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문제 정의
- Vascular Endothelial Growth Factor(VEGF)는 새로운 혈관 형성을 촉진하는 역할을 한다. 본 연구에서는 청국장 에탄올추출물(CEE)이 HUVEC (혈관 내피세포) 증식에 미치는 영향을 조사하여 보았다. 청국장 추출물(100, 1000μg/ml)을 HUVEC에 처리했을 때, VEGF (10 ng/ml)를 처리한 대조군과 같은 정도로 세포를 증식시켰다.
- , 2004). 본 연구에서는 청국장발효 에탄올추출물이 혈관내피세포 증식에 미치는 영향을 조사하여 보았다. HUVEC, 혈관 내피세포는 많은 질환과 생체조직의 정상적인 생리기능 유지에 밀접한 관련이 되어 있다.
제안 방법
- HUVEC은 20% FBS와 1% Antibiotic-antimyotic, 3 ng/ml bFGF, 5 μg/ml heparin을 첨가한 M-199 배지를 이용하여 0.1% 젤라틴이 코팅된 배양접시와 CO2 배양기에서 배양하였다.
- HUVEC의 이동을 결정하기 위해, 배양한 HUVEC과 collagen 혼합액을 2.5 × 105 cell/10 μl가 되도록 혼합한 후 48 well plate에 각각 2.5 μl씩 점적하였다.
- 그러나, CEE(청국장 에탄올 추출물)의 농도가 높아질수록 세포의 증식과 이동이 10 μg/ml의 경우부터 대조군과 차이가 나타나기 시작하였으며 100, 1000 μg/ml 같은 경우에는 VEGF를 처리한 대조군과 비슷한 양상을 띠며 세포를 증식시켰다(Fig. 2).
- 접종된 대두는 40℃ 배양기에서 48시간 동안 발효시켰다. 발효된 청국장을 동결건조기를 이용하여 완전히 동결건조 한 후 미세하게 분쇄하여 분말 청국장을 제조하였다.
- 1% 젤라틴이 코팅된 배양접시와 CO2 배양기에서 배양하였다. 배양된 HUVEC 또한 계대배양을 실시하였고, 계대배양시에는 역시 PBS를 이용하여 세척해 주었으며 Trypsin-EDTA를 이용하여 부착된 세포를 분리하였다.
- 배양한 세포의 생장 및 대사를 멈추게 하기 위해 배지를 완전히 제거해 주고 1% FBS가 첨가된 M-199로 1회 세척하였다. 세척 후 1% FBS가 첨가된 M-199를 처음과 동량을 넣어주고 6시간 동안 두어 정지시켰다.
- 백태를 B. licheniformis B1 균주를 이용하여 발효시켰다. 상기 균주를 LB 액체배지에 접종하여 37℃에서 12시간 동안 진탕 배양하여 사용하였다.
- 열처리한 청국장 추출물의 HUVEC 증식효과를 결정하기 위해 M-199와 청국장 추출물을 각각 0.002, 0.02, 0.2, 2, 20, 200, 2000 μg/ml가 되도록 순차 희석한 뒤 100℃에서 30분간 가열하였다.
- 수거된 상등액을 거름종이로 걸러낸 후 걸러져 나온 용액을 감압 증류를 이용하여 증류하였다. 증류 후 물질들을 수거하여 다시동결 건조하였다(Fig. 1, Hwang et al., 2012).
- 청국장 추출물 100 mg을 멸균된 증류수 1 ml에 녹인 후 1% FBS가 첨가된 M-199 배지를 이용하여 농도가 각각 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10, 100, 1000 μg/ml이 되도록 순차 희석하였다.
- 2). 청국장 추출물에 존재하는 혈관 생성 촉진인자가 열에 대한 안정성을 가지는지 확인하기 위하여 CEE를 가열한 뒤 HUVEC에 처리하였을 때, 가열된 VEGF는 세포를 증식시키지 못했지만, 가열된 CEE는 세포를 증식시켰다(Fig. 3). 이는 CEE에 존재하는 HUVEC 증식 촉진물질이 단백질보다는 열에 안정성이 있는 peptide임을 시사해 준다.
- 청국장 추출물은 각각 0.1, 1, 10, 100 μg/ml가 되도록 1% FBS-M199 배지와 혼합하여 사용하였다.
- 혈관 생성은 VEGF 등 혈관 생성 유도물질에 의해 시작되어, 혈관을 둘러싼 기저막이 분해되고, 혈관내피세포가 성장, 이동되어 공간적인 배열이 이루어지면서 혈관이 생성된다(Choi and Kim, 2003). 청국장이 혈관내피세포에 주는 영향과 세포의 증식을 확인하기 위하여 청국장 CEE를 처리하여 XTT 분석을 하였다. XTT 시약이 발색하는 450 nm의 파장에서 각각의 시료의 농도를 달리하여 측정한 결과 0.
대상 데이터
- Collagen Type I 90 μl와 10× DMEM 10 μl, 1 N NaOH/ 1× DMEM 2.5 μl를 혼합하여 세포 지지체용의 collagen 혼합액을 제조하였다.
- 시료를 처리한 세포는 CO2 배양기에서 36시간 동안 배양하였다. 대조군으로는 아무 처리도 하지 않은 세포와 VEGF 10 ng/ml를 처리한 세포를 사용하였다.
- 처리한 세포는 CO2 배양기에서 36시간 동안 배양하였다. 대조군으로는 아무 처리를 하지 않은 세포와 10 ng/ml VEGF를 처리한 세포를 사용하였다. XTT regent를 M199 배지와 동량으로 섞어준 후 청국장 추출물을 처리하여 배양한 plate에 각 well당 40 μl가 되도록 나누어 주었다.
- 인간 유방암 세포주인 MCF-7과 인간 탯줄 혈관내피세포인 HUVEC을 세포배양에 사용하였다. MCF-7 세포는 10% FBS와 1% Antibiotic-antimycotic을 첨가한 DMEM 배지를 이용하여 CO2 배양기에서 배양하였다.
이론/모형
- 열처리한 청국장추출물을 혈관 내피세포에 처리해도 세포 증식효과는 마찬가지였다. 청국장이 세포 증식뿐 아니라 HUVEC이동에도 영향을 주는지 sprout 분석법으로 확인하였다. 청국장 추출물(100 μg/ml)을 처리했을 때, VEGF (10 ng/ml)와 비슷할 정도로 HUVEC 이동이 일어났다.
- 혈관 생성은 증식뿐 아니라 세포의 이동으로 혈관이 만들어진다. 청국장이 세포의 이동에도 영향을 주는지 sprout 분석법으로 확인하였다(Fig. 4). 36시간 배양된 HUVEC을 관찰한 결과 아무것도 처리하지 않은 세포에서는 세포의 증식과 이동이 거의 일어나지 않은 것을 확인하였다.
성능/효과
- 4). 36시간 배양된 HUVEC을 관찰한 결과 아무것도 처리하지 않은 세포에서는 세포의 증식과 이동이 거의 일어나지 않은 것을 확인하였다. 반면에 VEGF를 처리한 세포에서는 증식과 이동이 활발한 것을 확인하였다.
- 청국장 추출물이 혈관세포의 증식과 이동을 촉진하는 것으로 보아 인체의 허혈성질환 치료에 도움을 줄 수 있을 것을 기대해 본다. 본 연구에서는 청국장 에탄올 추출물이 VEGF와 대등하게, 혈관 내피세포의 증식 및 이동을 촉진시키는 물질을 포함하고 있음을 확인하였다. VEGF와 같은 혈관 재생용 단백질 치료제는 생체 내에서 쉽게 분해되고, 높은 가격으로 인한 경제성 문제가 있다.
후속연구
- 반면에 청국장 추출물에 존재하는 peptide성 혈관세포 증식 촉진물질은 생체 내에서 안전성과 경제성이 있을 것으로 사료된다. 앞으로 청국장 추출물에 존재하는 peptide 중에서 혈관내피세포의 증식과 이동에 직접 영향을 미치는 특정 peptide를 분리, 규명하는 작업이 필요할 것이다.
- 청국장 추출물(100 μg/ml)을 처리했을 때, VEGF (10 ng/ml)와 비슷할 정도로 HUVEC 이동이 일어났다. 청국장 추출물에서 HUVEC 증식과 이동에 영향을 미치는 특정 peptide의 분리가 필요할 것이다.
- 이는 생체 내에서도 청국장 추출물에 의한 혈관의 생성이 가능함을 시사해 준다. 청국장 추출물이 혈관세포의 증식과 이동을 촉진하는 것으로 보아 인체의 허혈성질환 치료에 도움을 줄 수 있을 것을 기대해 본다. 본 연구에서는 청국장 에탄올 추출물이 VEGF와 대등하게, 혈관 내피세포의 증식 및 이동을 촉진시키는 물질을 포함하고 있음을 확인하였다.
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