose 5%, 10%, 15%, yeast extract 1%, 2%, 3%, peptone 1%, 2%, 3% 및 potassium phosphate 0.05%, 0.1%, 0.15%를 각각 혼합한 후 37℃에서 배양하며 510 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 프로바이오틱스 증식을 도와주는 조건을 찾고, 가장 높은 증식률을 보인 균주를 선택하여 최종 쇠비름 발효액을 제조하였다.
- 1에서 선발된 두 종의 균주를 선택하여 쇠비름 추출액에 각각 1% 농도를 접종하고, 균의 증식을 도와주는 각종 영양성분들을 첨가해 주었다. 쇠비름 추출액에 탄수화물 급원으로 glucose를 농도별로 첨가하고, 무기질 및 비타민 등을 공급하기 위해 yeast extract를 사용하여 농도별로 첨가하였다. Glucose 의 경우 5～15%까지 첨가해 주었을 때 오히려 선발된 균주들의 증식을 저지시켰고, 이는 수분활성도의 저하에서 일어난 현상이라 사료된다.
- 쇠비름에 열배의 증류수를 첨가하여 Homogenizer(WissMixIM. HG-15D, DAIHAN scientific)로 분쇄한 후 원심분리기(MICRO 24-48 R., Germany) 10,000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 얻은 상등액을 MRS 평판배지(Difco, USA)에 도말하고, 37℃에서 3일 동안 배양(incubator, HK-IB072, 한국종합기기제작소) 하였다. 가장 좋은 증식률을 보인 한 종의 집락을 선택하여 15회 반복 도말함으로 순수분리시키고, 15번째 배지 중 가장 좋은 증식률을 보인 한 colony를 선택하여 MRS broth에 접종하고 24시간 배양한 후 사용하였다.
- 액체배양법으로 쇠비름 추출물과 발효액을 C. jejuni에 적용시켜 증식 효과를 조사해 본 바, Fig. 7과 같은 결과를 얻을 수 있었다. 대조군에 비해 쇠비름 추출물과 쇠비름 발효액을 배지에 첨가한 경우, C.
- 1%를 각각 첨가하고, 쇠비름에서 분리한 균과 Leuconostoc mesenteroides를 각각 1%씩 접종한 후 37℃에서 3일간 발효시켰다. 접종 직후와 48시간 배양 뒤에 각각의 생균수를 계대희석법을 이용해 측정하고, 5℃ 냉장고에 2주 동안 보관하면서 살아남은 생균수를 계수하였다.
- 탁도 0.5로 맞춘 C. jejuni를 Brucella 배지에 1% 농도로 접종하고, membrane filter(0.45 ㎛, Millipore, USA)로 제균한 쇠비름 추출물과 쇠비름 발효액을 각각 10 ㎎/㎖, 20 ㎎/㎖의 농도로 첨가하였다. 10% CO2, 42℃의 미호기성 조건에서 48시간 배양하면서 600 ㎚에서 흡광도 변화를 측정하였다.
- 15%를 각각 혼합한 후 37℃에서 배양하며 510 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 프로바이오틱스 증식을 도와주는 조건을 찾고, 가장 높은 증식률을 보인 균주를 선택하여 최종 쇠비름 발효액을 제조하였다. 대조군으로 사용한 쇠비름 발효액에는 상기의 영양 성분들을 제외한 나머지 균주만을 동일 농도로 첨가해 만들었다.
대상 데이터
- 22 ㎛(Millipore, China)에 여과하여 쇠비름 추출물을 만들고, 감압 농축기(ELELA TYPE N-N SERIES, Japan)로 65℃에서 감압, 농축시키고, 동결건조한 후－18℃ 냉동고에 보관하면서 사용하였다. 실험에 사용한 균주는 Table 1과 같이 한국농업미생물자원센터와 생명자원센터에서 분양 받아 MRS(Difco, USA)배지 또는 Brucella(Difco, USA) 배지에 계대 배양하였다. Campylbacter jejuni 균의 배양에는 4% fetal bovine serum(Gibco, USA)을 첨가한 Brucella broth(Difco, USA)를 이용하였으며, 미호기성 조건을 유지시켜 주기 위해서 CO2 incubator(SANYO, MCO-175, Japan)에서 10% CO2, 습도 95% 이상, 42℃ 온도를 유지하였다.
데이터처리
- pH와 산도는 0, 6, 12, 36, 48시간 단위로 모니터링하였다. 모든 데이터는 3회 반복하여 평균과 표준편차로 표시하였으며, 분산 분석으로 통계 처리하였다.
- 모든 실험은 2회 이상 반복하였으며, 통계 처리는 SPSS (IBM SPSS Statistics version 19)를 이용하여 분산분석(ANOVA)과 Duncan의 다범위 검정법(Duncan's multiple range test)으로 샘플 간의 유의적 차이를 검증하였다.
성능/효과
- 1과 같이 쇠비름 자체에서 분리한 균주와 김치 등에서 분리한 대표적 식물성 유산균인 Leuconostoc mesenteroides가 가장 잘 자람을 알 수 있었다. Lactobacillus delbrueckii도 비교적 증식하였으나, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus rhamnosus 및Bifodobacterium longum 등은 쇠비름 추출액에서 잘 자라지 못함을 나타냈다. Fig.
- 민간요법과 한방에서 널리 이용되어온 쇠비름은 각종 항균 효과나 항염증, 항암 효과 등이 있는 것으로 알려져 있는 식용 식물로, 여기에서 식물성 유산균을 분리해 각종 프로바이오틱스와 더불어 쇠비름 발효액을 제조하였다. Lactobacillus rhamnosus, L. acidophilus, L. bulgaricus, L. delbrueckii, L. plantarum, Leuconostoc mesenteroides 및 Bifidobacterium longum과 쇠비름에서 분리한 균을 쇠비름 추출물에 적용하였을 때, Leuconostoc mesenteroides 와 쇠비름에서 분리한 식물성 유래 유산균이 쇠비름 추출액에서 가장 잘 자랐고, 여기에 2% yeast extract, 1% peptone 및 0.05～1% 인산을 첨가하였을 때 가장 적합한 발효액을 만들 수 있었다. 쇠비름 발효액에 들어있는 생균수는 발효 48시간 후 1×1012 CFU/㎖로 증가하였고, 2주간 냉장 보관을 한 이후에도 생균수가 1.
- 14로 각각 나타나 일반 유제품 발효액의 기준 범위 안에 들어감을 알 수 있었다. PLAB과 Leuconostoc mesenteroides로 만든 쇠비름 발효액은 10 ㎎/㎖ 이상의 농도에서 C. jejuni에 대해 증식 억제 효과를 나타냈으며, 이 억제 효과는 48시간 동안 지속되었다.
- 쇠비름 발효액의 경우, 시간이 경과함에 따라 Table 2에서와 같이 pH는 낮아짐을 알 수 있었고, 산도는 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. pH의 경우, 쇠비름 추출물에 증식에 필요한 각종 영양분을 제외하고, 균주만 접종한 대조군에 비해 실험군인 쇠비름 발효액은 48시간 발효 이후에 pH가 3.7로 낮아짐을 알 수 있었고, 산도도 3.14로 높아지는 것을 확인할 수 있었다. 일반적으로 요구르트의 바람직한 pH 범위는 3.
- 7과 같은 결과를 얻을 수 있었다. 대조군에 비해 쇠비름 추출물과 쇠비름 발효액을 배지에 첨가한 경우, C. jejuni의 증식이 억제됨을 알 수 있었다. 쇠비름 추출물의 경우 20 ㎎/㎖ 농도 이상에서 증식 억제 효과가 있었으나, 발효액의 경우 10 ㎎/㎖ 농도에서 증식 저해 효과를 관찰할 수 있었고, 이 효과는 48시간 동안 지속됨을 알 수 있었다.
- 3과 같이 당의 첨가에 의해서는 증식에 자극을 받지 않았으나, 2% 농도의 yeast extract 첨가에서 가장 높은 증식을 보였다. 또한 질소 급원으로 peptone을 첨가하거나 인산을 제공했을 시 Fig. 4 및 Fig. 5에서와 같이 PLAB나 Leuconostoc mesenteroides 모두가 증식이 증가함을 알 수 있었다. Peptone의 경우 1% 농도가 가장 적합하였으며, 인산의 경우 0.
- 3×1010 CFU/㎖로 남아있었다. 쇠비름 발효액의 pH와 산도는 발효 48시간 이후 3.7과 3.14로 각각 나타나 일반 유제품 발효액의 기준 범위 안에 들어감을 알 수 있었다. PLAB과 Leuconostoc mesenteroides로 만든 쇠비름 발효액은 10 ㎎/㎖ 이상의 농도에서 C.
- 쇠비름 발효액의 경우, 시간이 경과함에 따라 Table 2에서와 같이 pH는 낮아짐을 알 수 있었고, 산도는 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. pH의 경우, 쇠비름 추출물에 증식에 필요한 각종 영양분을 제외하고, 균주만 접종한 대조군에 비해 실험군인 쇠비름 발효액은 48시간 발효 이후에 pH가 3.
- jejuni의 증식이 억제됨을 알 수 있었다. 쇠비름 추출물의 경우 20 ㎎/㎖ 농도 이상에서 증식 억제 효과가 있었으나, 발효액의 경우 10 ㎎/㎖ 농도에서 증식 저해 효과를 관찰할 수 있었고, 이 효과는 48시간 동안 지속됨을 알 수 있었다. Campylobacter는 닭과 같은 가금류 및 사람의 장내에 감염을 일으켜 식이성 장관 질환을 일으키는 대표적 병원균으로, 주로 장내 상피 세포의 표면에 부착되어 감염을 일으키고, 궁극적으로는 세포내로 침범하게 된다.
- 쇠비름 추출액에 Table 1에서와 같이 프로바이오틱스 7종과 쇠비름에서 분리한 식물성 유산균(PLAB)을 접종하고, 37℃에서 배양하면서 510 ㎚에서 흡광도를 조사한 결과, Fig. 1과 같이 쇠비름 자체에서 분리한 균주와 김치 등에서 분리한 대표적 식물성 유산균인 Leuconostoc mesenteroides가 가장 잘 자람을 알 수 있었다. Lactobacillus delbrueckii도 비교적 증식하였으나, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus rhamnosus 및Bifodobacterium longum 등은 쇠비름 추출액에서 잘 자라지 못함을 나타냈다.
- 쇠비름 추출물과 쇠비름 발효액에 상기 실험에서 선택된 2가지 종류의 균주를 각각 1% 농도로 접종하고, 48시간 발효를 시킨 후 생균수를 측정하였다. 실험군인 쇠비름 발효액의 경우, 생균수의 수가 대조군(쇠비름 추출물에 각종 영양성분을 제외한 균주만 접종한 것)보다 높게 나타나, 1012 CFU/㎖까지 프로바이오틱스가 증식하고 있음을 알 수 있었다. 처음 발효를 거치지 않은 상태에서는 두 군에 함유된 생균수가 4.
- 05～1% 농도에서 가장 좋은 증식을 드러냈다. 이상의 결과, 쇠비름을 발효시킬 때 적합한 프로바이오틱스는 쇠비름 자체에서 분리한 균주이거나 Leuconostoc mesenteroides였으며, 이 균주를 이용해 발효액을 제조할 때 yeast extract 2%, peptone 1%, 인산 0.05～0.1%를 첨가해 주면 증식이 촉진됨을 알 수 있었다.
- 2×1010 CFU/㎖로 나왔고, 실험군의 경우, 1×1012 CFU/㎖로 생균수가 증가하였다. 일반 유제품의 경우, 평균 유통기한이 냉장 보관 2주인 점을 고려하여 2주간 냉장보관하였을 시 살아있는 프로바이오틱스 균수에 어떠한 변화가 있는 지 조사해 본 바, 2주 이후에도 생균수가 크게 줄어들지 않고 남아 있음을 알 수 있었다. 쇠비름 발효액의 경우, 2주 후에도 생균수가 1.
- 처음 발효를 거치지 않은 상태에서는 두 군에 함유된 생균수가 4.6×108과 4.3×108로 비슷하게 나왔으나, 48시간 발효 후에는 대조군의 경우 2.2×1010 CFU/㎖로 나왔고, 실험군의 경우, 1×1012 CFU/㎖로 생균수가 증가하였다.
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