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문제 정의
- 이와 같이 청국장 복용방법도 다양해짐에 따라 본 연구에서는 β-galactosidase 활성을 갖는 청국장 발효균을 이용하여 우유와 혼합한 청국장을 섭취할 때 발생 가능성이 있는 유당 불내증 현상을 방지하고자 가정에서 제조된 청국장으로부터 β-galactosidase 활성이 우수한 균주를 분리하고 이의 효소반응 특성을 검토하였다.
제안 방법
- β-Galactosidase 활성에 미치는 반응 온도와 pH의 영향을 조사하기 위하여 30~65℃와 pH 5.0~9.0의 범위에서 β-galactosidase 활성을 각각 측정하였다.
- β-Galactosidase에 의한 lactose의 분해산물을 분석하기 위해서는 1.0% lactose와 과량의 효소를 포함한 최적 pH의 반응액을 40℃에서 5시간 반응시킨 후 95℃에서 3분간 열처리하야 원심분리한 다음 상등액을 적정량 취해 chloroform, acetic acid와 증류수[4.3 : 5 : 0.7, (v/v)] 혼합용액을 전개용액으로 하여 silica gel-precoated thin layer plate(Merck Kiesegel, No. 5748)에서 박층 크로마토그래피를 수행하였다.
- 가정에서 제조된 청국장으로부터 lactose를 glucose와 galactose로 가수분해하는 β-galactosidase의 생산균을 분리하였다.
- 따라서 YB-1105의 β-galactosidase 활성에 미치는 당의 영향을 분석하기 위해 1 mM pNP-βGal을 기질로하여 glucose, galactose, xylose, mannose의 첨가농도를 달리하고 효소활성을 측정하였다(Fig. 3).
- 분리균 B. licheniformis YB-1105를 LB 배지에서 하룻밤 배양한 후 배양액을 1%(v/v)가 되도록 동일 성분의 본 배양액에 접종하고 37℃에서 24-26시간 동안 진탕배양 하였다. 배양액을 원심분리하여 얻은 배양상등액을 ammonium sulfate(20~75%)로 처리하고 침전된 단백질을 10 mM 인산 완충용액(pH 6.
- 분리균의 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석하기 위해서 분리균의 총 염색체 DNA를 주형으로 하고, 세균의 16S rRNA 유전자의 보존적 지역의 염기서열 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'(E. coli 16S rRNA 유전자 염기서열 8~27), 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'(E. coli 16S rRNA 유전자 염기서열 1492~1510)을 primer로 사용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하였다.
- 분리균의 형태적 관찰을 위해서는 그람염색과 포자염색을 실시하였으며, 배양균체 현탁액을 API 20E와 API 50 CHB(Biomereux사, France) kits에 제조사의 지침을 따라 접종하고 37℃에서 배양하면서 1일과 2일째 각각 관찰하여 탄수화물 이용능과 생화학적 특성을 판별하였다. 분리균의 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석하기 위해서 분리균의 총 염색체 DNA를 주형으로 하고, 세균의 16S rRNA 유전자의 보존적 지역의 염기서열 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'(E.
- 분리균이 생산하는 균체내 효소와 균체외 효소의 반응특성을 비교하기 위해 배양상등액과 균체파쇄상등액으로 각각 제조한 조효소액의 β-galactosidase 활성에 미치는 반응온도와 반응 pH의 영향을 조사하였다.
- coli 16S rRNA 유전자 염기서열 1492~1510)을 primer로 사용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하였다. 증폭된 PCR 산물을 정제하여 ABI PRISM BigDye terminator cycle sequencing kit와 373A automatic DNA sequencer(Perkin Elmer Co., USA)를 사용하여 염기서열을 결정하고 이를 NCBI database와 비교하였다.
- 청국장을 적정량의 생리식염수에 현탁하고 적당량을 취하여 LB 평판배지(yeast extract, 5 g; tryptone, 10 g; NaCl, 5 g; agar, 15 g; water, 1 liter)에 도말한 후 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 형성된 콜로니 중에서 서로 다른 모양을 보이는 콜로니를 채취하여 1 mM p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (pNP-βGal)을 포함한 20 mM sodium phosphate 완충용액(pH 7.
- 형성된 콜로니 중에서 서로 다른 모양을 보이는 콜로니를 채취하여 1 mM p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (pNP-βGal)을 포함한 20 mM sodium phosphate 완충용액(pH 7.0)에 현탁한 후 37℃에서 1시간 동안 방치한 후 반응액의 색깔을 관찰함으로써 β-galactosidase 활성을 갖는 균을 탐색하였다.
성능/효과
- B. licheniformis YB-1105를 LB 액상배지에 접종하여 37℃에서 약 24시간 배양 후 pNP-βGal을 기질로 하여 배양 상등액과 균체파쇄상등액에 존재하는 β-galactosidase활성을 조사한 결과 배양액 부피기준으로 30 mU/mL과 450 mU/mL로 각각 나타나, 분리균이 생산하는 β-galactosidase는 대부분이 균체내에 존재하며 소량의 활성이 균체외에서 관찰되었다.
- B. licheniformis YB-1105의 배양상등 액과 균체파쇄액에서 모두 β-galactosidase 활성이 관찰되었 으며 이들은 모두 pH 6.5와 50℃의 반응조건에서 para-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside의 가수분해 활성이 최대로 나타났다.
- B. stearothermophilus[8], B. circulans[20]와 B. coagulans[2]는 3종 이상의 β-galactosidase isozyme을 생산하는데, 온천에서 분리된 B.coagulans RCS3의 isozyme III은 다른 isozyme과는 달리 균체외로 분비되며 lactose 분해능이 우수한 것으로 확인되었다.
- Glucose와 mannose가 고농도로 존재할 때는 pNP-βGal의 가수분해능이 저해되는 현상이 두 종류 조효소액에서 모두 동일하게 관찰되었으나, xylose에 의해서는 균체파쇄상등액의 효소활성은 약하게 저해되는데 반해 배양상등액의 효소활성은 200 mM 이하의 xylose가 존재할 경우 효소활성이 약하게 증가되었다.
- pNP-βGal 대신 lactose를 기질로 하여 분해능을 조사하기 위해 반응산물을 박층크로마토그래피로 분석한 결과 두 조효소액 모두 lactose를 분해하여 glucose와 galactose가 생성되는 것이 확인되었으나, lactose의 분해능은 낮아 분해반응 후에도 반응액에 상당량의 lactose가 분해되지 않은 상태로 존재하였다.
- 가정에서 제조된 청국장을 14점 수집하여 생리식염수로 희석하고 LB 한천 배지에 도말한 후 37℃에서 하룻밤 배양한 결과 각 시료당 콜로니의 모양이 다른 것으로 보이는 균주가 3~8씩 분리되었다. 분리균 중 β-galactosidase 활성을 갖는 균을 탐색하기 위해 콜로니를 채취하여 pNP-β-Gal의 분해능을 관찰한 결과 대부분 미약한 활성을 보였고 활성이 높은 한 균주를 얻어 YB-1105로 명명하였다.
- 균체파쇄상등 액의 β-galactosidase 활성은 pH 6.0에서 사용된 완충용액의 종류에 따라 큰 차이를 보이지 않았으나, 배양상등액의 효소활성은 인산완충 용액에서는 구연산 완충용액에 비해 그 활성이 크게 낮은 것으로 나타났다.
- 분리균이 생산하는 균체내 효소와 균체외 효소의 반응특성을 비교하기 위해 배양상등액과 균체파쇄상등액으로 각각 제조한 조효소액의 β-galactosidase 활성에 미치는 반응온도와 반응 pH의 영향을 조사하였다. 그 결과 Fig. 1에 보인바와 같이 두가지 조효소액에서 최적 반응 pH는 6.5로 나타났지만, pH 6.0에서 효소활성에 차이를 보였다. 균체파쇄상등 액의 β-galactosidase 활성은 pH 6.
- 7과 45℃에서 최대활성을 갖는 것으로 알려졌다[21]. 그리고 분리균 효소의 최적 반응온도는 B. coagulans RCS3, B. megaterium 2-37-4-1과 B. stearothermophilus 의 효소에 비해 낮았다.
- 따라서 분리균 YB-1105가 생산하는 β-galactosidase는 65℃에서 반감기가 2시간인 B. coagulans RCS3[3]와 50시간인 B. stearothermophilus 유래 효소[5]에 비해 열안정성이 낮은 것으로 확인되었다.
- 또한 분리균은 arginine dehydrolase, gelatinase, oxidase와 nitrate 환원 활성을 보였으며, lysine decarboxylase, ornithine decarboxylase, urease, tryptophane deaminase 등의 활성과 citrate 이용능력이 없고 acetoin, indole과 황화수소를 생성하지 못하였다. 또한 분리균의 16S rRNA 유전자를 PCR로 증폭한 후 1,430 bp 크기의 염기서열(Genbank accession No. JQ292848)을 결정하였으며, 이를 미국 NCBI의 BLAST 검색방법을 사용하여 기존에 등록된 세균들의 상응하는 염기서열과 비교한 결과, 우유로 끓인 죽이나 분유에서 분리된 B. licheniformis 균주들의 염기서열(FJ641025, HQ850703)과 동일하였다. 따라서 분리균 YB-1105는 형태적, 생화학적 특성 및 16S rDNA 서열로 볼 때 B.
- 반응온도에 따른 효소활성을 검토하였을 때 최적반응 온도는 50℃로 동일하며 반응온도 30-50℃ 범위에서는 배양 상등액이나 균체파쇄상등액이 유사한 반응활성을 보였으나, 55℃ 이상에서는 균체파쇄상등액에 비해 배양상등액의 효소활성이 급격히 감소하였다(Fig. 1). 이러한 현상은 각 조효소액에 존재하는 효소의 특성 차이로 판단되지만, 균체 파쇄상등액의 단백질 농도가 높아 고온에서 안정성이 유지되어 이로 인한 효소활성이 배양상등액보다 지속적으로 유지된 때문일 수도 있다.
- 분리균 YB-1105는 포자를 형성하는 그람양성 간균이며 API 50 CHB와 20E kit를 사용하여 생화학적 특성을 조사한 결과 B. licheniformis와 유사도가 99.9%로 가장 높게 나타났고 당 이용성 중 sorbitol 이용능만이 차이가 있었으며 분리균은 이를 이용하지 못하였다. 또한 분리균은 arginine dehydrolase, gelatinase, oxidase와 nitrate 환원 활성을 보였으며, lysine decarboxylase, ornithine decarboxylase, urease, tryptophane deaminase 등의 활성과 citrate 이용능력이 없고 acetoin, indole과 황화수소를 생성하지 못하였다.
- 가정에서 제조된 청국장으로부터 lactose를 glucose와 galactose로 가수분해하는 β-galactosidase의 생산균을 분리하였다. 분리균 YB-1105는 형태적 특성, 생화학적 성질 및 16S rRNA 유전자 염기서열에 근거하여 Bacillus licheniformis로 확인되었다. B.
- 분리균 중 β-galactosidase 활성을 갖는 균을 탐색하기 위해 콜로니를 채취하여 pNP-β-Gal의 분해능을 관찰한 결과 대부분 미약한 활성을 보였고 활성이 높은 한 균주를 얻어 YB-1105로 명명하였다.
- 분리균 중 β-galactosidase 활성을 갖는 균을 탐색하기 위해 콜로니를 채취하여 pNP-β-Gal의 분해능을 관찰한 결과 대부분 미약한 활성을 보였고 활성이 높은 한 균주를 얻어 YB-1105로 명명하였다. 분리균의 고분자 물질을 분해능을 조사하기 위해 1% skim milk, 0.2% potato starch, 1% tributyrin과 0.5% carboxymethyl cellulose를 각각 첨가한 평판배지에서 하룻밤 배양하여 분해환을 관찰하였으며 그 결과 분리균은 이들 물질을 모두 분해하여 protease, amylase, esterase와 cellulase 활성을 보였다.
- 열안정성을 비교하기 위해 pH 6.5로 조절된 조효소액을 30-60℃ 범위의 온도에서 1시간 방치한 후 잔존활성을 측정한 결과 균체파쇄상등액에 존재하는 β-galactosidase는 45℃ 이하에서는 안정하였고 50℃에서는 약 35%가 실활되었다.
- 이로써 분리균 YB-1105 유래의 효소는 B. licheniformis DSM 13[11]와 B. subtilis [1]의 β-galactosidase와 동일하게 50℃와 pH 6.5에서 최대 활성을 보이는 것으로 확인되었다.
- 그러나 균체파쇄상등액에 비해 배양상등액의 β-galactosidase 활성은 산성 pH와 고온에서 크게 영향을 받았다. 한편 두 분획의 가수분해 활성은 낮은 농도의 galactose에 의해도 급격하게 저해되었으나, glucose와 mannose는고농도에 의해서는 약하게 저해를 받는 것으로 확인되었다.
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