[국내논문]매실추출물이 활성산소종 소거효과와 B16F1 세포에서 멜라닌 생성에 미치는 영향 Effect of Fruit Extract of Prunus mume on the Scavenging Activity of Reactive Oxygen Species and Melanin Production in B16F1 Cells원문보기
매실나무(Carthamus tinctorius L.)는 한국, 일본과 중국에서 전통적으로 약효가 있는 음식으로 사용되어 왔다. 특히 과일은 위염증 및 위궤양에 도움이 되는 생물학적 효과가 있다고 보고되었다. 그러나 피부미백과 관련된 효능에 대한 연구는 이직까지 미진하다. 따라서, 본 연구에서는 항산화 및 피부미백에 대한 매실추출물의 효능이 조사되었다. MTT assay를 이용한 세포생존에 대한 결과로 매실추출물은 0.1% 이하의 농도에서 세포독성이 없는 것으로 나타났다. 다음에 매실추출물의 환원력 뿐만 아니라 DPPH radical, hydrogen peroxide 및 superoxide에 대한 직접적인 소거효과가 in vitro에서 평가되었다. 그것은 이상의 활성산소종에 대한 소거효과를 발휘하게 하는 우수한 환원력을 가지고 있다. 더욱이 산화적 스트레스와 연관된 genomic DNA 손상에 대한 보호효과가 농도에 따라 증가하는 것이 관찰 되었다. 뿐만 아니라 L-dopa에 의하여 유발되는 멜라닌 생성에 대한 억제효과를 나타내었다. 그것은 또한 Western blot 분석에서 항산화와 괸련된 NRF-2, SOD-1 및 SOD-2 발현수준을 감소시킨다는 것이 발견되었다. 이러한 결과들은 매실추출물이 항산화에 의한 멜라닌생성의 억제를 통하여 피부 미백효과를 발휘할 수 있다는 것을 암시한다.
매실나무(Carthamus tinctorius L.)는 한국, 일본과 중국에서 전통적으로 약효가 있는 음식으로 사용되어 왔다. 특히 과일은 위염증 및 위궤양에 도움이 되는 생물학적 효과가 있다고 보고되었다. 그러나 피부미백과 관련된 효능에 대한 연구는 이직까지 미진하다. 따라서, 본 연구에서는 항산화 및 피부미백에 대한 매실추출물의 효능이 조사되었다. MTT assay를 이용한 세포생존에 대한 결과로 매실추출물은 0.1% 이하의 농도에서 세포독성이 없는 것으로 나타났다. 다음에 매실추출물의 환원력 뿐만 아니라 DPPH radical, hydrogen peroxide 및 superoxide에 대한 직접적인 소거효과가 in vitro에서 평가되었다. 그것은 이상의 활성산소종에 대한 소거효과를 발휘하게 하는 우수한 환원력을 가지고 있다. 더욱이 산화적 스트레스와 연관된 genomic DNA 손상에 대한 보호효과가 농도에 따라 증가하는 것이 관찰 되었다. 뿐만 아니라 L-dopa에 의하여 유발되는 멜라닌 생성에 대한 억제효과를 나타내었다. 그것은 또한 Western blot 분석에서 항산화와 괸련된 NRF-2, SOD-1 및 SOD-2 발현수준을 감소시킨다는 것이 발견되었다. 이러한 결과들은 매실추출물이 항산화에 의한 멜라닌생성의 억제를 통하여 피부 미백효과를 발휘할 수 있다는 것을 암시한다.
Prunus mume has been traditionally used as a medicinal food in Korea, Japan, and China. In particular, this fruit has been reported to have beneficial biological effects on gastritis and gastric ulcers. However, its action in relation to skin whitening has remained unclear. Accordingly, the effects ...
Prunus mume has been traditionally used as a medicinal food in Korea, Japan, and China. In particular, this fruit has been reported to have beneficial biological effects on gastritis and gastric ulcers. However, its action in relation to skin whitening has remained unclear. Accordingly, the effects of fruit extract of P. mume related to antioxidation and skin whitening were examined in this study. First, using the MTT assay, it was observed that fruit extract of P. mume below 0.1% has no cytotoxicity in B16-F1 cells as a result of cell viability. Second, the direct scavenging effects and the reducing power of the fruit extract of P. mume were evaluated in vitro on DPPH radicals, hydrogen peroxide, and superoxide. It exhibited high reducing power and scavenging activity on the aforementioned reactive oxygen species. Furthermore, we found that its protective effect against genomic DNA damage related to oxidative stress was increased in a dose-dependent manner. In addition, the fruit extract of P. mume had an inhibitory effect on melanin production induced by L-dopa. In addition, it reduced the expression level of NRF-2, SOD-1, and SOD-2 related to antioxidation in western blot analysis. These results suggest that fruit extract of P. mume could exert a whitening effect through inhibition of melanin production by its antioxidant effect.
Prunus mume has been traditionally used as a medicinal food in Korea, Japan, and China. In particular, this fruit has been reported to have beneficial biological effects on gastritis and gastric ulcers. However, its action in relation to skin whitening has remained unclear. Accordingly, the effects of fruit extract of P. mume related to antioxidation and skin whitening were examined in this study. First, using the MTT assay, it was observed that fruit extract of P. mume below 0.1% has no cytotoxicity in B16-F1 cells as a result of cell viability. Second, the direct scavenging effects and the reducing power of the fruit extract of P. mume were evaluated in vitro on DPPH radicals, hydrogen peroxide, and superoxide. It exhibited high reducing power and scavenging activity on the aforementioned reactive oxygen species. Furthermore, we found that its protective effect against genomic DNA damage related to oxidative stress was increased in a dose-dependent manner. In addition, the fruit extract of P. mume had an inhibitory effect on melanin production induced by L-dopa. In addition, it reduced the expression level of NRF-2, SOD-1, and SOD-2 related to antioxidation in western blot analysis. These results suggest that fruit extract of P. mume could exert a whitening effect through inhibition of melanin production by its antioxidant effect.
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문제 정의
더욱이 이러한 매실추출물의 활성산소 소거기능과 연관하여 멜라닌 색소생성을 억제할 수 있는 미백 효과를 알아보기 위해 멜라닌을 생성하는 세포인 쥐 흑색종 세포 B16F1 세포를 사용하여 멜라닌 억제 연구를 진행하였다.
본 연구에서는 매실추출물의 항산화 효능을 연구하기 위하여 melanoma 세포인 B16-F1을 사용하였으며, 동시에 항산화 효능으로 미백효과를 나타낼 수 있는지 그 가능성을 연구하고자 피부색소인 멜라닌 생성에 대한 영향을 조사하였다.
최근 합성 항산화제가 널리 알려져 있지만 고용량 장기간 이용 시 암을 유발 할 수 있는 부작용이 보고되고 있어 천연 항산화제에 대한 관심과 연구가 크게 부각되고 있는 실정이다 [13]. 이러한 맥락에서 안정성과 경제적 부담이 적은 천연 항산 화제를 찾는 연구가 최근에 활발히 이루어지고 있으며, 본 연구에서는 천연항산화제로 안전성이 확보된 매실의 추출물에서 특이할 만한 항산화 효과를 관찰하여 어떤 종류의 활성 산소종에 항산화 효능이 있는지 그리고 세포에서 항산화 효능 기전을 연구하였다.
유해 활성산소종은 효소의 활성의 억제와 가교 결합의 촉진, DNA, RNA, 효소 및 세포막과 세포 소기관의 손상을 일으켜 세포사를 일으키는 요인이 되며 노화를 유발시키는 것으로 보고되었다[2]. 이러한 활성산소 소거를 위해서 천연 항산 화제로 이용될 수 있는데[23], 본 연구에서는 매실을 이용하여 DPPH radical, hydrogen peroxide 및 superoxide와 같은 유해 활성산소종 소거능력을 조사한 결과 특히 활성산소 중 DPPH radical에 대한 매실추출물의 소거능력과 환원능 사이에 연관성을 발견 하였다. 활성산소에 대한 소건효과 뿐만 아니라, 흑색종 암세포에서 분리한 genomic DNA를 Fenton 반응에 의하여 생성된 hydroxyl radical에 노출시킨 결과 매실추출물은 함량이 증가함에 따라 DNA 산화에 대한 보호효과가 비례 하여 증가하였다.
제안 방법
1 μg의 DNA를 포함하는 20 μl의 반응혼합물을 1% agarose gel에서 100 V로 30 min 동안 전기영동 하였다.
B16F1 세포로부터 분리한 genomic DNA를 이용하여 Fenton 반응에 의하여 발생된 hydroxyl radical에 의한 DNA의 산화적 손상에 대한 매실추출물의 항산화 효과를 조사하였다. 본 실험에서 매실의 존재 및 부재의 조건에서 DNA 전기영동을 이용하여 200 μM Fe(II) 및 2 mM H2O2를 사용한 Fenton반응에 의하여 발생된 hydroxyl radical에 노출된 DNA의 산화적 손상을 조사하였다.
Brand-Williams [12] 실험방법을 변형하여 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl (DPPH) radical에 대한 매실추출물의 소거능력을 측정하였다. 시험농도의 매실추출물을 DPPH 용액을 가하여 10 sec 동안 잘 혼합한 다음, 실온에서 20 min 동안 반응 시킨 후 525 nm에서 흡광도를 측정하였다.
Effect of fruit extract of Prunus mume on protein expressions of Nrf2, SOD-1 and SOD-2 in B16F1 cells. Cells were treated with fruit extract of P. mume at 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5, 1%. Western blot analysis of cell lysates was performed using antibodies as indicated.
Gel은 1 mg/ml ethidium bromide로 염색하여 물로 세척하여 UV로 LAS3000® image analyzer (Fuji Film Life Science, Tokyo, Japan)를 이용하여 관찰하였다.
In vitro에서 지질과산화에 대한 매실추추물의 항산화 효과를 조사하기 위하여 linolenic acid를 Fenton반응으로 발생시킨 hydroxyl radical에 노출시켰다. 먼저 hydroxyl radical에 의한 지질과산화를 확인하기 위하여 기존에 알려진 친유성 항산화제인 vitamin E의 지질과산화에 대한 억제효능을 관찰 한 결과, Fig.
Western blot의 band는 LAS3000® image analyzer (Fujifilm Life Science, Tokyo, Japan)를 이용하여 관찰하였다.
여기서 얻은 pellet에 1 N NaOH (10% DMSO) 200 μl를 첨가하고 vortex 후 405 nm에서 흡광도를 측정 하였다. melanin 표준품(Sigma, USA)으로 얻은 표준 검량선을 이용하여 각 well에서 생성된 멜라닌 양을 산출하여 였다. 멜라닌은 단위세포(104 cells)에서의 멜라닌 생성량을 비교하였다.
10 μg의 세포용출액을 10% Tris–HCl gel에서 전기영동 후 단백질을 전기적으로 nitrocellulose membrane으로 전이 시켰다. 그 다음 10% skim milk를 nitrocellulose membrane에 전처리하고 목적 단백질에 대한 1차 항체(anti-Nrf2, anti-SOD-1, anti-SOD -2, anti-beta-actin)를 처리한 다음 2차 항체를 처리 후, chemiluminescent ECL kit (Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하여 목적단백질을 검출하였다. Western blot의 band는 LAS3000® image analyzer (Fujifilm Life Science, Tokyo, Japan)를 이용하여 관찰하였다.
그 다음, 15:1 비율의 n-butanol : pyridine 용액을 500 μl 첨가하고 1,000× g에서 10 min 동안 원심분리하여 상등액을 532 nm에서 흡광도를 측정하였으며 지질과산화 정도는 시료 첨가 전후의 흡광도 비를 %값으로 환산하였다.
그 후, 15 μl의 1.25 mM ABTS 및 30 μl의 peroxidase 37℃에서 10 min 동안 반응시켜 405 nm에서 흡광도를 측정하였으며 항산화 활성은 시료 첨가 전후의 흡광도 비를 % 값으로 환산하였다.
매실이 항산화 효소의 발현을 조절하는데 가장 중요한 전사 인자인 Nrf2와 진 항산화 효소 중에서 가장 중요한 Superoxide dismutase (SOD)인 SOD-1과 SOD-2 의 단백질 발현을 조사하였다. Fig.
매실추출물을 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5, 1%의 농도가 되게 linolenic acid emulsion과 30 min 동안 혼합한 후 0.8 mM H2O2 및 0.8 mM FeSO4를 혼합한 용액을 5 hr 동안 반응 시킨 후 0.4% TBA를 첨가하고 95℃에서 2 hr 동안 반응시켜 실온에서 10 min 동안 반응시켰다. 그 다음, 15:1 비율의 n-butanol : pyridine 용액을 500 μl 첨가하고 1,000× g에서 10 min 동안 원심분리하여 상등액을 532 nm에서 흡광도를 측정하였으며 지질과산화 정도는 시료 첨가 전후의 흡광도 비를 %값으로 환산하였다.
먼저 100 μl의 DNA 용액에 시험농도의 매실추출물, 200 μM FeSO4, 1 mM H2O2 및 50 μg/ml genomic DNA를 첨가하였다.
melanin 표준품(Sigma, USA)으로 얻은 표준 검량선을 이용하여 각 well에서 생성된 멜라닌 양을 산출하여 였다. 멜라닌은 단위세포(104 cells)에서의 멜라닌 생성량을 비교하였다.
본 실험에서 매실의 존재 및 부재의 조건에서 DNA 전기영동을 이용하여 200 μM Fe(II) 및 2 mM H2O2 를 사용한 Fenton반응에 의하여 발생된 hydroxyl radical에 노출된 DNA의 산화적 손상을 조사하였다.
생체 내 산화적 스트레스와 관련되어 있는 DPPH radical, hydroxyl radical, hydrogen peroxide의 소거능력 및 환원력에 대하여 매실추출물의 효과를 조사하였다. DPPH radical 소거법은 항산화 물질에 의한 DPPH radical의 탈색 정도를 지표로 하여 산화억제 정도를 예측할 수 있다.
세포배양을 위한 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM), Trypsin-EDTA, penicillin / streptomycin / amphotericin (각각 10,000 U/ml, 10,000 μg/ml 및 2,500 μg/ml), fetal bovine serum (FBS) 시약은 Gibco BRL, Life Technologies (Paisley, Scotland)로 부터 구입하였다. B16F1 cell line은 ATCC (American Type Culture Collection, USA)로부터 구입하였다. MTT reagent, gelatin, agarose 와 기타시약은 Sigma Chemical Co.
B16F1 cell line은 ATCC (American Type Culture Collection, USA)로부터 구입하였다. MTT reagent, gelatin, agarose 와 기타시약은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다.
상기 추출물을 여과 한 후, 여과된 여액을 동결건조하여 분말 형태의 매실추출물를 얻는다. 분말형태의 매실추출물을 시험농도로 희석하여 본 연구에 사용하였다.
세포배양을 위한 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM), Trypsin-EDTA, penicillin / streptomycin / amphotericin (각각 10,000 U/ml, 10,000 μg/ml 및 2,500 μg/ml), fetal bovine serum (FBS) 시약은 Gibco BRL, Life Technologies (Paisley, Scotland)로 부터 구입하였다.
여기에 10% TCA 용액 1 ml를 가하여 13,500× g에서 15 min 동안 원심분리하여 얻은 상등액 1 ml에 증류수 및 ferric chloride 각 1 ml를 가하여 혼합한 후 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로 0.01% vitamin C를 사용하였다. 시료의 환원력은 시료 첨가군와 대조군의 흡광도 비를 % 값으로 환산하여 나타내었다.
데이터처리
Level of significance was identified statistically (*p<0.05) using Student’s t test.
Level of significance was identified statistically (*p<0.05, **p<0.01) using Student’s t test.
각 시료농도군에 대한 유의차 검정은 대조군과 비교하여 Student’s ttest 한 후 p<0.05 값을 통계적으로 유의성 있는 결과로 간주하였다.
각 실험은 3회 이상 반복실험을 통하여 그 결과를 얻어 각각의 시료농도에 대해 평균±표준편차로 나타내었다.
이론/모형
Genomic DNA는 약간 변형된 표준 과정에 따라 B16F1 세포로 부터 추출하였다 [15]. Fenton반응에 의하여 발생된 hydroxyl radical에 노출된 DNA 산화는 기존에 실험된 방법에 따라 수행되었다[17]. 먼저 100 μl의 DNA 용액에 시험농도의 매실추출물, 200 μM FeSO4, 1 mM H2O2 및 50 μg/ml genomic DNA를 첨가하였다.
Hansen [9]의 방법에 따라 B16F1 세포에 대한 매실추출물의 세포독성을 MTT (3-(4,5-dimethyl-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)를 이용하여 측정하였다.
Oyaizu [19]의 방법에 따라 측정하였다. 매실추출물 1 ml에 pH 6.
Superoxide anion 라디칼 소거능은 Fidovich [6]의 방법에 의해 정하였다. 각 시료 용액 0.
이 세포 독성에 미치는 농도를 조사하기 위하여 MTT assay 를 수행하였다. B16F1세포에 대한 매실의 세포 독성을 측정한 결과, Fig.
성능/효과
B16F1 세포에서 매실추출물의 멜라닌 생성 억제효과를 알아보기 위하여 B16F1 세포에 각 농도별로 처리하고 세포 내 melanin 함량을 조사한 결과 Fig. 5에서 나타난 바와 같이 매실추출물은 양성대조군으로 사용된 0.1% 농도의 arbutin보다 melanin 생성 억제효과가 우수한 것으로 나타났으며, 0.1%농도의 vitamin C에 비하여 melanin 생성 억제효과가 낮았다.
이 세포 독성에 미치는 농도를 조사하기 위하여 MTT assay 를 수행하였다. B16F1세포에 대한 매실의 세포 독성을 측정한 결과, Fig. 1에서 보는 바와 같이 매실의 1% 이하의 농도에서 비교하였을 때 어떠한 독성효과도 없는 것으로 나타났다.
결론적으로 매실추출물은 활성산소종에 대한 소거효과 및 환원력 뿐만 아니라 Nrf2, SOD-1과 SOD-2의 발현 조절을 통하여 멜라닌 생성억제효과를 통하여 미백효과를 발휘할 수 있다고 판단된다.
3에서 보여지는 바와 같이 분해되는 것을 확인 할 수 있었다. 그러나 매실추출물을 첨가한 군에서는 농도에 따라 DNA의 산화적 손상에 대한 보호효과가 증가하였으며, 0.25% 이상의 농도에서는 genomic DNA의 산화적 손상이 완전히 억제되는 것으로 관찰 되었다.
2D에서 보는 바와 같이 매실추출물의 환원력은 농도에 따라서 증가하는 것으로 나타났다. 매실추출물이 1% 농도에서는 양성대조군으로 사용된 0.01%의 vitamin C와 환원력이 유사한 것으로 나타났다.
In vitro에서 지질과산화에 대한 매실추추물의 항산화 효과를 조사하기 위하여 linolenic acid를 Fenton반응으로 발생시킨 hydroxyl radical에 노출시켰다. 먼저 hydroxyl radical에 의한 지질과산화를 확인하기 위하여 기존에 알려진 친유성 항산화제인 vitamin E의 지질과산화에 대한 억제효능을 관찰 한 결과, Fig. 4에서 보여지는 바와 같이 지질과산화 억제효과를 관찰 할 수 있었으나, 매실추출물은 지질과산화에 대한 억제효과가 없는 것으로 나타났다.
미백효과를 가진 화합물을 개발하기 위하여 tyrosinase 효소활성을 를 억제하는 물질들에 대한 다양한 연구들이 현재 진행되고 있다[24]. 본 연구에서는 매실추출물을 B16F1 세포에 각 농도 별로 처리하고 세포 내 tyrosinase 활성을 조사한 결과, 양성대조군인 vitamin C의 미백효과보다는 낮았으나 arbutin보다는 매실추출물의 미백효과가 우수한 것으로 나타났다.
이러한 활성산소 소거를 위해서 천연 항산 화제로 이용될 수 있는데[23], 본 연구에서는 매실을 이용하여 DPPH radical, hydrogen peroxide 및 superoxide와 같은 유해 활성산소종 소거능력을 조사한 결과 특히 활성산소 중 DPPH radical에 대한 매실추출물의 소거능력과 환원능 사이에 연관성을 발견 하였다. 활성산소에 대한 소건효과 뿐만 아니라, 흑색종 암세포에서 분리한 genomic DNA를 Fenton 반응에 의하여 생성된 hydroxyl radical에 노출시킨 결과 매실추출물은 함량이 증가함에 따라 DNA 산화에 대한 보호효과가 비례 하여 증가하였다. 이러한 항산화과가 있는 농도에서 매실추출물은 세포에 대한 독성효과는 없는 것으로 확인 되었다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
항산화제의 역활은?
항산화제란 활성산소의 생성을 억제하거나 그 활성도를 경감시키며 활성산소로 인해 손상된 조직들을 복원시키는 역할을 한다. 항산화제는 크게 효소 항산화제와 비효소 항산화제로 분류된다.
효소 항산화제와 비효소 항산화제의 기능과 종류는?
항산화제는 크게 효소 항산화제와 비효소 항산화제로 분류된다. 효소 항산화제에는 산소화합물의 독성을 제거하며 생체의 항상성 유지를 하며, superoxide dismutase, catalase 및 glutathione 등이 포함된다. 비효소계 항산화제는 몸 안에서는 생성되지 않고 외부에서 섭취해야 하며 우리가 일상 생활에 섭취하는 비타민 E, C, B6, β-carotene, selenium, N-acetylcysteine 등이 포함되며, 항산화 효소와 연쇄 반응을 일으켜 항산화 효과를 증가시킨다[21].
생체 내에서 발생하는 활성 산소종의 종류는?
산소는 동식물의 생명 유지를 위하여 호흡과정에 필수불가 결한 기체분자로 대사과정에서 중요한 역할을 수행한다고 알려져 있다. 선행연구에서 이러한 생체의 일상적인 대사과정 중에서 전자전달계, peroxysome의 지방산 대사과정, 대식세포 등에서 hydroxyl radical, superoxide anion radical, hydrogen peroxide, singlet oxygen과 같은 몸에 해로운 활성 산소종이 발생된다고 보고되었다[18,20]. 대식세포 및 호중구 등은 자체적으로 활성산소를 만들어서 외부세균의 침입에 방어하기도 하지만 인체에서 활성산소종이 과잉으로 발생되면 부작용으로서 세포 구성성분인 지질, 단백질, 핵산, 당, DNA 분자 등에 산화적 손상을 일으켜 세포의 정상적인 대사를 저 해하기도 한다[7,8,14,16] 이러한 활성산소들을 억제하기 위하여 생체내에 방어시스템으로 항산화제들이 존재한다.
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