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문제 정의
- 이 중 대부분은 Candida albicans이고, Candida krusea, Candida tropicalis, Candida glabrata 등이 있다. 본 연구에서는 이들 단세포성 곰팡이의 성장을 저해하는 항진균 물질을 생산하는 지의류 내생 곰팡이를 탐색하고 새로운 천연 항생물질을 찾는 위한 기초실험으로 토대를 마련하기 위하여 지의류 내생 곰팡이의 배양액을 분리하여 유기용매로 추출하고, HPLC (High Performance Liquid Chromatography)를 이용하여 분획하여 항균활성 및 이의 특성을 조사하였다.
제안 방법
- 30℃ incubator에서 24시간 배양 후 투명환의 크기가 큰 지의류 내생 곰팡이 6종을 선별하였고, 배지 조성에 따른 활성도 차이를 비교해보기 위해 선별된 6종을 EMM [potassium hydrogen phthalate 3 g, Na2HPO4 2.2 g, NH4Cl 5 g, glucose 20 g, 225 mg/L supplements (A.A), salts 20 mL (MgCl2 · 6H2O 52.5 g, CaCl2 · 2H2O 0.735 g, KCl 50 g, Na2SO4 2 g), vitamins stock. 1 mL (pantothenic acid 1 g, nicotinic acid 10 g, inositol 10 g, biotin 10 mg), minerals stock. 0.1 mL (boric acid 5 g, MnSO4 4 g, ZnSO4 · 7H2O 4 g, FeCl2 · 6H2O 2 g, molybdic acid 0.4 g, KI 1 g, CuSO4 · 5H2O 0.4 g, citric acid 10 g, agar 18 g)] 배지에서도 동일한 방법으로 실험을 하여 항진균 활성을 검정하였다.
- Disc diffusion method를 이용하여 각 분획과 분리하고 남은 수층을 YPD 고체배지에서 C. albicans에 대한 항진균 활성도를 비교·측정하였다.
- 그 위에 날짜별로 배양한 지의류 내생 곰팡이의 배양액을 paper disc에 500 µL씩 분주하여 충분히 말린 후 올려놓고, 30℃ incubator에서 24시간 배양하여 투명환의 크기를 비교·관찰하였다.
- 그리고 각 peak별 농축액을 5 µL와 20 µL로 다르게 하여 지의류의 화학성분 중 가장 널리 분포하는 노란색 결정의 항생물질인 usnic acid와 비교 · 관찰하였다.
- 그리고 선별된 3종의 지의류 내생 곰팡이의 분획별 농축액인 chloroform 3 µL, ethyl acetate 6 µL씩을 첨가하였다.
- albicans에 대한 항진균 활성도를 비교·측정하였다. 또한 액체배지에서의 항진균 활성을 측정하기 위해 RPMI 1640 (Sigma, USA) 배지를 test tube에 3 mL 넣고, 각각 C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. lusitaniae, Cryptococcus neoformans 균주를 접종하고 30℃ shaking incubator에서 24시간동안 배양하였다. 각 균주의 배양액을 RPMI 배지로 OD600 0.
- 미리 배양한 C. albicans의 배양액(OD600 0.01)을 도말한 YPD 고체배지에 6종의 지의류 내생 곰팡이의 배양일수별 배양액을 얻어 500 µL씩 분주하여 농축된 paper disc를 올려놓고, 30℃ incubator에서 24시간 배양하여 투명환의 크기를 관찰하였다.
- 미리 배양한 C. albicans의 배양액(OD600 0.1)을 YPD 고체배지(500 mL 기준 : Yeast extract 5 g, peptone 10 g, dextrose 10 g, agar 8 g)에 100 µL 분주한 후 멸균된 면봉을 이용하여 도말하였다.
- 지의류 내생 곰팡이가 생성하는 항진균 물질의 활성을 액체배지에서도 알아보기 위해, 선별한 6종의 지의류 내생 곰팡이의 조각을 MY 액체배지 (Yeast extract 3 g, malt extract 3 g, glucose 10 g, peptone 5 g, 멸균증류수 1 L)에 넣고 30℃ shaking incubator에서 날짜별로 배양하여 각각의 배양액을 얻었다.
- 지의류 내생 곰팡이를 배양시킨 MYA배지에 C. albicans의 배양액(OD600 0.1)을 100 µL 분주하여 멸균된 면봉을 이용하여 골고루 도말하였다.
- 최종적으로 6일 동안 배양한 Usnea rigidula (2326)과 4일 동안 배양한 Parmotrema pseudotinctorum (2202)의 chloroform 추출액을 HPLC, C18 column을 이용하여 항진균 물질로 추정되는 peak의 분획물을 얻었다. 미리 배양한 C.
- albicans에 대한 항진균 활성도를 측정한 결과 모두 chloroform 추출물에서 높은 활성이 가장 높았으며, 다음으로 ethyl acetate 추출물이 높은 활성을 나타냈다. 항진균성 물질이 기존에 알려진 물질인지에 대한 정보를 알기위해 6 일 동안 배양한 Usnea rigidula와 4일 동안 배양한 Parmotrema pseudotinctorum의 chloroform 추출액에 대하여 HPLC, C18 column으로 분리하여 Usnea rigidula (2326)의 6일과 Parmotrema pseudotinctorum(2202)의 4일 배양액에서 각각 2 개의 peak 분획물을 얻었다. 각 분획물을 농축한 후 96 well plate를 이용하여 C.
대상 데이터
- 고체배지에서와 액체배지에서 공통적으로 활성이 있는 3종의 지의류 내생 곰팡이를 선별하고, 날짜별 배양액을 chloroform, ethyl acetate 용매 순으로 추출하여 농축하였으며, 증착시킨 후 70% ethanol 1 mL로 녹여 실험에 사용하였다. Disc diffusion method를 이용하여 각 분획과 분리하고 남은 수층을 YPD 고체배지에서 C.
- 순천대학교 지의류생물 소재은행(KOLABIC)에서 100종의 지의류 내생 곰팡이를 분양 받아 C. albicans에 대한 항진균 활성을 조사하였다. 고체배지 및 액체배지에 배양 시 Usnea rigidula, Parmotrema pseudotinctorum 그리고 Myelochroa sp.
- 순천대학교 지의류생물 소재은행(KOLABIC)에서 100종의 지의류 내생 곰팡이를 분양 받아 MYA (Malt Yeast extract Agar: yeast extract 3 g, malt extract 3 g, glucose 10 g, peptone 5 g, agar 15 g)배지에 지의류 내생 곰팡이 조각을 올려 30℃ incubator에서 2~3일 정도 배양하였고, 4℃에 보관하였다. 분양받은 100종 지의류곰팡이의 일련번호는 다음과 같다: EL2081, 2118, 2141, 2146, 2151, 2157, 2170, 2173, 2177, 2202, 2218, 2220, 2228, 2233, 2237, 2245, 2262, 2270, 2277, 2279, 2283-2304, 2306-2320, 2323-2338, 2340-2365, 2373.
- 지의류 내생 곰팡이를 배양한 MYA배지와 EMM배지에 Candida albicans의 배양액(OD600 0.01)을 100 µL 분주·도말하여 배양한 결과 분양받은 100종 중 활성이 좋은 6종의 지의류 내생 곰팡이를 1차적으로 선별하였다(Table 1).
이론/모형
- 선별된 6 종의 지의류 내생 곰팡이의 액체배지에서 생성하는 항진균 물질의 활성을 알아보기 위해 disc diffusion method를 이용하였다. 미리 배양한 C.
성능/효과
- 고체배지에서와 액체배지에서 공통적으로 활성이 높게 나타난 지의류 내생 곰팡이 3종의 배양일수별로 수집하고 chloroform, ethyl acetate 용매 순으로 추출하여 50배 농축시킨 후 70% ethanol로 각각 녹였다. Disc diffusion method를 이용하여 각 추출물에 따른 고체배지(YPD)에서의 Candida albicans의 항진균 활성도를 측정한 결과, 3종 모두 chloroform추출물에서 더 높은 활성도를 보여(Fig. 4 and Table 3), 지의류 내생 곰팡이 추출물의 항균 활성은 추출에 이용되는 용매에 따라 다르다는 것을 알 수 있었다. 또한 추출하고 남은 수층에서는 항균 활성을 거의 볼 수 없었는데, 아마도 지의류 내생 곰팡이의 항진균 활성 물질의 대부분이 비극성 성분으로 구성되었으리라 추정된다.
- 고체배지 및 액체배지에 배양 시 Usnea rigidula, Parmotrema pseudotinctorum 그리고 Myelochroa sp.가 높은 항진균 활성을 나타내는 물질을 생성함을 알 수 있었다.
- 항진균성 물질이 기존에 알려진 물질인지에 대한 정보를 알기위해 6 일 동안 배양한 Usnea rigidula와 4일 동안 배양한 Parmotrema pseudotinctorum의 chloroform 추출액에 대하여 HPLC, C18 column으로 분리하여 Usnea rigidula (2326)의 6일과 Parmotrema pseudotinctorum(2202)의 4일 배양액에서 각각 2 개의 peak 분획물을 얻었다. 각 분획물을 농축한 후 96 well plate를 이용하여 C. albicans와 C. glabrata에 대한 항진균 활성을 실험한 결과, Parmotrema pseudotinctorum의 주요peak는 control에 비해 항진균 활성이 높게 나타났으며 활성물질은 usnic acid계열의 화합물로 추정되었다.
- 01)을 도말한 YPD 고체배지에 6종의 지의류 내생 곰팡이의 배양일수별 배양액을 얻어 500 µL씩 분주하여 농축된 paper disc를 올려놓고, 30℃ incubator에서 24시간 배양하여 투명환의 크기를 관찰하였다. 그 결과 Usnea rigidula(2326)가 C. albicans에 대한 항진균 활성이 가장 좋았으며, 다음으로는 Parmotrema pseudotinctorum (2202), Myelochroa sp. (2292) 순으로 활성이 좋게 나타났다(Fig.
- 또한 C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. lusitaniae, Cryptococcus neoformans 5종의 진균을 96 well plate를 이용하여 액체배지에서의 항진균 활성 조사한 결과 3종의 chloroform, ethyl acetate 추출물 모두 C. albicans와 Cryptococcus neofomans에서 약 96%의 저해율을 보였지만, C. glabrata, C. tropicalis, C. lucitaniae에서는 2202와 2292의 추출물이 2326의 추출물 보다 높은 약 90%의 저해율을 보였다(Fig. 5). 이 결과 3종의 지의류 내생 곰팡이가 생성하는 항진균 활성 물질이 각각 다를 것으로 추정되며, 저해하는 진균의 종도 다른 것을 알 수 있었다.
- 전체적으로 EMM배지에서 지의류 내생 곰팡이의 성장이 MYA배지에서보다 좋지 않은 것으로 보아 환경에 따라 지의류 내생 곰팡이의 성장이 다르다는 것을 알 수 있었다. 또한 MYA배지에서 활성이 좋은 6종의 지의류 내생 곰팡이는 EMM배지에서도 활성이 좋은, 반면에 MYA배지에서 활성이 좋지 않은 종들은 EMM배지에서도 활성이 좋지 않게 나타났다. Parmotrema pseudotinctorum (2202)과 Dirinaria applanata (2312)는 성장이 좋지 않음에도 불구하고 투명환이 크게 형성되었고, 반면에 Ramalina sp.
- 5). 이 결과 3종의 지의류 내생 곰팡이가 생성하는 항진균 활성 물질이 각각 다를 것으로 추정되며, 저해하는 진균의 종도 다른 것을 알 수 있었다.
- 01)을 100 µL 분주·도말하여 배양한 결과 분양받은 100종 중 활성이 좋은 6종의 지의류 내생 곰팡이를 1차적으로 선별하였다(Table 1). 이 결과 고체배지에서 지의류 내생 곰팡이가 활성물질을 생성하여 진균인 C. albicans의 성장을 저해한다는 것을 알 수 있었다. 전체적으로 EMM배지에서 지의류 내생 곰팡이의 성장이 MYA배지에서보다 좋지 않은 것으로 보아 환경에 따라 지의류 내생 곰팡이의 성장이 다르다는 것을 알 수 있었다.
- 3 and Table 2). 이 결과 지의류 내생 곰팡이가 고체배지 뿐만 아니라 액체배지에서도 항진균 활성 물질을 생성함을 알 수 있었다.
- 이들 3종 지의류 내생 곰팡이의 배양액을 chloroform, ethyl acetate 용매 순으로 추출하고 disc diffusion method를 이용하여 각 추출물의 C. albicans에 대한 항진균 활성도를 측정한 결과 모두 chloroform 추출물에서 높은 활성이 가장 높았으며, 다음으로 ethyl acetate 추출물이 높은 활성을 나타냈다. 항진균성 물질이 기존에 알려진 물질인지에 대한 정보를 알기위해 6 일 동안 배양한 Usnea rigidula와 4일 동안 배양한 Parmotrema pseudotinctorum의 chloroform 추출액에 대하여 HPLC, C18 column으로 분리하여 Usnea rigidula (2326)의 6일과 Parmotrema pseudotinctorum(2202)의 4일 배양액에서 각각 2 개의 peak 분획물을 얻었다.
- albicans의 성장을 저해한다는 것을 알 수 있었다. 전체적으로 EMM배지에서 지의류 내생 곰팡이의 성장이 MYA배지에서보다 좋지 않은 것으로 보아 환경에 따라 지의류 내생 곰팡이의 성장이 다르다는 것을 알 수 있었다. 또한 MYA배지에서 활성이 좋은 6종의 지의류 내생 곰팡이는 EMM배지에서도 활성이 좋은, 반면에 MYA배지에서 활성이 좋지 않은 종들은 EMM배지에서도 활성이 좋지 않게 나타났다.
- 주요 peak 분획물을 농축하고 96 well plate를 이용하여 C. albicans와 C. glabrata에 대한 항진균 활성을 검토하기위해 농축액을 20 µL분주 한 경우 control sample (usnic acid 0.01%)에 비해 항진균 활성이 높게 나타난 반면, 5 µL씩 분주한 경우에는 활성이 매우 낮았다(Fig. 6).
- 최종적으로 6일 동안 배양한 Usnea rigidula (2326)과 4일 동안 배양한 Parmotrema pseudotinctorum (2202)의 chloroform 추출액에 대하여 HPLC, C18 column을 이용하여 항진균 물질이 포함되리라 추정되는 peak를 분취하였으며, 그 결과 2326의 6일 배양액과 2202의 4일 배양액에서 각각 2개씩의 peak 분획물을 얻었다. 주요 peak 분획물을 농축하고 96 well plate를 이용하여 C.
- 6). 한편, HPLC 분획물이 나타낸 peak의 머무름시간(retension time)과 HPLC peak 양상으로 보아 C. albicans와 C. glabrata에 대한 항진균 활성을 나타낸 분획물은 지의류의 항생 물질 중 가장 널리 알려진 노란색 결정의 usnic acid 또는 usnic acid계열의 성분을 함유한 것으로 추정되었으며, 항진균 활성을 나타낸 분획물이 비교적 비극성이라는 것을 알 수 있었다(Fig. 7).
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