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문제 정의
- 이러한 proteoglycan의 합성을 촉진하고 분해를 억제하여 proteoglycan을 증진시키는 치료방법은 골관절염의 증상을 완화시키는 주요방법 중 하나이다. 본 연구에서는 봉독이 papain으로 유도된 골관절염 마우스에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 골관절염 유발 42일째 실험 종료 후 마우스의 우측 무릎관절을 적출하여 safranin Ofast green 염색을 실시하여 proteoglycan의 함유량을 확인하였다. 연골의 침습 정도를 관찰한 결과 정상군의 관절연골은 적색으로 전 층이 염색되어 proteoglycan 함유량이 풍부한 상태로 관찰되었으며, 대조군에서는 관절 연골의 결손이나 미란이 심하고 정상군에 비해서 proteoglycan의 소실이 많았다(Fig.
- 이에 본 연구에서는 국내산 서양종 꿀벌(Apis mellifera)에서 분리, 정제한 봉독이 papain으로 유도된 골관절염 동물모델의 치료 약물로서의 가능성을 탐색하고자 한다. 이를 위하여 마우스의 우측 무릎관절에 단백분해물질인 papain을 투여하여 골관절염을 유도 시킨 후, 봉독을 투여하고 연골 변성, 염증 형성, 골증식체 형성 정도 등의 변화를 관찰하여 봉독의 골관절염에서의 생리작용을 조사하고자 하였다.
- 이에 본 연구에서는 봉독이 papain으로 유도된 골관절염 동물모델에서 치료 약물로서의 가능성을 조직학적 관점으로 탐색 하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
제안 방법
- 1 mg/kg로 주 2회 복강 내로 투여하였다.18) 실험에 사용된 meloxicam(Sigma, St Louis, USA)은 존대를 사용하여 주 2회 경구 투여하였다. 각 실험군은 실험 시작 일부터 0, 7, 21, 42일에 경추 탈골 시켜 우측 무릎관절을 적출하여 실험하였다.
- 19) 본 연구에서는 골관절염 동물 모델을 확립하기 위하여 papain을 슬개골 인대를 통과해 우측 무릎관절에 투여하였다. Papain이 마우스 무릎관절에 미치는 영향을 확인하기 위하여 papain 주사 주입 전과 주입 후 7, 21, 42일째 마우스의 우측 무릎관절을 적출하여 H&E 염색을 실시하였다.
- 9) 따라서 본 연구에서는 papain으로 유도된 골관절염에 봉독이 미치는 영향을 확인하기 위하여 골관절염 유발 42일째 실험 종료 후, 각 실험군의 무릎관절 H&E 염색을 실시하여 조직학적으로 관찰하였다.
- Papain 용액은 투여 전 0.2 µm syringe filter에 통과시켜 박테리아를 제거하였으며, Papain 주입 후, 봉독을 0.1 mg/kg로 주 2회 복강 내로 투여하였다.
- Papain이 마우스 무릎관절에 미치는 영향을 확인하기 위하여 papain 주사 주입 전과 주입 후 7, 21, 42일째 마우스의 우측 무릎관절을 적출하여 H&E 염색을 실시하였다.
- 18) 실험에 사용된 meloxicam(Sigma, St Louis, USA)은 존대를 사용하여 주 2회 경구 투여하였다. 각 실험군은 실험 시작 일부터 0, 7, 21, 42일에 경추 탈골 시켜 우측 무릎관절을 적출하여 실험하였다.
- 골관절염 유발은 papain (type IV, double crystallized, 15 units/mg, Sigma, St Louis, USA)의 농도가 1.0% (w/v)가 되도록 조정하며 papain이 활성화되도록 0.03 M L-cystein HCl (Sigma, St Louis, USA)을 보충한 다음 슬개골 인대를 통과하여 우측 무릎관절에 이 용액 6 µl를 투여하였다.
- 실험 종료 후, 병리조직학적 관찰을 위해 무릎관절을 채취하였다. 무릎관절은 적출 즉시 10% 포르말린에 고정 하였고, 10% formic acid로 24시간 간격으로 72시간 동안 용액을 교환하여 탈회를 실시하였다. 파라핀 포매기(Leica EG116)에 포매하여 마이크로톰(Leica 820)으로 4 µm두께의 절편을 제작한 다음 부유온수조와 신전기 과정을 거쳐 슬라이드에 부착시켰다.
- 박절한 조직 절편은 탈 파라핀 과정을 거쳐 H&E 염색을 한 다음 1% HCl, 70% A/C 용액에 3-5회 담근 후, 다시 흐르는 수돗물에 수세하고 1% 암모니아수에 5-10회 담그어 핵을 청화 시킨 다음 탈수 및 투명 과정을 거친 후 봉입하였다.
- 실험 종료 후, 병리조직학적 관찰을 위해 무릎관절을 채취하였다. 무릎관절은 적출 즉시 10% 포르말린에 고정 하였고, 10% formic acid로 24시간 간격으로 72시간 동안 용액을 교환하여 탈회를 실시하였다.
- 실험군 사이의 염증성 침윤 정도를 평가하기 위해 H&E 염색을 실시하여 광학현미경으로 관찰하였다.
- 실험동물은 10주령 수컷 C57BL/6 마우스를 샘타코 BIO KOREA(오산, 대한민국)로부터 제공 받아 7일간 순화 및 사육을 거쳐 건강한 동물만을 실험에 이용하였다. 실험용 마우스는 난괴법에 따라 총 5마리씩 정상군(Normal control, NC), papain으로 유도된 골관절염 유발군(papain induced OA), 골관절염 유발과 봉독 투여군(OA treated with PBV), 골관절염 유발과 meloxicam 투여군(OA treated with meloxicam as positive control)으로 나누어 군별로 cage에 분리시키고 사료와 물을 자유롭게 섭취하도록 하였다.
- 이에 본 연구에서는 국내산 서양종 꿀벌(Apis mellifera)에서 분리, 정제한 봉독이 papain으로 유도된 골관절염 동물모델의 치료 약물로서의 가능성을 탐색하고자 한다. 이를 위하여 마우스의 우측 무릎관절에 단백분해물질인 papain을 투여하여 골관절염을 유도 시킨 후, 봉독을 투여하고 연골 변성, 염증 형성, 골증식체 형성 정도 등의 변화를 관찰하여 봉독의 골관절염에서의 생리작용을 조사하고자 하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 봉독은 농촌진흥청의 국립농업과학원에서 사육 중인 서양종 꿀벌(Apis mellifera)로부터 봉독 채집장치(청진테크, 안산, 대한민국)를 이용하여 봉독을 분리하였고, 불순물을 제거하여 순수 정제 봉독(purified bee venom)을 취하였다. 취한 봉독 추출물은 -20℃에서 보관하고, 투여 직전 멸균 수에 용해시킨 후 필요한 농도로 희석하여 사용하였다.
- 실험동물은 10주령 수컷 C57BL/6 마우스를 샘타코 BIO KOREA(오산, 대한민국)로부터 제공 받아 7일간 순화 및 사육을 거쳐 건강한 동물만을 실험에 이용하였다. 실험용 마우스는 난괴법에 따라 총 5마리씩 정상군(Normal control, NC), papain으로 유도된 골관절염 유발군(papain induced OA), 골관절염 유발과 봉독 투여군(OA treated with PBV), 골관절염 유발과 meloxicam 투여군(OA treated with meloxicam as positive control)으로 나누어 군별로 cage에 분리시키고 사료와 물을 자유롭게 섭취하도록 하였다.
이론/모형
- 실험군 사이의 세포외 기질 변화를 관찰하기 위하여, 기질인 당단백의 sulfur기에 반응하는 원리를 이용한 Safranin O-fast green 염색법을 실시하였다. 박절한 조직 절편은 탈 파라핀과 함수 처리 과정을 거친 후 Weigert iron hematoxylin (HT10232, Sigma, St Louis, USA) 용액에 3분간 반응시킨 후 흐르는 수돗물에 5분간 수세하고, 0.
성능/효과
- 1. Papain을 마우스의 우측 무릎관절에 투여하여 관찰한 결과 골관절염이 유도되는 것을 확인하였으며 특히, papain 주사 42일째에서 연골의 변성이 심한 것을 확인하였다.
- 1) 봉독은 꿀벌의 독낭에 들어 있는 약 40여 가지의 유효성분으로 구성된 복합체로 크게 enzyme, peptides, non-peptides, physiological active amine 성분 등으로 구성되어 있으며 다양한 생리화학적 활성을 가진다.2) 건조 봉독의 약 50%를 차지하는 peptide는 melittin, apamin, mast cell degranulating peptide 등의 성분이 있으며, peptide 성분 중 주성분인 melittin은 용혈작용 및 항염작용이 있는 것으로 알려져 있고, apamin은 건조 봉독의 2~3%를 차지하며 melittin과 같이 항염작용을 한다고 알려져 있다.3-5)
- 2. 골관절염이 유발된 마우스에 봉독을 복강 주사로 투여하였을 때, 관절연골의 파괴와 골 침식 등 연골의 변성이 정상군과 유사한 것을 보아 봉독이 골관절염에 치료 효과가 있음을 H&E 염색을 통하여 관찰하였다.
- 3. 골관절염이 유발된 마우스의 무릎관절에서 proteoglycan의 소실이 많은 것을 관찰할 수 있었고, 봉독을 처리한 군에서의 proteoglycan 소실이 감소함을 병리조직학적 실험 기법을 통해 확인하 였다.
- 9) 따라서 본 연구에서는 papain으로 유도된 골관절염에 봉독이 미치는 영향을 확인하기 위하여 골관절염 유발 42일째 실험 종료 후, 각 실험군의 무릎관절 H&E 염색을 실시하여 조직학적으로 관찰하였다. 그 결과 papain 주입 42일째인 골관절염 유발군의 무릎관절에서는 관절연골의 파괴와 골 침식 및 염증세포의 침윤 등 기타 염증의 소견을 관찰 할 수 있었으며, 봉독 투여 군에서의 연골은 골 침식 등의 연골의 변성이 정상군과 유사한 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 2). 이에 본 연구에서의 봉독은 papain으로 유도된 골관절염을 완화시키는데 효과가 있는 것으로 사료된다.
- 3C). 따라서 본 연구에서의 봉독은 papain으로 유도된 골관절염에 proteoglycan의 소실을 줄임으로써 골관절염을 완화시키는데 효과가 있는 것으로 사료된다.
- 이와 같은 결과는 papain을 마우스의 무릎관절에 투여하였을 경우 골관절염을 유도하는 것을 확인할 수 있었고, 봉독이 골관절염 완화에 효과가 있는 것을 병리학적 검사로 관찰할 수 있었다. 본 연구의 결과를 바탕으로 봉독은 papain으로 유도된 골관절염에서 연골의 변성을 줄이고 proteoglycan의 소실을 줄이는 등 골관절염 치료에 효과가 뛰어난 것으로 사료된다.
- 3A, B). 봉독 투여 군에서는 정상군과 유사하게 연골의 손상이 회복 되었으며 proteoglycan의 소실이 줄어들었음을 확인할 수 있었다(Fig. 3C). 따라서 본 연구에서의 봉독은 papain으로 유도된 골관절염에 proteoglycan의 소실을 줄임으로써 골관절염을 완화시키는데 효과가 있는 것으로 사료된다.
- 본 연구에서는 봉독이 papain으로 유도된 골관절염 마우스에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 골관절염 유발 42일째 실험 종료 후 마우스의 우측 무릎관절을 적출하여 safranin Ofast green 염색을 실시하여 proteoglycan의 함유량을 확인하였다. 연골의 침습 정도를 관찰한 결과 정상군의 관절연골은 적색으로 전 층이 염색되어 proteoglycan 함유량이 풍부한 상태로 관찰되었으며, 대조군에서는 관절 연골의 결손이나 미란이 심하고 정상군에 비해서 proteoglycan의 소실이 많았다(Fig. 3A, B). 봉독 투여 군에서는 정상군과 유사하게 연골의 손상이 회복 되었으며 proteoglycan의 소실이 줄어들었음을 확인할 수 있었다(Fig.
- 1D). 이러한 결과를 바탕으로 본 실험에 사용한 papain이 골관절염을 유발하는 것으로 사료된다.
- 2). 이에 본 연구에서의 봉독은 papain으로 유도된 골관절염을 완화시키는데 효과가 있는 것으로 사료된다.
- 이와 같은 결과는 papain을 마우스의 무릎관절에 투여하였을 경우 골관절염을 유도하는 것을 확인할 수 있었고, 봉독이 골관절염 완화에 효과가 있는 것을 병리학적 검사로 관찰할 수 있었다. 본 연구의 결과를 바탕으로 봉독은 papain으로 유도된 골관절염에서 연골의 변성을 줄이고 proteoglycan의 소실을 줄이는 등 골관절염 치료에 효과가 뛰어난 것으로 사료된다.
- 이와 같은 결과는 봉독이 papain으로 유도된 골관절염에서 연골의 변성을 줄이고 염증을 억제함으로써 골관절염 치료에 효과가 뛰어난 것으로 사료된다. 이에 따라 본 연구는 천연물인 봉독이 부작용이 적고 약리효과가 뛰어난 골관절염 치료제 개발에 활용될 수 있을 것으로 사료되며, 향후 봉독의 골관절염 치료에 있어 봉독의 생리활성 성분 규명 등의 연구가 계속되어져야 할 것으로 생각된다.
후속연구
- 17) 이처럼 현재까지 골관절염의 적절한 치료법은 미흡한 수준이며 완치할 수 있는 치료법이 미비하여 과학적으로 검증되지 않은 약물이나 민간요법 등에 의존하는 경우가 많은 실정이다.9) 따라서 이러한 문제를 보완할 수 있는 천연물 유래의 새로운 골관절염 치료제 개발에 대한 연구가 필요하다.
- 이와 같은 결과는 봉독이 papain으로 유도된 골관절염에서 연골의 변성을 줄이고 염증을 억제함으로써 골관절염 치료에 효과가 뛰어난 것으로 사료된다. 이에 따라 본 연구는 천연물인 봉독이 부작용이 적고 약리효과가 뛰어난 골관절염 치료제 개발에 활용될 수 있을 것으로 사료되며, 향후 봉독의 골관절염 치료에 있어 봉독의 생리활성 성분 규명 등의 연구가 계속되어져야 할 것으로 생각된다.
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