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제안 방법
- 따라서 본 연구에서는 전통적으로 항염제로 사용되어온 황련 추출물의 위궤양에 대한 효과를 염산/에탄올로 유발된 마우스 위궤양 모델을 이용하여 rebamipide(30 mg/kg) 및 ranitidine(100 mg/kg)과 비교·평가하였다.
- Berberine은 알칼로이드(alkaloid) 성분으로서 주요 병균에 대한 항균작용10), 항염증11), 항암12), 장운동억제13) 및 지혈작용8) 등이 있는 것으로 알려져 있으나 현재까지 황련 추출물 자체에 대한 항궤양 효과를 에탄올로 유발된 실험적 위궤양 모델에서 평가한 보고는 찾아볼 수 없다. 따라서 본 연구에서는 황련물 추출물의 항궤양 효과를 염산/에탄올로 유발된 마우스 위궤양 모델을 이용하여 항산화 효과와 함께 평가하였고, 그 효과를 대표적인 궤양 치료제인 rebamipide (30mg/kg) 및 ranitidine(100 mg/kg)과 비교하였다.
- 모든 실험동물의 체중을 약물 투여 시작 1일 전, 투여 시작일 및 최종 희생일에 각각 측정하였으며, 사료섭취에 따른 체중 변화를 최소화하기 위해 약물 투여시작일에 모든 실험동물은 18시간 절식시켰으며, 궤양 유발시에는 24시간 절식을 실시하였다. 또한 실험 시작시의 개체 차이에 의한 체중 변화를 최소화하기 위해 7일간의 약물 투여기간 동안의 체중 변화량인 증체량(body weight gain)을 산출하였다.
- SOD 1 unit는 1분 동안 NBT의 환원을 50% 억제하는 농도로 정의하여, U/g protein 단위로 측정하였다. 또한 위점막 nitric oxide 함량은 Griess reagent를 사용하여 total nitrate/nitrite 함량으로 측정 하였다20). 즉, 준비된 위점막 homogenate를 4℃에서 11,000×g으로 15분간 원심분리하고, 상층액을 Griess reagent (0.
- 의 방법에 따라 98%에 탄올에 150 mM의 염산(Merck, CA, USA)이 포함된 염산/에타놀 혼합액을 경구투여하여 위궤양을 유발하였다. 모든 실험동물은 염산/에타놀 혼합액 투여 전 24시간 절식을 실시하였다.
- 모든 실험동물의 체중을 약물 투여 시작 1일 전, 투여 시작일 및 최종 희생일에 각각 측정하였으며, 사료섭취에 따른 체중 변화를 최소화하기 위해 약물 투여시작일에 모든 실험동물은 18시간 절식시켰으며, 궤양 유발시에는 24시간 절식을 실시하였다. 또한 실험 시작시의 개체 차이에 의한 체중 변화를 최소화하기 위해 7일간의 약물 투여기간 동안의 체중 변화량인 증체량(body weight gain)을 산출하였다.
- 을 투여 용량으로 설정하였다. 모든 약물은 멸균증류수에 용해시켜, 10 ml/kg의 용량으로 존데(zonde)가 부착된 주사기를 이용하여 매일 1회씩 위궤양 유발 전 7일 동안 강제 경구 투여하였다. 한편 정상 및 궤양 대조군에서는 동일한 용량의 멸균 증류수만을 동일한 기간 동안 동일한 방법으로 투여하였다.
- . 본 연구에서는 전통적으로 항염증 약물로 사용되어온 황련 물 추출물의 항궤양 효과를 염산/에탄올로 유발된 마우스 위궤양 모델을 이용하여 항산화 효과와 함께 평가하였고, 그 효과를 대표적인 궤양치료제인 rebamipide (30 mg/kg) 및 ranitidine (100 mg/kg)과 비교하였다.
- 2% thiobarbituric acid (Sigma, MO, USA)를 첨가하고 98℃ 조건하에서 30분간 가온 하였다. 상온에서 냉각시킨 다음 532 nm에서 흡광도를 측정하여, 1,1,3,3-tetramethoxypropane (Sigma, MO, USA)를 이용하여 작성한 standard curve와 비교하여, malondialdehyde (MDA) nM/g tissue 단위로 측정하였다. 또한 catalase 활성 역시 이전의 방법16)에 따라, catalase 활성을 pH 7.
- 실험동물은 군당 8마리씩 7그룹 – 정상 대조군, 궤양 대조군, rebamipide, ranitidine 및 3용량 (500, 250 및 125 mg/kg)의 황련 추출물 투여군으로 구분하여 실험을 실시하였다.
- 위 육안 병소의 측정: Oyagi 등14) 및 Morais 등15)의 방법에 따라, 염산/에타놀 혼합액 투여 1시간 후 모든 실험동물은 경추탈골로 희생하여, 위를 적출한 다음, 대만부를 절개하여 펼치고 10% neutral buffered formalin에 24시간 고정한 다음, 투명한 grid (area: 1mm2)를 점막에 겹쳐, 출혈성 위점막 병소의 총 면적을 mm2단위로 각각 측정하였다.
- 이후 Hematoxylin & eosin (H&E) 염색을 실시하고, 광학현미경 하에서 관찰하였다.
- 즉, 준비된 위점막 homogenate를 4℃에서 11,000×g으로 15분간 원심분리하고, 상층액을 Griess reagent (0.1% N-(1-naphthyl) ethylenediamide dihydrochloride, 1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid; all Sigma, MO, USA)와 혼합한 10분 후 540 nm 흡광도를 측정하고, sodium nitrite의 standard curve와 비교하여 nitrate/nitrite μM/g protein 단위로 측정하였다.
- 최종 희생일에 일부 위 분문 조직을 적출한 다음 세로로 절단하고, 10% 중성포르말린에 18시간 이상 고정시킨 후, 탈수를 거쳐 파라핀 포매 후 4 μm의 절편을 제작하였다.
- 한편 위점막의 손상, 부종 및 충혈과 같은 조직 변성소견을 기초하여, 4단계의 등급 즉, 0: 정상, 1: sligt – 점막 표면 손상, 2: moderate – 점막 중증도 손상 및 부종, 3: severe – 점막 전체 손상으로 구분하여, semiquantative scoring을 실시하였다.
- 모든 약물은 멸균증류수에 용해시켜, 10 ml/kg의 용량으로 존데(zonde)가 부착된 주사기를 이용하여 매일 1회씩 위궤양 유발 전 7일 동안 강제 경구 투여하였다. 한편 정상 및 궤양 대조군에서는 동일한 용량의 멸균 증류수만을 동일한 기간 동안 동일한 방법으로 투여하였다.
대상 데이터
- 56 마리의 수컷 ICR 마우스 (6-wk old upon receipt, SLC, Japan)를 7일간의 순화과정을 거쳐 실험에 사용하였으며, 순화과정 및 실험 전 기간 동안 온도 (20-25℃)와 습도 (30-35%)가 조절된 사육실에서 polycarbonate 사육상자에 4마리씩 수용하여 사육하였고, 명암 주기 (light : dark cycle)는 12시간 주기로 조절하였으며, 사료(Samyang, Korea)와 음수는 자유롭게 공급하였으며, 모든 실험동물은 picric acid를 이용하여 개체를 식별하였다. 실험동물은 군당 8마리씩 7그룹 – 정상 대조군, 궤양 대조군, rebamipide, ranitidine 및 3용량 (500, 250 및 125 mg/kg)의 황련 추출물 투여군으로 구분하여 실험을 실시하였다.
- Rebamipide hydrate 및 ranitidine hydrochloride는 Sigma-Aldrich (MO, USA)에서 구입하여 사용하였으며, 각각 확실한 궤양 치료 효과를 나타내는 용량으로 알려진 30mg/kg14) 및 100 mg/kg6)을 투여 용량으로 설정하였다. 모든 약물은 멸균증류수에 용해시켜, 10 ml/kg의 용량으로 존데(zonde)가 부착된 주사기를 이용하여 매일 1회씩 위궤양 유발 전 7일 동안 강제 경구 투여하였다.
- 선정된 황련 200 mg을 취하여 정제수 200 ml로 가열 추출한 후 (60℃, 3시간, 3번), 흡인 여과한 여과액을 rotary vacuum evaporator (Rotavapor R144; Büchi Labortechnik AG, Switzerland)로 감압·농축하여, 점조성의 추출물을 얻은 다음 programmable freeze dryer (Freezone 1; Labconco Corp., MO, USA)를 사용하여, 동결 건조시켜 총 38.82 g (수율 19.41%)의 연갈색의 물 추출물을 얻어 실험에 사용하였다.
- 중국산 황련을 지련역 약업사(옴니허브, Korea)를 통해 구입·정선하여, 대구한의대학교 본초학교실에서 감정한 후 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 모든 수치는 평균 ± 표준편차로 표시하였으며, 다중비교검증을 이용하여 통계처리를 실시하였고, 분산동질성을 Levene test를 실시하여 검증하였다. 등분산일 경우, one way ANOVA test를 실시한 다음 least-significant differences (LSD) test로 사후 검증을 실시하여 군간의 유의성을 측정하였다. 비등분산일 경우에는 비모수 검증인 Kruskal- Wallis H test를 실시하여 유의성이 인정된 경우에는, Mann-Whitney U test를 실시하여 군간의 유의성을 검증하였다.
- 모든 수치는 평균 ± 표준편차로 표시하였으며, 다중비교검증을 이용하여 통계처리를 실시하였고, 분산동질성을 Levene test를 실시하여 검증하였다.
- 등분산일 경우, one way ANOVA test를 실시한 다음 least-significant differences (LSD) test로 사후 검증을 실시하여 군간의 유의성을 측정하였다. 비등분산일 경우에는 비모수 검증인 Kruskal- Wallis H test를 실시하여 유의성이 인정된 경우에는, Mann-Whitney U test를 실시하여 군간의 유의성을 검증하였다. 모든 통계처리는 SPSS for Windows (Release 14.
이론/모형
- Morais 등15)의 방법에 따라, 위 점막을 분리하여 얼음으로 냉각(ice-cold) 한 10 mL의 KCl (100 g/L; pH 7.4; Sigma, MO, USA) 용액에서 homogenize하여 사용하였다. 이후 단백질 함량은 Lowry16)의 방법으로 bovine serum albumin을 standard로 이용하여 측정하였으며, 지질 과산화 정도 (lipid peroxidation)는 Agar17) 등의 방법으로 측정하였다.
- 또한 catalase 활성 역시 이전의 방법16)에 따라, catalase 활성을 pH 7.0, 온도 25℃하에서 1nM의 H2O2를 분당 분해하는데 필요한 효소의 양으로 정의하고, mM/min/g tissue 단위로 평가하였고, superoxide dismutase(SOD) 활성은 Beauchamp와 Fridovich19)의 방법에 따라, 100nM EDTA (Sigma, MO, USA) 및 13 mM l-methionine (Sigma, MO, USA), 750 μM nitroblue tetrazolium chloride (NBT; Sigma, MO, USA) 및 2 μM riboflavin (Sigma, MO, USA)이 포함된 50mM potassium phosphate buffer (pH 7.8)에 homogenize 하여 반응시키고, 4℃ 조건하에서 10분간 3,600rpm으로 원심분리 한 15분 후 560 nm에서 흡광도를 측정하여 평가하였다.
- 또한 이전의 Ku 등22)의 방법에 준하여, 위점막 손상의 침습율[(손상 점막의 두께/전체 위점막 두께) ×10 , %]과 궤양 병소부위 주변의 평균 점막 두께를 각각 CCD image analyzer (DMI-300, DMI, Korea)를 이용하여 측정하였다.
- 4; Sigma, MO, USA) 용액에서 homogenize하여 사용하였다. 이후 단백질 함량은 Lowry16)의 방법으로 bovine serum albumin을 standard로 이용하여 측정하였으며, 지질 과산화 정도 (lipid peroxidation)는 Agar17) 등의 방법으로 측정하였다. 즉, 준비한 250 μl의 homogenate를 water bath에 37℃ 60분간 유지하면서, 35% perchloric acid(Sigma, MO, USA)를 첨가하고 14,000rpm으로 10분간 원심분리한 다음 상층액을 취하여 1.
- 최종 약물투여 1시간 후, Oyagi 등14)의 방법에 따라 98%에 탄올에 150 mM의 염산(Merck, CA, USA)이 포함된 염산/에타놀 혼합액을 경구투여하여 위궤양을 유발하였다. 모든 실험동물은 염산/에타놀 혼합액 투여 전 24시간 절식을 실시하였다.
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