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문제 정의
- 이번 연구에서는 장 상피세포에서 DSS로 장점막 투과성 증가를 유발시킨 HCT-116 cell의 투과성을 감소시키고 장점막을 보호하는 probiotics의 효과가 장누수 증후군을 비롯한 전신 면역체계를 개선시키는 치료로 응용될 수 있는지 알아보고자 하였다. 또한 장 투과성에 대하여 항염 작용이 우수하다고 알려져 있는 금은화와 발효 금은화의 효과를 살펴보고 유해균과 세포가 접촉되었을 때 장 투과성에 어떠한 변화가 나타나는지 알아보고자 하였다.
- 이러한 장관 투과성 증가상태(increased intestinal permeability)는 이전부터 보완대체의학에서 세운 가설로 알려졌으나 최근 내재면역(innate immunity)분야의 성장발달에 힘입어 분자생물학적인 연구가 꾸준히 진행되면서 증가된 장관 투과성과 여러 질병과의 관계가 증명되고 있다(2). 본 연구는 사람 대장암 세포인 HCT-116 cell을 dextran sodium sulphate(DSS)로 장점막 손상을 유발시킨 후 다양한 조건에서의 장점막 투과성 변화에 대해 알아보고자 하였다.
- 이번 연구에서는 장 상피세포에서 DSS로 장점막 투과성 증가를 유발시킨 HCT-116 cell의 투과성을 감소시키고 장점막을 보호하는 probiotics의 효과가 장누수 증후군을 비롯한 전신 면역체계를 개선시키는 치료로 응용될 수 있는지 알아보고자 하였다. 또한 장 투과성에 대하여 항염 작용이 우수하다고 알려져 있는 금은화와 발효 금은화의 효과를 살펴보고 유해균과 세포가 접촉되었을 때 장 투과성에 어떠한 변화가 나타나는지 알아보고자 하였다.
- 이번 연구에서는 장벽의 투과성을 감소시키고 장 점막을 보호하여 장누수 증후군을 비롯한 전신 면역체계를 개선시키는 치료로 응용될 수 있는 probiotics와 금은화 및 발효 금은화의 효과를 알아보고자 하였다.
제안 방법
- 각 실험은 3개의 well의 값을 측정하여 평균값을 구하였으며 결과는 대조군에 대한 TEER 값의 변화율(%)로 나타내었다. DSS 처리를 하지 않은 배지가 있는 well의 monolayer TEER값을 대조군으로 설정하였다.
- HCT-116 세포에 DSS를 첨가한지 22시간 되는 시점에서 24-well culture insert plate(apical)에 기존 배지를 제거한 후 HRP(peroxide from horseradish type VI-A, Sigma, St. Louis, MO, USA) 60 μL를 첨가하였다.
- Macfarland Scale에 상응하는 흡광도를 측정하여 계산한 유산균의 균수가 109 CFU/10 μL가 되도록 각각의 균주 10 μL를 insert plate에 넣어 HCT-116 세포배양액에 첨가하고 24시간 동안 배양하였다.
- TEER 측정 전극은 사용하기 전에 0점이 되는지 확인하고 전극 끝이 긴 쪽을 각 transwell의 안쪽에 있는 구멍에 넣어 basolateral plate의 media에 잠기게 하였다. 전극의 짧은 쪽은 apical plate의 media에 닿을 정도로만 넣어 세포 단층막을 손상하지 않게 주의하며 TEER값을 측정하였다.
- 세포가 잘 부착되면 장점막 투과성 증가를 유발하기 위하여 3% DSS를 첨가하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 금은화 및 발효 금은화도 동일한 방법으로 HCT-116 세포에 배양되어 DSS를 첨가한 후 다시 배양한 결과로 장 점막 투과성의 변화를 관찰하였다.
- 발효 금은화 추출물은 금은화 추출물을 autoclave하여 121℃에서 15분간 멸균시킨 후 실온에서 충분히 식히고 L. plantarum을 2×107 CFU/mL가 되도록 접종하여 24시간 동안 37℃ incubation에서 발효한 뒤 autoclave하여 121℃에서 15분간 멸균시킨 후 3,000 rpm에서 5분 동안 원심분리 하여 얻은 상층액을 실험에 이용하였다.
- 스타터 배양액은 Lactobacilli MRS agar plate에서 autoclave를 이용하여 121℃에서 15분간 멸균한 액체배지(Lactobacilli MRS broth, Difco, Detroit, MI, USA)에 각각의 균주를 1회 접종한 뒤 최적 조건에서 배양하였다. 유해균은 동일한 방법으로 액체배지(nutrient broth)에 배양하였으며 각각의 균주에 따른 최적의 조건을 적용하였다. L.
- 장 점막 투과성에 대한 유해균의 영향을 확인하기 위하여 DSS만 첨가한 세포와 S. aureus를 단독으로 첨가하여 배양한 세포의 TEER값을 각각 측정하였고, 대조군을 100%로 설정하여 TEER의 변화를 측정하였다. 그 결과는 Fig.
- 장 점막의 투과성을 확인하기 위해 apical plate에 배양된 균주에 DSS를 첨가한 날부터 Millicell-ERS(Millipore, Bedford, MA, USA) 기계를 이용하여 약 2시간, 4시간, 20시간, 22시간째 되는 시점에서 TEER값을 측정하였다. 각 실험은 3개의 well의 값을 측정하여 평균값을 구하였으며 결과는 대조군에 대한 TEER 값의 변화율(%)로 나타내었다.
- 장누수 증후군의 in vitro 모델을 유발하는 방법은 DSS로 궤양성 대장염을 유발한 동물 모델에서 참고하였는데(5), DSS가 막의 상피세포에 유해한 영향을 미쳐 점막의 투과성을 증가시키고 장벽 기능의 손상을 가져와 장관 내 세균과 그들의 산물의 흡수가 증가되어 염증을 유발하는 기전을 바탕으로 실험을 설계하였다(6).
- 장점막 투과성에 대한 유익균의 효과 및 금은화와 발효 금은화의 효과를 확인하기 위하여 HCT-116 세포 점막에서 DSS만 첨가한 세포, L. acidophilus와 L. plantarum, 금은화 및 L. plantarum과 발효시킨 금은화 추출물을 첨가하여 배양한 세포의 TEER값을 각각 측정하였고 TEER이 측정된 매 시간마다 대조군을 100%로 설정하여 TEER의 변화율을 측정하였다. Percentage of control을 다음과 같이 계산하여 Fig.
- TEER 측정 전극은 사용하기 전에 0점이 되는지 확인하고 전극 끝이 긴 쪽을 각 transwell의 안쪽에 있는 구멍에 넣어 basolateral plate의 media에 잠기게 하였다. 전극의 짧은 쪽은 apical plate의 media에 닿을 정도로만 넣어 세포 단층막을 손상하지 않게 주의하며 TEER값을 측정하였다.
대상 데이터
- HCT-116 세포는 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 분주 받아 사용하였다. 세포배양은 McCoys 5A medium(500 mL)에 10% FBS(50 mL)와 1% penicillin streptomycin이 함유된 배지를 사용하였다.
- 균주는 셀바이오텍(Gimpo, Korea)에서 분양받은 Lactobacillus acidophilus와 Lactobacillus(L.) plantarum(유익균), S. aureus(유해균)를 이용하였다. 스타터 배양액은 Lactobacilli MRS agar plate에서 autoclave를 이용하여 121℃에서 15분간 멸균한 액체배지(Lactobacilli MRS broth, Difco, Detroit, MI, USA)에 각각의 균주를 1회 접종한 뒤 최적 조건에서 배양하였다.
- 본 실험에서 사용된 금은화(Lonicerae Flos)분말은 동국대학교 일산병원으로부터 제공받아 밀봉한 후 암소에서 보관하여 사용하였다. 금은화의 추출은 250 mL 비커에 금은화 분말 30 g에 Lactobacilli MRS broth 150 mL를 첨가하여 실온(15～20℃)에서 30분간 sonication한 뒤, shaking water bath를 이용하여 70℃, 70 rpm의 조건에서 3시간 동안 열수 추출하였다.
- 본 연구에 사용된 HCT-116 세포는 McCoys 5A medium, 10% FBS, 1% penicillin streptomycin이 함유된 배양액을 사용하여 37℃, 5% CO2, 90% humidity의 조건하에서 배양되었다. 배양된 세포는 2~3일에 한 번씩 배양액을 바꾸어주면서 배양하여 세포분화가 최대에 도달하였을 때 phosphate buffered saline(PBS)으로 세포를 세척한 후 trypsin-EDTA용액으로 부착된 세포를 분리한 뒤 원심분리 하여 세포를 모은 다음 세포와 배지를 잘 혼합하여 계대 배양하여 사용하였다.
- HCT-116 세포는 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 분주 받아 사용하였다. 세포배양은 McCoys 5A medium(500 mL)에 10% FBS(50 mL)와 1% penicillin streptomycin이 함유된 배지를 사용하였다.
데이터처리
- 각 그룹간의 표준편차를 확인하기 위해 One-way ANOVA와 Bonferroni's post-hoc test를 시행하였으며 실험군 간의 유의성은 p<0.05 수준에서 검증하였다.
- 장 점막의 투과성을 확인하기 위해 apical plate에 배양된 균주에 DSS를 첨가한 날부터 Millicell-ERS(Millipore, Bedford, MA, USA) 기계를 이용하여 약 2시간, 4시간, 20시간, 22시간째 되는 시점에서 TEER값을 측정하였다. 각 실험은 3개의 well의 값을 측정하여 평균값을 구하였으며 결과는 대조군에 대한 TEER 값의 변화율(%)로 나타내었다. DSS 처리를 하지 않은 배지가 있는 well의 monolayer TEER값을 대조군으로 설정하였다.
- 본 연구의 실험결과는 평균(mean)과 표준편차(SD)로 나타내었다. 통계적 분석은 The statistical package for social science(SPSS) software program(version 17.
- 본 연구의 실험결과는 평균(mean)과 표준편차(SD)로 나타내었다. 통계적 분석은 The statistical package for social science(SPSS) software program(version 17.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 사용하였다. 각 그룹간의 표준편차를 확인하기 위해 One-way ANOVA와 Bonferroni's post-hoc test를 시행하였으며 실험군 간의 유의성은 p<0.
성능/효과
- 2시간 경과한 시점에서 S. aureus를 첨가한 군의 TEER 변화율이 95.12%로 DSS군(87.94%)보다 높게 측정되었으며 실험이 종료되는 22시간까지 각각의 시간대에서 DSS보다 높은 변화율을 나타내었다. 그러므로 유해균을 첨가한 세포의 TEER 변화율이 DSS로 장 점막 투과성을 유발시킨 세포의 TEER 변화율보다 높게 측정되었다는 것을 확인할 수 있었다.
- 25%로 측정되었다. DSS군을 제외한 나머지 군에서 실험 시작 당시 측정한 금은화 첨가군의 TEER값(100.36%)만이 유일하게 DSS군(100.72%)보다 낮게 측정되었고, 나머지군은 DSS만 첨가한 세포의 TEER값보다 전부 높은 수치의 변화율을 나타냈으며 그중 실험 시작 당시 측정한 수치를 제외한 나머지 4개의 TEER값을 토대로 계산한 percentage of control 값이 각각 2시간 경과 시 100.96%, 4시간 경과 시 95.58%, 20시간 경과 시 93.87%, 24시간 경과 시 90.5%로 L. acidophilus와 발효시킨 금은화를 첨가한 군에서 가장 높게 측정되었다.
- aureus를 단독으로 첨가하여 배양한 세포의 TEER 변화량이 더 높게 측정되어 유해균을 첨가한 그룹에서의 점막 투과성이 더 낮게 나왔다는 것을 확인할 수 있었다. HRP 측정 결과에 따르면 모든 군에서 대조군보다 높은 HRP값이 확인되었으며 S. aureus를 첨가한 세포의 HRP 투과성 변화율이 DSS 처리를 한 유해균 세포의 투과성보다 낮게 측정되었다. 그러므로 TEER과 HRP 투과성의 변화율은 장 점막에 대한 유해균의 영향에 대하여 일치한 결과를 보였다는 사ㅋ을 확인할 수 있었다.
- 본 연구에서 시행한 유익균의 TEER 측정 결과에 따르면 DSS 처리를 한 세포에서 장 점막 투과성 증가가 나타났으며 유익균과 배양된 후 DSS 처리를 한 세포의 TEER 측정값이 DSS 처리만 한 세포의 TEER 측정값보다 높게 나타났다. HRP 투과도를 측정한 결과 유익균과 배양된 세포의 점막 투과도가 DSS 처리만 한 세포보다 낮은 것으로 나타나서 각각의 결과는 점막 투과성의 증가를 보이고 있어 두 방법간의 일치된 결과를 보여주고 있다. 이러한 결과는 유산균을 복용했을 때 장 점막의 점착도가 증가되면서 장 누수 증후군을 예방할 수 있다는 기존의 연구와 일맥상통한 결과이며 유익균이 장 점막을 보호한다는 기존의 연구와 연관성이 있는 결과라고 할 수 있겠다.
- HRP 투과성 측정 결과를 살펴보면, HRP 활성정도가 증가할수록 점막 투과성이 증가하여 receiver plate의 농도가 증가했다는 것을 확인할 수 있다. 전체 군에서 대조군보다 높은 투과도가 나타났고 유익균과 금은화 및 발효 금은화를 첨가한 세포에서 DSS 처리만 한 세포보다 HRP 투과성이 높은 것으로 확인되었다.
- 또한 NSAID의 사용으로 인해 발생되는 Tight junction의 면역조절억제를 방지해주는 역할을 한다는 연구도 시행된 바 있다(17). L. plantarum 또한 E. coli 감염에 의한 장 투과성 증가를 억제해주는 장벽 보호 효과가 있다는 것이 다수의 연구를 통해 입증된 바 있어(18,19) 본 실험에서 다시 한번 유익균의 장 점막 보호 효과가 우수하다는 것을 확인할 수 있었다. 금은화는 항산화와 항균효과가 뛰어나 예전부터 그 효과를 위해 널리 사용되어 왔다.
- TEER값의 변화 추이를 살펴 본 결과 시간이 지날수록 DSS만 첨가한 세포의 TEER값은 실험 시작 2시간 경과 시점부터 대조군에 대하여 감소 추세를 보였으며(percentage of control: 84.84%) 4시간 경과 시 78.91%, 20시간 경과 시 77.83%, TEER 측정 종료 시간인 22시간 경과 시점에서는 76.25%로 측정되었다. DSS군을 제외한 나머지 군에서 실험 시작 당시 측정한 금은화 첨가군의 TEER값(100.
- 흡광도 측정법은 세균의 배양액에 일정한 파장의 빛을 통과시켰을 때 용액은 그 빛을 흡수 혹은 산란시킬 수 있고 이때 흡수된 빛의 양은 용액의 세포농도에 비례함을 이용한 것이다. 그러므로 HRP 활성정도가 증가할수록 장 투과성이 증가하여 receiver plate의 농도가 증가했다는 것을 확인할 수 있다.
- aureus를 첨가한 세포의 HRP 투과성 변화율이 DSS 처리를 한 유해균 세포의 투과성보다 낮게 측정되었다. 그러므로 TEER과 HRP 투과성의 변화율은 장 점막에 대한 유해균의 영향에 대하여 일치한 결과를 보였다는 사ㅋ을 확인할 수 있었다. 즉 유해균이 점막 상피세포에 주는 악영향이 DSS가 유발시키는 점막 투과성에 비해 미약하다는 사실을 확인할 수 있었다.
- 한약재를 유산균으로 발효시켰을 때 유해균 억제효과가 증대된다는 것은 효소 작용에 의해 발효균이 생성시킨 생물전환 효과를 한약재의 기존 항염 작용에 도입하는 새로운 방법적인 시도라고 볼 수 있고, 이것은 한약치료에 새로운 패러다임을 제시해줄 수 있는 획기적인 방법이라고 볼 수 있다. 그러므로 유산균을 단독으로 사용하는 것보다 한약과 발효시켜서 사용하는 것이 장 누수 증후군에 더욱 유의한 결과를 나타낼 수도 있을 것이라는 추측을 해볼 수 있었다.
- 94%)보다 높게 측정되었으며 실험이 종료되는 22시간까지 각각의 시간대에서 DSS보다 높은 변화율을 나타내었다. 그러므로 유해균을 첨가한 세포의 TEER 변화율이 DSS로 장 점막 투과성을 유발시킨 세포의 TEER 변화율보다 높게 측정되었다는 것을 확인할 수 있었다.
- 전체 군에서 대조군보다 높은 투과도가 나타났고 유익균과 금은화 및 발효 금은화를 첨가한 세포에서 DSS 처리만 한 세포보다 HRP 투과성이 높은 것으로 확인되었다. 그중에서 발효 금은화의 HRP 투과성 변화율이 174.01%로 가장 낮게 확인되어 세포 점막 투과성을 가장 많이 감소시켰다는 것을 확인할 수 있다. 대조군을 기준으로 HRP 투과도의 변화율은 percentage of control 을 계산하였으며 그 결과를 Fig.
- 본 실험에서는 유익균으로 L. acidophilus와 L. plantarum이 사용되었는데 L. acidophilus는 변비 치료에 이용되며, 방사선요법과 관련된 설사 치료에 관여하며 면역력 증강과 장내 균주의 조화를 이루는 역할을 하는 것으로 밝혀졌다(16). 또한 NSAID의 사용으로 인해 발생되는 Tight junction의 면역조절억제를 방지해주는 역할을 한다는 연구도 시행된 바 있다(17).
- 본 연구에서 시행한 유익균의 TEER 측정 결과에 따르면 DSS 처리를 한 세포에서 장 점막 투과성 증가가 나타났으며 유익균과 배양된 후 DSS 처리를 한 세포의 TEER 측정값이 DSS 처리만 한 세포의 TEER 측정값보다 높게 나타났다. HRP 투과도를 측정한 결과 유익균과 배양된 세포의 점막 투과도가 DSS 처리만 한 세포보다 낮은 것으로 나타나서 각각의 결과는 점막 투과성의 증가를 보이고 있어 두 방법간의 일치된 결과를 보여주고 있다.
- 본 연구에서 시행한 유해균의 TEER 측정 결과에 따르면 DSS 첨가로 장점막 투과성 증가를 유발시킨 세포와 비교했을 때 S. aureus를 단독으로 첨가하여 배양한 세포의 TEER 변화량이 더 높게 측정되어 유해균을 첨가한 그룹에서의 점막 투과성이 더 낮게 나왔다는 것을 확인할 수 있었다. HRP 측정 결과에 따르면 모든 군에서 대조군보다 높은 HRP값이 확인되었으며 S.
- 유산균과 금은화, 발효 금은화는 장 누수 증후군과 연관된 장 상피세포 점막 투과성 감소에 대하여 유의한 효과를 나타내었다. 따라서 유산균을 단독으로 사용하는 방법과 유산균을 이용해 발효시킨 금은화를 증가된 장 투과성 및 장내미생물 불균형으로 인한 장 누수 증후군과 관련된 일련의 증상들을 치료하고 면역관련 질환 및 만성 염증성 질환에도 응용할 수 있을 것으로 예상되며 이에 대한 앞으로의 추가 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 장 누수 증후군의 in vitro 모델은 dextran sodium sulphate(DSS)로 궤양성 대장염을 유발한 in vivo 모델에서 참고하였는데(5), 본 연구 결과의 TEER과 HRP 측정 결과상 대조군에 비해 DSS를 첨가한 세포의 투과도가 현저히 증가되었으며 이로써 DSS가 HCT-116의 장 점막의 투과성 변화를 측정하는데 꼭 필요한 요소라는 것이 입증되었다.
- 장 점막 투과성에 대한 유해균의 영향을 확인하기 위하여 HRP값을 측정하였으며 HRP 투과성 측정을 통해 HRP 활성도가 증가할수록 장 투과성이 증가하여 receiver plate의 농도가 증가했다는 것을 확인할 수 있다. 전체 군에서 대조군보다 높은 HRP 투과도가 나타났고 S.
- 장 점막 투과성에 대한 유해균의 영향을 확인하기 위하여 HRP값을 측정하였으며 HRP 투과성 측정을 통해 HRP 활성도가 증가할수록 장 투과성이 증가하여 receiver plate의 농도가 증가했다는 것을 확인할 수 있다. 전체 군에서 대조군보다 높은 HRP 투과도가 나타났고 S. aureus를 첨가한 세포의 HRP 투과성 변화율(347.54%)이 DSS 처리를 한 세포의 TEER 변화율(377.54%)보다 낮게 나타나 DSS처리만 한 세포보다 유해균을 첨가한 세포의 투과성이 감소된 것을 확인할 수 있었다. 대조군을 기준으로 HRP 투과도의 변화율은 percentage of control을 계산하였으며 그 결과를 Fig.
- HRP 투과성 측정 결과를 살펴보면, HRP 활성정도가 증가할수록 점막 투과성이 증가하여 receiver plate의 농도가 증가했다는 것을 확인할 수 있다. 전체 군에서 대조군보다 높은 투과도가 나타났고 유익균과 금은화 및 발효 금은화를 첨가한 세포에서 DSS 처리만 한 세포보다 HRP 투과성이 높은 것으로 확인되었다. 그중에서 발효 금은화의 HRP 투과성 변화율이 174.
- 그러므로 TEER과 HRP 투과성의 변화율은 장 점막에 대한 유해균의 영향에 대하여 일치한 결과를 보였다는 사ㅋ을 확인할 수 있었다. 즉 유해균이 점막 상피세포에 주는 악영향이 DSS가 유발시키는 점막 투과성에 비해 미약하다는 사실을 확인할 수 있었다. 그러나 data가 충분하지 않아 여러 종류의 유해균과 장 점막 투과성에 대한 상관관계를 규명할 수 있는 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 이러한 결과는 유산균을 복용했을 때 장 점막의 점착도가 증가되면서 장 누수 증후군을 예방할 수 있다는 기존의 연구와 일맥상통한 결과이며 유익균이 장 점막을 보호한다는 기존의 연구와 연관성이 있는 결과라고 할 수 있겠다. 특히 발효금은화를 첨가한 그룹의 TEER 변화율이 가장 높게 측정되었고 HRP값은 가장 낮게 측정된 것으로 미루어 보아 발효 한약재의 장점막 보호 효과가 입증되었다고 볼 수 있겠다. 향후 유산균을 금은화를 발효시켰을 때 나타나는 유산균과 금은화의 상호작용에 대한 추가적인 연구가 필요하다고 보인다.
후속연구
- 즉 유해균이 점막 상피세포에 주는 악영향이 DSS가 유발시키는 점막 투과성에 비해 미약하다는 사실을 확인할 수 있었다. 그러나 data가 충분하지 않아 여러 종류의 유해균과 장 점막 투과성에 대한 상관관계를 규명할 수 있는 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 유산균과 금은화, 발효 금은화는 장 누수 증후군과 연관된 장 상피세포 점막 투과성 감소에 대하여 유의한 효과를 나타내었다. 따라서 유산균을 단독으로 사용하는 방법과 유산균을 이용해 발효시킨 금은화를 증가된 장 투과성 및 장내미생물 불균형으로 인한 장 누수 증후군과 관련된 일련의 증상들을 치료하고 면역관련 질환 및 만성 염증성 질환에도 응용할 수 있을 것으로 예상되며 이에 대한 앞으로의 추가 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 특히 발효금은화를 첨가한 그룹의 TEER 변화율이 가장 높게 측정되었고 HRP값은 가장 낮게 측정된 것으로 미루어 보아 발효 한약재의 장점막 보호 효과가 입증되었다고 볼 수 있겠다. 향후 유산균을 금은화를 발효시켰을 때 나타나는 유산균과 금은화의 상호작용에 대한 추가적인 연구가 필요하다고 보인다.
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