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문제 정의
- 하지만 잎과 가지의 경우에는 채취가 용이할 뿐만 아니라 수목의 생장에도 상대적으로 적은 영향을 미치게 된다. 따라서 본 연구에서는 산벚나무의 잎과 가지 추출물과 산벚나무 수피 부위의 외층인 순수 수피층 (이하 수피)과 내층인 코르크층 추출물에 대한 항산화활성, 항균활성, tyrosinase 저해활성 등의 기초 활성을 비교하여 잎과 가지 부위의 이용 가능성을 살펴보고자 하였다.
제안 방법
- 페놀성 화합물 중 특히 여러 가지 기능성을 나타내는 것으로 알려진 flavonoid 함량을 알아보기 위해 Moreno 등(2000)의 방법을 변형하여 다음과 같이 측정하였다. 1 ㎎/㎖ 농도로 methanol에 용해시킨 시료액 100 ㎕와 10% aluminium nitrate 20 ㎕, 1 M potassium acetate 20 ㎕, methanol 860 ㎕를 차례로 혼합하여 40분간 반응시킨 후 415 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 rutin 0~500 ㎍/㎖의 농도로 제조하여 표준 검량선을 작성하고 총 flavonoid 함량을 ㎎/g으로 나타내었다.
- Nitric oxide (NO) 소거능은 Marcocci 등 (1994)의 방법을 변형하여 다음과 같이 측정하였다. 10 mM sodium nitroferricyanide (III) dihydrate 50 ㎕와 증류수에 일정농도로 용해시킨 시료액 30 ㎕를 혼합한 후 25℃에서 150분 동안 반응시켰다.
- 7 세포를 96well plate에 1×104 cells/well의 농도로 분주하여 24시간 배양하여 부착 및 안정화 시킨 후, 농도별로 희석한 시료를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. PBS에 5 ㎎/㎖의 농도로 용해시켜 제조한 MTT용액을 각 well에 10 ㎕씩 가하고, 37℃, 5% CO2 조건에서 4시간 동안 반응시켜 MTT가 환원되도록 하였다. 배지를 제거한 후, 각 well에 100 ㎕의 DMSO를 첨가하여 생성된 formazan 결정을 용해시켜 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 시료액 대신 PBS를 사용한 blank의 흡광도를 기준으로 세포 생존율 산출하였다.
- 각 시료를 methanol에 0.1~5.0 ㎎/㎖ 의 다양한 농도로 용해시킨 시료액 20 ㎕ 와 200 µM로 용해시킨 DPPH 용액 180 ㎕를 혼합하여 15분간 암실에서 반응시킨 후 microplate reader (BIO-TEK, USA)를 사용하여 517 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- 본 실험에 사용된 산벚나무 (Prunus sargentii) 잎, 가지, 수피, 코르크층 시료는 2011년 6월 전라남도 나주시의 야산에 자생하는 산벚나무에서 분리한 것으로 수세 후 40에서 건조시킨 후 4℃ 이하로 냉장보관하면서 실험에 사용하였다. 건조된 산벚나무 잎, 가지, 수피, 코르크층 시료를 각각 blender를 사용하여 마쇄한 후 75% ethanol을 추출 용매로 하여 80℃에서 2시간씩 3회 반복하여 환류추출을 실시하였다. 추출액은 여과와 농축 및 동결건조를 실시하여 분말화하였으며, 4℃ 이하로 냉장보관하면서 실험에 사용하였다.
- 1% N-(naphtyl)ethylenediamine dihydrochloride (in 60% acetic acid) 60 ㎕를 혼합하여 30분 간 실온에서 반응시킨 후 520 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로 ascorbic acid를 사용하였으며, 시료액 대신 증류수를 사용한 대조군의 결과를 기준으로 소거능을 계산하였다.
- PBS에 5 ㎎/㎖의 농도로 용해시켜 제조한 MTT용액을 각 well에 10 ㎕씩 가하고, 37℃, 5% CO2 조건에서 4시간 동안 반응시켜 MTT가 환원되도록 하였다. 배지를 제거한 후, 각 well에 100 ㎕의 DMSO를 첨가하여 생성된 formazan 결정을 용해시켜 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였으며, 시료액 대신 PBS를 사용한 blank의 흡광도를 기준으로 세포 생존율 산출하였다.
- 산벚나무 부위별 추출물의 항산화활성을 비교하기 위해 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)을 사용하여 radical 소거능을 측정하였다 (Blois, 1958). 각 시료를 methanol에 0.
- 0 ㎎/㎖ 의 다양한 농도로 용해시킨 시료액 20 ㎕ 와 200 µM로 용해시킨 DPPH 용액 180 ㎕를 혼합하여 15분간 암실에서 반응시킨 후 microplate reader (BIO-TEK, USA)를 사용하여 517 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도를 바탕으로 50%의 DPPH radical을 소거하는데 필요한 농도 (SC50)를 계산하였다. Positive control로 ascorbic acid를 사용하였다.
- 페놀성 화합물 중 특히 여러 가지 기능성을 나타내는 것으로 알려진 flavonoid 함량을 알아보기 위해 Moreno 등(2000)의 방법을 변형하여 다음과 같이 측정하였다. 1 ㎎/㎖ 농도로 methanol에 용해시킨 시료액 100 ㎕와 10% aluminium nitrate 20 ㎕, 1 M potassium acetate 20 ㎕, methanol 860 ㎕를 차례로 혼합하여 40분간 반응시킨 후 415 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- 1 ㎎/㎖ 농도로 methanol에 용해시킨 시료액 100 ㎕와 10% aluminium nitrate 20 ㎕, 1 M potassium acetate 20 ㎕, methanol 860 ㎕를 차례로 혼합하여 40분간 반응시킨 후 415 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 rutin 0~500 ㎍/㎖의 농도로 제조하여 표준 검량선을 작성하고 총 flavonoid 함량을 ㎎/g으로 나타내었다.
- 항균활성 실험에 사용된 미생물 균주인 Staphylococcus epidermidis (KCTC1917)와 Staphylococcus aureus (KCTC3881)는 한국생명공학연구원 생물자원센터 (BRC)에서 분양 받은 것을 사용하였다. 항균시험용 평판배지는 계대 배양된 각 균주 배양액을 100 ㎕씩 분주한 후 멸균 면봉을 이용하여 도말하여 준비하였고, 시료를 disc당 0.5, 1.0, 5.0 ㎎이 되도록 직경 6 ㎜의 paper disc에 천천히 흡수시킨 뒤 건조과정을 거쳐 용매를 휘발시킨 후 평판배지 위에 밀착시킨 상태로 37℃에서 24시간 배양한 후 disc를 중심으로 생성된 저해환 (clear zone, ㎜)을 측정하여 항균활성을 비교하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 산벚나무 (Prunus sargentii) 잎, 가지, 수피, 코르크층 시료는 2011년 6월 전라남도 나주시의 야산에 자생하는 산벚나무에서 분리한 것으로 수세 후 40에서 건조시킨 후 4℃ 이하로 냉장보관하면서 실험에 사용하였다. 건조된 산벚나무 잎, 가지, 수피, 코르크층 시료를 각각 blender를 사용하여 마쇄한 후 75% ethanol을 추출 용매로 하여 80℃에서 2시간씩 3회 반복하여 환류추출을 실시하였다.
- 세포독성 시험에 사용된 동물세포주인 Raw 264.7은 한국생명공학연구원 생물자원센터 (BRC)에서 분양 받은 것을 사용하였으며, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, WelGENE, Korea) 배지에 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin을 혼합한 배지를 사용하였다.
- 산벚나무 부위별 추출물의 항균활성을 비교하기 위하여 각 균주를 대상으로 disc diffusion assay로 측정하였다. 항균활성 실험에 사용된 미생물 균주인 Staphylococcus epidermidis (KCTC1917)와 Staphylococcus aureus (KCTC3881)는 한국생명공학연구원 생물자원센터 (BRC)에서 분양 받은 것을 사용하였다. 항균시험용 평판배지는 계대 배양된 각 균주 배양액을 100 ㎕씩 분주한 후 멸균 면봉을 이용하여 도말하여 준비하였고, 시료를 disc당 0.
데이터처리
- 각 군 간의 측정치 비교는 one-way analysis of variance (ANOVA)를 시행하였으며, 유의성은 신뢰구간 p < 0.05에서 의미를 부여하였다.
- 모든 측정값은 3회 이상 반복 실험한 결과의 평균값과 표준편차 (mean±SD)로 표시하였고, 각 실험군 간의 통계학적 분석은 windows용 SPSS 12.0 (SPSS Inc, Chicago, USA)을 이용하였다.
이론/모형
- Folin-Denis법을 이용하여 산벚나무 부위별 추출물의 polyphenol 함량을 측정하였다 (Otto and Denis, 1912). Methanol에 1 ㎎/㎖ 농도로 용해시킨 시료액 80 ㎕와 FolinDenis reagent 80 ㎕를 혼합하여 3분간 반응시킨 뒤 10% Na2CO3 80 ㎕를 혼합하여 1시간 동안 암실에서 반응시킨 후, 상등액 120 ㎕를 취하여 96well plate에 옮겨 700 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- Tyrosinase의 작용 결과 생성되는 DOPA chrome을 비색법에 의해 측정하는 방법으로 tyrosinase 저해 활성을 측정하였다 (Jung et al., 1995). 0.
- 산벚나무 부위별 추출물들의 세포독성은 MTT assay 방법에 의해 측정하였다 (Shin et al., 2003). 세포독성 시험에 사용된 동물세포주인 Raw 264.
- 산벚나무 부위별 추출물의 항균활성을 비교하기 위하여 각 균주를 대상으로 disc diffusion assay로 측정하였다. 항균활성 실험에 사용된 미생물 균주인 Staphylococcus epidermidis (KCTC1917)와 Staphylococcus aureus (KCTC3881)는 한국생명공학연구원 생물자원센터 (BRC)에서 분양 받은 것을 사용하였다.
성능/효과
- 피부에 침착되는 색소인 melanin 형성에 있어 중요한 단계를 촉진하는 역할을 하는 것으로 알려져 피부 미백과 밀접한 관련이 있는 tyrosinase를 저해하는 활성을 측정한 결과 Table 5에 나타난 바와 같이 잎을 제외한 모든 추출물의 tyrosinase 저해 활성이 positive control로 사용된 arbutin보다 높게 나타났다. 50%의 tyrosinase를 저해할 때 필요한 농도인 IC50에서 가지와 수피, 그리고 코르크층 추출물이 각각 206.20 ㎍/㎖, 231.05 ㎍/㎖, 204.75㎍/㎖을 나타냄으로써 positive control로 사용된 arbutin의 393.92 ㎍/㎖보다도 높은 저해활성을 보였다. 벚나무 잎과 수피의 tyrosinase 저해 활성에 관한 연구는 있었으나 (An et al.
- 항균활성 비교를 위하여 disc diffusion assay를 활용한 실험 결과를 Table 4에 나타내었다. S. aureus에 대한 항균 활성 결과에서 positive control로 사용된 streptomycin 보다 낮은 활성이기는 하였으나 수피와 가지 부위 추출물의 항균 활성이 상대적으로 강하게 나타났다. S.
- 산벚나무 부위별 추출물의 NO 소거능을 측정한 결과에서 50%의 nitric oxide를 소거하는데 필요한 시료의 농도를 산출한 SC50 값을 Table 3에 나타내었다. 가지 추출물의 SC50값이 49.19 ㎍/㎖로 가장 높은 활성을 보였으며, 가장 낮은 활성을 보여준 수피 추출물의 경우 145.11 ㎍/㎖의 SC50을 나타내었다. Positive control로 사용된 ascorbic acid의 활성과 비교한 relative activity에서 가지와 잎, 코르크층, 그리고 수피 추출물의 NO 소거능이 모두 ascorbic acid보다 높은 것으로 나타나 항염증 활성 등 관련된 분야의 활성에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단되었다.
- 추출액은 여과와 농축 및 동결건조를 실시하여 분말화하였으며, 4℃ 이하로 냉장보관하면서 실험에 사용하였다. 각 부위별 시료의 추출 수율은 잎, 가지, 수피 및 코르크층이 각각 26.77%, 9.40%, 7.68%, 12.92%로 나타났다.
- 55%의 세포생존율을 나타냄으로써 독성을 나타낼 가능성은 낮은 것으로 확인되었다. 그러나 잎 추출물의 경우 10 ㎍/㎖ 와 100 ㎍/㎖농도에서 각각 61.83%와 44.68%의 세포생존율을 나타냄으로써 관련된 연구를 진행할 때 세포독성을 감안한 적정 농도의 선정이 필요할 것으로 판단되었다.
- 산벚나무의 부위별 75% EtOH 추출물의 polyphenol과 flavonoid 함량을 측정한 결과를 Table 1에 제시하였다. 산벚나무 가지 추출물 중 polyphenol 함량이 277.92 ㎎/g으로 가장 높은 함량을 보여주었으며, 코르크층 추출물이 249.72 ㎎/g로 가지 추출물 다음으로 높은 함량을 나타났다. Flavonoid 함량의 경우에는 잎 추출물이 52.
- 산벚나무 부위별 추출물의 기초적인 생리활성을 비교한 결과, 기존에 약재로서 이용되어 온 부위인 화피에 해당하는 수피와 코르크층 추출물과 비교하여 새롭게 연구된 가지 추출물의 경우 높은 polyphenol 함량을 바탕으로 DPPH radical 소거능, NO 소거능, 항균 활성, 그리고 미백 기능성과 관련된 tyrosinase 저해 활성 등에서 우수한 활성을 가지는 것으로 나타남에 따라 수목의 생장에 영향을 최소화하면서도 생리활성을 가지는 원료로서의 이용가능성이 높음을 확인하였다. 잎 추출물의 경우 상대적으로 높은 flavonoid 함량과 높은 수준의 NO 소거 활성을 보여줌으로써 항염증 활성을 기대할 수 있었으나 기타의 활성에서는 실험 실시된 다른 부위에 비해 낮은 활성을 보였으며, 특히 세포독성의 가능성이 확인됨에 따라 적절한 농도의 설정이 필요할 것으로 판단되었다.
- 55 ㎍/㎖ 로 나타났다. 이와 같은 SC50 수치는 positive control로 사용된 ascorbic acid의 SC50 값을 기준으로 비교한 relative activity에 나타난 바와 같이 코르크층과 가지 추출물이 각각 99.96%와 88.88%로 ascorbic acid와 유사한 수준의 항산화 활성을 보여주었다. 이와 같은 결과에서 Table 1에 제시한 바와 같이 상대적으로 높은 polyphenol 함량을 나타내었던 가지와 코르크층 추출물이 항산화 활성도 높음을 확인할 수 있는데, 이는 기존의 연구들에서 제시한 것과 마찬가지로 DPPH radical 소거능과 같은 항산화 활성이 polyphenol 화합물의 함량과 밀접한 연관관계가 있음을 나타낸 것이라고 판단되었다 (Oh et al.
- 1에 나타내었다. 잎 추출물을 제외한 모든 추출물이 실험이 실시된 농도에서 88.71~126.55%의 세포생존율을 나타냄으로써 독성을 나타낼 가능성은 낮은 것으로 확인되었다. 그러나 잎 추출물의 경우 10 ㎍/㎖ 와 100 ㎍/㎖농도에서 각각 61.
- 산벚나무 부위별 추출물의 기초적인 생리활성을 비교한 결과, 기존에 약재로서 이용되어 온 부위인 화피에 해당하는 수피와 코르크층 추출물과 비교하여 새롭게 연구된 가지 추출물의 경우 높은 polyphenol 함량을 바탕으로 DPPH radical 소거능, NO 소거능, 항균 활성, 그리고 미백 기능성과 관련된 tyrosinase 저해 활성 등에서 우수한 활성을 가지는 것으로 나타남에 따라 수목의 생장에 영향을 최소화하면서도 생리활성을 가지는 원료로서의 이용가능성이 높음을 확인하였다. 잎 추출물의 경우 상대적으로 높은 flavonoid 함량과 높은 수준의 NO 소거 활성을 보여줌으로써 항염증 활성을 기대할 수 있었으나 기타의 활성에서는 실험 실시된 다른 부위에 비해 낮은 활성을 보였으며, 특히 세포독성의 가능성이 확인됨에 따라 적절한 농도의 설정이 필요할 것으로 판단되었다.
- 을 산출하여 Table 2에 나타내었다. 코르크층과 가지 부위 추출물의 SC50 값이 각각 26.79 ㎍/㎖와 30.13 ㎍/㎖로 다른 부위에 비해 높은 활성을 나타났으며, 가장 활성이 낮은 잎 추출물의 경우에 49.55 ㎍/㎖ 로 나타났다. 이와 같은 SC50 수치는 positive control로 사용된 ascorbic acid의 SC50 값을 기준으로 비교한 relative activity에 나타난 바와 같이 코르크층과 가지 추출물이 각각 99.
후속연구
- Positive control로 사용된 ascorbic acid의 활성과 비교한 relative activity에서 가지와 잎, 코르크층, 그리고 수피 추출물의 NO 소거능이 모두 ascorbic acid보다 높은 것으로 나타나 항염증 활성 등 관련된 분야의 활성에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단되었다.
- epidermidis에 대해서도 동일하게 수피와 가지 추출물이 높은 활성을 나타냈는데 특히 수피 추출물의 경우, streptomycin과 비교해서 크게 뒤지지 않는 활성을 보여주었다. 이와 같은 결과는 추가적인 분획이나 분리의 과정을 거친다면 산벚나무 수피나 가지에서 높은 항균력을 가지는 소재의 발견이 가능할 것을 나타내는 것이라고 판단된다.
- , 2008b; Park, 2011), 활성물질의 규명이나 미백활성에 대한 작용기전에 대한 연구는 미미한 실정이다. 활성이 높은 부위를 대상으로 활성물질 분리 및 규명, 작용기전에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단되었다.
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