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문제 정의
- , 2010). 본 연구는 매 년 동해안 연안에 출몰하는 독성 해파리 및 식용불가능 해파리들을 농업 자원으로 개발하여 해파리로 인한 어민들과 기타 산업의 피해를 줄임과 동시에 친환경 농업 자원으로 활용함을 목적으로 한다.
- 본 연구에서는 이러한 배경을 바탕으로 해파리의 성분, 보습력을 이용하여 해파리를 토양에 사용할 수 있는 자원으로 개발하고자 한다. 상토 또는 토양에 다양한 자재를 혼합 하는 연구가 활발하기에 해파리 역시 상토와 관련된 자원으로 개발할 수 있을 것이다 (Lee et al.
제안 방법
- (PCR) 추출된 DNA를 Template로 하여 Bacteria의 16S rRNA sequence에 기반한 universal primer를 이용하여 PCR을 수행하였다. Primer는 GC-clamp (5'-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GTC CCG CCG CCC CCG CCC G-3')가 5' end에 부착된 341f (5'-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3')와 907r (5'-CCG TCA ATT CCT TTG AGT TT-3')을 사용하였다 (Muyzer et al.
- DGGE는 일반적으로 수행하는 방법들을 참고하여 알려진 수행법대로 진행하였다 (Muyzer, 1999). DGGE를 수행하기 위해 Denaturant인 Urea (Bio-Rad Laboratories)와 Deionized formaimide (Bio-Rad Laboratories) 의 35-60% gradient로 구성된 6% polyacrylamide gel을 제작하여, DCodeTM Universal Mutation Detection System (Bio-Rad Laboratories)으로 60℃에서 16시간 동안 63 Volt 로 약 1,000 v･h가 되도록 전기영동 하였다 (Von Sigler et al., 2004). 전기영동이 끝난 후 GelStarⓇ Nucleic Acid Gel Stain (Lonza)로 30분간 염색한 후 PCR 결과를 확인할 때 사용한 UV-illuminator를 이용하여 결과를 촬영하였다.
- )를 이용하였다. PCR은 Veriti 96-well Thermal Cycler (Applied Biosystem)으로 초기 94℃에서 8분간 1회 수행 후, 94℃에서 1분, 58℃에서 1분, 72℃에서 1분간 30회반복하였으며 final extension을 위해 72℃에서 10분간 1회 수행하였다. PCR의 결과는 2% agarose gel에 100bp DNA Ladder (Bioneer)와 함께 loading하여, 120 Volt에서 30분간 전기영동 후에 ethidium bromide로 염색하여 UV-illuminator (MultiImageTM Light Cabinet, Alpha Innotech Corporation) 로 확인하였다.
- PCR은 Veriti 96-well Thermal Cycler (Applied Biosystem)으로 초기 94℃에서 8분간 1회 수행 후, 94℃에서 1분, 58℃에서 1분, 72℃에서 1분간 30회반복하였으며 final extension을 위해 72℃에서 10분간 1회 수행하였다. PCR의 결과는 2% agarose gel에 100bp DNA Ladder (Bioneer)와 함께 loading하여, 120 Volt에서 30분간 전기영동 후에 ethidium bromide로 염색하여 UV-illuminator (MultiImageTM Light Cabinet, Alpha Innotech Corporation) 로 확인하였다.
- 각 실험군의 미생물 군집에 변화가 있었는지 확인 하기 위해서 Bacterial genomic DNA를 i-genomic Soil DNA Extraction Mini Kit (iNtRON Biotechnology, Inc.)를 이용 하여 추출하였다. 추출된 DNA는 Spectrophotermeter (Optizen POP, Mecasys)를 이용하여 정량하였다.
- 각 실험군은 자연광으로, 24℃에서 재배 하였다. 각 화분의 수분 유지기간이 얼마나 연장될 수 있는지 확인하기 위해 수분이 고갈될 때까지 추가적인 물을 급여하지 않았으며, 화분 내에 유지되는 수분 함량을 측정기 (Moisture Sensor, Mirae Sensor, co.)로 측정하였다 (Moon et al., 2011). 부추의 생장은 토양으로부터 줄기의 길이를 초기 기록하여 가장 긴 잎의 엽장을 측정하고, 줄기로부터 잎이 돋는 시점부터 엽수를 기록 하였다.
- 고형화되어 유통되는 해파리의 경우 고농도의 소금으로 염장되어 있기에 염분을 완전히 제거하기 위해 수돗물을 지속적으로 교체해주면서 24시간 가량 침지하여 염분을 제거 하였다. 건조된 원료들은 동결건조법을 이용하여 잔여 수분을 제거하고 파쇄하여 분말로 제작하였다.
- 건조된 해파리 분말의 수분 흡착률을 측정하기 위해 적절한 양의 해파리 분말의무게를 측정한 뒤, Distilled Water (DW)에 Overnight으로 침지하였다. 침지 후 Damping paper를 이용하여 흐르는 물기들을 제거한 후 무게를 정량하고 다음의 식을 이용하여 수분 흡착률을 계산하였다.
- 해양에서 직접 획득한 해파리의 양이 부족하여 일부 시중에서 유통되는 해파리를 추가하여 원료를 충족하였다. 고형화되어 유통되는 해파리의 경우 고농도의 소금으로 염장되어 있기에 염분을 완전히 제거하기 위해 수돗물을 지속적으로 교체해주면서 24시간 가량 침지하여 염분을 제거 하였다. 건조된 원료들은 동결건조법을 이용하여 잔여 수분을 제거하고 파쇄하여 분말로 제작하였다.
- 실험군은 포장으로부터 덜어낸 원예 상토를 그대로 사용한 그룹 (Bed soil, BS)과 상토와 해파리 분말을 섞은 혼합 상토 (Mixed bed soil, MBS)의 두 실험군으로 설정하고, 각 실험군은 세 개의 화분으로 삼 반복 실험으로 진행하였다. 부추를 각 화분에 심은 직후, 물을 500 mL씩 각화분에 급여하면서 바닥으로 빠져나가는 것을 확인하여 수분이 화분 내에 포화가 되도록 하였다. 각 실험군은 자연광으로, 24℃에서 재배 하였다.
- , 2011). 부추의 생장은 토양으로부터 줄기의 길이를 초기 기록하여 가장 긴 잎의 엽장을 측정하고, 줄기로부터 잎이 돋는 시점부터 엽수를 기록 하였다.
- aurita)를 획득 하였다. 시중에 유통되는 해파리의 처리과정으로부터 실험방법을 자체적으로 설계하여, 포획한 해파리들은 물로 세척한 후 0.5-1%의 Potassium Alum (PA)용액에 5-8시간 가량 1차 침지하고, 세척 및 염분을 제거한 뒤 1-2% 농도의 PA용액에 6-12시간 가량 침지하였다. 마지막 침지는 세척 후에 0.
- 작물로는 성장이 빠른 부추를 이용하였으며, 수확을 하여 잎이 모두 제거된 모종을 이용 하였다. 실험군은 포장으로부터 덜어낸 원예 상토를 그대로 사용한 그룹 (Bed soil, BS)과 상토와 해파리 분말을 섞은 혼합 상토 (Mixed bed soil, MBS)의 두 실험군으로 설정하고, 각 실험군은 세 개의 화분으로 삼 반복 실험으로 진행하였다. 부추를 각 화분에 심은 직후, 물을 500 mL씩 각화분에 급여하면서 바닥으로 빠져나가는 것을 확인하여 수분이 화분 내에 포화가 되도록 하였다.
- , 2004). 전기영동이 끝난 후 GelStarⓇ Nucleic Acid Gel Stain (Lonza)로 30분간 염색한 후 PCR 결과를 확인할 때 사용한 UV-illuminator를 이용하여 결과를 촬영하였다. 촬영된 결과를 토대로 나타난 Band들을 잘라내어 70% ethanol 로 2회 세척하고 Deionized Distilled Water (DDW)로 최종 세척한 후, QIAEXⓇII Gel Extraction Kit (QIAGEN)으로 각 Band들의 DNA를 얻어내었다.
- 전기영동이 끝난 후 GelStarⓇ Nucleic Acid Gel Stain (Lonza)로 30분간 염색한 후 PCR 결과를 확인할 때 사용한 UV-illuminator를 이용하여 결과를 촬영하였다. 촬영된 결과를 토대로 나타난 Band들을 잘라내어 70% ethanol 로 2회 세척하고 Deionized Distilled Water (DDW)로 최종 세척한 후, QIAEXⓇII Gel Extraction Kit (QIAGEN)으로 각 Band들의 DNA를 얻어내었다. 염기서열 분석을 위해 각 Band들로부터 얻어낸 DNA들은 전과 동일한 PCR 방법으로 하되 forward primer는 GC-Clamp가 연결되지 않은 341f primer를 이용하여 증폭하였다.
- )를 이용 하여 추출하였다. 추출된 DNA는 Spectrophotermeter (Optizen POP, Mecasys)를 이용하여 정량하였다.
- 건조된 해파리 분말의 수분 흡착률을 측정하기 위해 적절한 양의 해파리 분말의무게를 측정한 뒤, Distilled Water (DW)에 Overnight으로 침지하였다. 침지 후 Damping paper를 이용하여 흐르는 물기들을 제거한 후 무게를 정량하고 다음의 식을 이용하여 수분 흡착률을 계산하였다.
- 5% 농도의 PA용액에 6-12시간 가량 침지하고 고형화 정도를 확인 후 상온에서 건조 하였다. 해양에서 직접 획득한 해파리의 양이 부족하여 일부 시중에서 유통되는 해파리를 추가하여 원료를 충족하였다. 고형화되어 유통되는 해파리의 경우 고농도의 소금으로 염장되어 있기에 염분을 완전히 제거하기 위해 수돗물을 지속적으로 교체해주면서 24시간 가량 침지하여 염분을 제거 하였다.
대상 데이터
- 2011년 7월 하순경에 포항 영일만의 멸치 어장에서 식용으로 사용되지 않는 커튼원양 해파리 (Dactylometra quinquecirrha)와 보름달 물 해파리 (A. aurita)를 획득 하였다. 시중에 유통되는 해파리의 처리과정으로부터 실험방법을 자체적으로 설계하여, 포획한 해파리들은 물로 세척한 후 0.
- Primer는 GC-clamp (5'-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GTC CCG CCG CCC CCG CCC G-3')가 5' end에 부착된 341f (5'-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3')와 907r (5'-CCG TCA ATT CCT TTG AGT TT-3')을 사용하였다 (Muyzer et al., 1993).
- 제작된 해파리 분말과 원예 상토를 1:9의 비율로 섞어 화분에 최종 중량이 300 g씩 되도록 담았다. 이 때 사용한 상토는 모두 같은 포장 내의 원예 상토를 사용하였다. 작물로는 성장이 빠른 부추를 이용하였으며, 수확을 하여 잎이 모두 제거된 모종을 이용 하였다.
- , 1993). 효소는 TaKaRa Ex TaqTM (TAKARA BIO, Inc.)를 이용하였다. PCR은 Veriti 96-well Thermal Cycler (Applied Biosystem)으로 초기 94℃에서 8분간 1회 수행 후, 94℃에서 1분, 58℃에서 1분, 72℃에서 1분간 30회반복하였으며 final extension을 위해 72℃에서 10분간 1회 수행하였다.
이론/모형
- )에 염기서열 Sequencing을 요청하였다. 결과를 수령 후 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) tool을 이용하여 염기서열에 해당하는 균을 동정하였다 (Altschul et al., 1997).
성능/효과
- DGGE band의 염기서열을 분석하여 본 결과 BS와 MBS 간에 중복되는 종은 없었다. 속으로는 Flavobacterium과 Microbacterium 속의 균들만이 소수 공유되었다 (Table 1).
- DGGE의 패턴은 결과에서 볼 수있듯이, 동일한 포장의 상토를 이용하였음에도 불구하고 MBS가 BS에 비해 band들의 위치가 대부분 변한 것을 확인할 수 있다 (Fig. 4). 조건이 같은 각 실험군 내의 화분들은 서로간에 패턴이 비슷하거나 동일하며, 대부분의 band들을 같은 위치에 공유하고 있음을 볼 수 있다.
- 염기서열 분석을 위해 각 Band들로부터 얻어낸 DNA들은 전과 동일한 PCR 방법으로 하되 forward primer는 GC-Clamp가 연결되지 않은 341f primer를 이용하여 증폭하였다. PCR의 결과는 2% agarose gel 상에서 이전과 동일한 방법으로 확인하였다.
- , 2010). Sphingobacteriia 내의 모든 종이 식물의 성장을 촉진한다 단언할 수는 없지만, 본 연구에서 BS에는 나타나지 않았던 Sphingobacteriia 가 MBS에서 Sphingobacterium anhuiense, S. multivorum, S. siyangense, S. thalpophilum의 4종이 나타난 것은 해파리 분말의 성분에 의해 Sphingobacteriia에 속하는 균들이 더욱 선호하는 환경으로 바뀌었다고 가정할 수 있다. Sphingobacterium들은 다양한 식물 종의 뿌리에 서식하는 것으로 보고된 바 있으며 토양환경 및 식물뿌리 주변 (Rhizosphere)에 밀접한 부류라고 할 수 있다 (Haichar et al.
- 5). 결과적으로 이는 해파리 분말내의 성분 및 생화학적 특성으로 인해 Bacteroidetes에 속하는 균들이 선호하는 환경이 되었다고볼 수 있다. 또한, Bacteroidetes 중에서도 Sphingobacteriia 의 균들이 가장 많이 증가하였음을 볼 수 있다.
- 3a). 모든 잎을 잘라낸 초기 줄기의 길이가 평균적으로 두 실험군 모두 약 5~6 cm였던 것을 감안하면 5주째에 나타나는 차이는 확연한 성장률의 차이라고 볼수 있다. 엽수의 경우, 증가률은 크게 다르지 않다.
- 속으로는 Flavobacterium과 Microbacterium 속의 균들만이 소수 공유되었다 (Table 1). 미생물들의 군집 변화를 살펴보기 위해 문, 강의 분류로 분석해본 결과, BS에서는 Proteobacteria가 MBS에서 Bacteroidetes 가 가장 많이 검출되었다 (Table 2, Fig. 5). 결과적으로 이는 해파리 분말내의 성분 및 생화학적 특성으로 인해 Bacteroidetes에 속하는 균들이 선호하는 환경이 되었다고볼 수 있다.
- 또한, Bacteroidetes 중에서도 Sphingobacteriia 의 균들이 가장 많이 증가하였음을 볼 수 있다. 반대로 Proteobacteria 군집의 경우 해파리 분말에 의해 그 다양성이 줄어들었는데, Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria 가 사라졌고 ㅊ만으로 구성된 것을 확인하였다.
- 수분 함량 측정에서 MBS실험군이 실험 초기부터 높은 수분 함량을 나타내는데, 이는 해파리 분말의 수분 흡착률에서 기인한 것으로 생각된다. 실험 종료인 5주째에 이르러서는 BS실험군은 수분이 0.77%로 거의 모두 고갈된 것에 비해, MBS는 10.87%의 수분을 유지하는 것을 볼 때에 상토의 수분 유지력 및 기간이 향상되었다고 볼 수 있다. 이러한 향상된 수분 유지능력은 건조한 시기에 작물의 수분공급 및 유지에 도움이 될 것으로 생각된다.
- 실험결과를 요약하자면 해파리 분말을 상토에 섞음으로써, Bacteroidetes에 포함되는 균들이 50% 이상을 차지하며 우점군이 되었다고 할 수 있다.
- 1b, c). 아무런 공정을 거치지 않은 해파리 원료로부터 고형화 및 동결건조를 할 경우 결과물의 양이 상당히 줄어드는 것을 확인하였다. 이는 해파리 성분의 약 95%는 수분이기 때문에 실질적으로 남는 고체성분이 적은 것으로 생각된다 (Hsieh et al.
- 요약하자면, 본 실험을 통해 해파리의 잠재적인 자원력및 고부가 가치화의 가능성은 충분히 나타났다고 생각한다. 이것이 가지는 의미는 식용으로 사용되는 해파리는 제한적이며 독성 해파리들은 거의 사용되지 않기 때문에, 산업적 측면에서 가용성 자원이 늘어난다는 것이다.
- , 2006). 이러한 결과들은 본 연구의 DGGE를 통한 실험에서도 비슷한 결과가 도출되었 는데, 이는 해파리 분말이 수분을 유지해주는 능력 이외에도 미생물 군집을 변화에 큰 영향을 끼치는 것을 나타낸다. 덧붙여, Sphingobacteriia를 포함하여 Bacteroidetes의 중요성은 다양한 단백질, 다당류 등을 분해하는 고분자 분해효소를 많이 생성하기에 식물과의 공생관계에 있어 매우 중요한 역할을 하는 것으로 생각되며, 결과적으로 해파리 분말을 상토에 혼합하는 것은 추가적인 균 접종 없이 공생관계에 있는 균들을 rhizosphere의 우점종으로 유도 할 수 있는 방안이 될 수 있다 (Johansen and Binnerup, 2002; Green et al.
- 해파리 분말 혼합 상토를 이용한 부추 재배 수분이 포화된 상태에서부터 5주째에 이르기까지 BS실험군에 비해 해파리 분말이 혼합된 MBS실험군이 두드러지게 높은 양의 수분을 유지하는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 2a). Electrical conductivity (EC)의 경우 MBS가 BS에 비해 다소 높은 수치를 보였다 (Fig.
- 해파리 분말의 성상 주 원료인 해파리의 고유색에 따라 분말화된 결과물의 색도 짙은 갈색으로부터 옅은 노란색에 이르기까지 다양한 색으로 나타나는 것을 확인하였다 (Fig. 1b, c). 아무런 공정을 거치지 않은 해파리 원료로부터 고형화 및 동결건조를 할 경우 결과물의 양이 상당히 줄어드는 것을 확인하였다.
후속연구
- 또한 환경개선적 측면에서, 독성 해파리률 포함한 해파리들은 여름철 (약 7~8월경)에 해수의 온도 상승과 관련하여 개체수가 급증하여 각 종 어장과 해수욕장에 피해를 주게 된다. 그렇기에 고부가 가치화가 이루어진다면 해파리의 출몰 시기와 이동경로를 예측하여 독성 및 식용불가 해파리들을 사전에 어획함으로써 해양관련 산업에 피해를 줄이고 어민들의 어획종이 늘어남과 동시에 해파리를 이용한 상품을 개발하는 데에 필요한 원자재 확보에도 도움이 될 것이라 생각한다.
- , 2008). 또한, 해파리에서 추출된 AA들은 사람을 포함한 여러 동물에서도 항스트레스 효과를 나타내는 것으로 알려져 보습제, 건강보조식품이나 기능성 사료로서의 활용가치가 높을 것으로 전망 된다.
- 기후와 해양환경은 인위적으로 쉽게 변화시킬 수가 없고, 어자원은 기후와 해양환경 변화에 크게 영향을 받기 때문에 이미 변화하고 있는 환경의 변화에 맞추어 피해를 막을 수있는 연구가 필요하다. 마찬가지로 살아있는 해파리를 서식 또는 이동하지 못하도록 제어할 수 없기에, 활용도가 낮다고여겼던 독성 및 불용 해파리들을 자원화함으로써 피해를 막음과 동시에 새로운 부가가치 창출을 이룰 수 있을 것이다.
- 차기 실험을 통해 Potassium alum이 EC의 증가에 얼마나 영향을 주는 것인지를 확인해야 할 것이다. 만약 이 가정이 옳을 경우에는 Potassium alum을 사용하지 않고 해파리를 고형화 할 수 있는 방안을 모색해야 할 것이다. 여기에 대해, 현재 국내에 등록된 특허 중 ‘연속식 해파리 수분 분리장치’가 가장 이에 근접한 방법인 것으로 생각된다 (Lim et al.
- 87%의 수분을 유지하는 것을 볼 때에 상토의 수분 유지력 및 기간이 향상되었다고 볼 수 있다. 이러한 향상된 수분 유지능력은 건조한 시기에 작물의 수분공급 및 유지에 도움이 될 것으로 생각된다.
- 다시 말해, 첫째 주에는 낮은 수치의 EC였으나 시간이 지날수록 높아지는 것은 수분 함량 결과와 대조해 보았을 때, 유지되는 수분에 의해 해파리의 고형화에 사용된 Potassium alum 및 기타 물질들이 이온 형태로 주변환경에 유입되는 것으로 생각된다. 차기 실험을 통해 Potassium alum이 EC의 증가에 얼마나 영향을 주는 것인지를 확인해야 할 것이다. 만약 이 가정이 옳을 경우에는 Potassium alum을 사용하지 않고 해파리를 고형화 할 수 있는 방안을 모색해야 할 것이다.
- 해파리 분말을 추가함으로써 나타나는 화분 내의 수분 흡착력 및 유지력은 일반 상토보다 월등하고 이는 작물을 관리함에 있어 안정성과 건기 또는 단수로 인한 수분고갈을 예방할 수 있을 것으로 생각된다. 미생물의 경우 DGGE pattern과 염기서열 분석을 통해 확연한 군집변화를 유도하였으며, 식물과 공생관계에서 중요한 Bacteroidetes들의 다양성을 증가시키는 효과를 보았다.
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