V. vulnificus에 대한 매실 추출액의 항균활성을 측정함으로서 다소비 식품인 수산물의 미생물학적 안전성 확보에 기여하고자 하였다. 실험에서 사용한 균주는 수산물, 수족관수, 해수, 갯벌에서 분리된 V. vulnificus 28주를 대상으로 하였다. V. vulnificus 28주 모두에서 vvhA 유전자가 검출되고 good identification 이상의 생화학 동정 결과를 나타내어 V. vulnificus임이 확인되었다. 실험에 사용된 V. vulnificus는 tetracycline과 chloramphenicol 항생제에 감수성을 나타내어 환자 발생 시 이 두 종류의 항생제가 치료에 용이할 것으로 판단되었다. V. cholerae NCCP 13589와 V. parahemolyticus NCCP 11143 표준균주 모두 매실 추출물 2.5%와 5%에서 생육 저지환을 나타내었다. 또한 V. vulnificus 분리균주와 V. vulnificus NCCP 11135 표준균주 모두 매실 추출물 1.25%, 2.5%, 5%에서 생육 저지환을 나타내어 V. cholerae와 V. parahemolyticus에 비해 V. vulnificus에 대한 매실 추출물의 항균활성이 높게 나타났다. V. vulnificus에 대한 매실 추출액 최소살균농도가 1.6%로 나타나 수산물 중 V. vulnificus 생육억제에 매실 추출물이 매우 유용할 것으로 판단되었다. 수산물과 관련된 비브리오균 중 패혈증을 일으키는 V. vulnificus균은 국내에서 매년 지속적으로 환자와 사망자를 발생시키고 있다. 수산물 생식 시 발생할 수 있는 식중독을 예방하기 위한 매실 추출물 활용연구가 필요한 것으로 판단된다.
V. vulnificus에 대한 매실 추출액의 항균활성을 측정함으로서 다소비 식품인 수산물의 미생물학적 안전성 확보에 기여하고자 하였다. 실험에서 사용한 균주는 수산물, 수족관수, 해수, 갯벌에서 분리된 V. vulnificus 28주를 대상으로 하였다. V. vulnificus 28주 모두에서 vvhA 유전자가 검출되고 good identification 이상의 생화학 동정 결과를 나타내어 V. vulnificus임이 확인되었다. 실험에 사용된 V. vulnificus는 tetracycline과 chloramphenicol 항생제에 감수성을 나타내어 환자 발생 시 이 두 종류의 항생제가 치료에 용이할 것으로 판단되었다. V. cholerae NCCP 13589와 V. parahemolyticus NCCP 11143 표준균주 모두 매실 추출물 2.5%와 5%에서 생육 저지환을 나타내었다. 또한 V. vulnificus 분리균주와 V. vulnificus NCCP 11135 표준균주 모두 매실 추출물 1.25%, 2.5%, 5%에서 생육 저지환을 나타내어 V. cholerae와 V. parahemolyticus에 비해 V. vulnificus에 대한 매실 추출물의 항균활성이 높게 나타났다. V. vulnificus에 대한 매실 추출액 최소살균농도가 1.6%로 나타나 수산물 중 V. vulnificus 생육억제에 매실 추출물이 매우 유용할 것으로 판단되었다. 수산물과 관련된 비브리오균 중 패혈증을 일으키는 V. vulnificus균은 국내에서 매년 지속적으로 환자와 사망자를 발생시키고 있다. 수산물 생식 시 발생할 수 있는 식중독을 예방하기 위한 매실 추출물 활용연구가 필요한 것으로 판단된다.
The purpose of this study was to estimate the antimicrobial activity of Maesil (Japanese apricot, Prunus mume) extract against Vibrio vulnificus. The strains tested in the study were 28 V. vulnificus isolates originated from fish, seawater, mud flat and seawater in fish restaurant. The vvhA gene was...
The purpose of this study was to estimate the antimicrobial activity of Maesil (Japanese apricot, Prunus mume) extract against Vibrio vulnificus. The strains tested in the study were 28 V. vulnificus isolates originated from fish, seawater, mud flat and seawater in fish restaurant. The vvhA gene was detected using real-time PCR and biochemical identification expressed above good identification in 28 isolates of V. vulnificus. All of V. vulnificus used in this study was susceptible to tetracycline and chloramphenicol antibiotics. These two antibiotics were considered to be useful for the treatment of patients. Maesil extracts 2.5% and 5% showed antimicrobial activity against V. cholerae NCCP 13589 and V. parahemolyticus NCCP 11143. V. vulnificus isolate and V. vulnificus NCCP 11135 showed growth inhibition at 1.25%, 2.5% and 5% of Maesil extract, respectively. Compared with V. cholerae and V. parahemolyticus, the antibacterial activity of Maesil extract against V. vulnificus was high. The minimum bactericidal concentration of Maesil extract for V. vulnificus was 1.6%. These results revealed that Maesil extract was found to be very useful for inhibiting the growth of V. vulnificus and can be expected to prevent food poisoning caused by V. vulnificus.
The purpose of this study was to estimate the antimicrobial activity of Maesil (Japanese apricot, Prunus mume) extract against Vibrio vulnificus. The strains tested in the study were 28 V. vulnificus isolates originated from fish, seawater, mud flat and seawater in fish restaurant. The vvhA gene was detected using real-time PCR and biochemical identification expressed above good identification in 28 isolates of V. vulnificus. All of V. vulnificus used in this study was susceptible to tetracycline and chloramphenicol antibiotics. These two antibiotics were considered to be useful for the treatment of patients. Maesil extracts 2.5% and 5% showed antimicrobial activity against V. cholerae NCCP 13589 and V. parahemolyticus NCCP 11143. V. vulnificus isolate and V. vulnificus NCCP 11135 showed growth inhibition at 1.25%, 2.5% and 5% of Maesil extract, respectively. Compared with V. cholerae and V. parahemolyticus, the antibacterial activity of Maesil extract against V. vulnificus was high. The minimum bactericidal concentration of Maesil extract for V. vulnificus was 1.6%. These results revealed that Maesil extract was found to be very useful for inhibiting the growth of V. vulnificus and can be expected to prevent food poisoning caused by V. vulnificus.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 수산물 섭취와 연관되어 가장 높은 사망률을 나타내는 V. vulnificus에 대한 매실 추출액의 항균활성을 측정함으로서 다소비 식품인 수산물의 미생물학적 안전성 확보에 기여하고자 하였다.
따라서 본 연구에서는 수산물 섭취와 연관되어 가장 높은 사망률을 나타내는 V. vulnificus에 대한 매실 추출액의 항균활성을 측정함으로서 다소비 식품인 수산물의 미생물학적 안전성 확보에 기여하고자 하였다.
가설 설정
1) Concentration of Maesil (Prunus mume) extract loaded on paper disk was 50 µL/ 10 mm paper disc.
제안 방법
에 따라 실험하였다. V. vulnificus 실험균주 28주와 V. vulnificus 표준균주 1주, 총 29주를 MHB (Oxoid)에 접종하여 항균활성 실험과 동일하게 0.8~0.9 McFarland의 탁도를 가진 균액을 조제하였다. 조제된 균액을 다시 멸균생리식염수로 100배 희석하여 접종 균액으로 하였다.
V. vulnificus 특이 유전자인 vvhA 유전자15)를 분석하기 위하여 배양된 균주 한 백금이를 멸균 증류수200 μL에 현탁한 후 100oC에서 15분간 가열하였다.
가열된 배양액을 14,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 주형 DNA로 사용하였다. V. vulnificus의 vvhA 유전자 검출을 위한 real-time PCR은 Vibrio triplex real-time PCR kit (KogeneBiotech Co., Ltd., Seoul, Korea)와 realtime PCR (7500 Fast real-time PCR, Applied Biosystems, Singapore)을 사용 제조사의 실험조건에 따라 실시하였다.real-time PCR 결과 vvhA 유전자가 확인된 균주는 Vitek 2 system (Biomerieux, Durham, NC, USA)를 이용 생화학적 동정을 실시하여 최종 V.
cholerae NCCP 13589 표준균주 각각 1주에 대하여 paper disc diffusion법17)을 이용하여 실험하였다. 각각의 균주를 Mueller-Hinton broth(MHB; Oxoid)에 접종하여 37oC에서 18시간 배양한 후 멸균생리식염수를 이용 0.8 McFarland의 탁도를 나타내는 균액을 조제하였다. 조제된 균액을 Mueller-Hinton agar(MHA; Oxoid)에 균일하게 도말하였다.
조제된 균액을 다시 멸균생리식염수로 100배 희석하여 접종 균액으로 하였다. 매실 추출액과 MHB (Oxoid)를 혼합한 후 MHB를 이용 계단 희석하여 매실 추출액-MHB배지를 제조하였다. 제조된 매실 추출액-MHB 배지를 시험관에 1 mL씩 분주한 후 접종 균액 1 mL 넣어 최종 매실 추출액의 농도가 0.
멸균된 10 mm paper disc (Toyo Roshi Kaisha Ltd.)에 각각 농도의(5%,2.5%, 1.25%, 0.625%) 추출물 50 μL를 흡수시켜 MHA 위에 놓고 37oC에서 18시간 배양하여 생육저해대의 지름(mm)을 측정하였다.
본 실험에 사용된 V. vulnificus의 항생제 내성 현황을 파악하기 위해 Vitek 2 system을 이용하여 항생제 내성을 실험하였다. 실험에 사용된 항생제 카드는 AST-N169 card(biomerieux)로 구성 항생제 종류는 ampicillin (AMP),amoxicillin/clavulanic acid (AMC), ampicilln/sulbactam(SAM), cefazolin (CFZ), cefotetan (CTT), cefoxitin (FOX), ceftriaxone (CRO), imipenem (IPM), amikacin (AMK), gen-tamicin (GEN), nalidixic acid (NAL), ciprofloxacin (CIP), tetracycline (TET), chloramphenicol (CHL), trimethoprim/sulfamethoxazole (SXT) 등 총 15종을 사용하였다.
실험에 사용된 V. vulnificus 균주의 확인동정을 위하여 real-time PCR을 이용한 유전자 검출과 vitek 2 system을 이용한 생화학 동정을 실시하였다(Table 1). vvhA 유전자는 V.
실험에 사용한 균주가 V. vulnificus임을 재확인하기 위하여 확인동정실험을 실시하였다. 보관균주를 thiosulfate citrate bile-salt sucrose agar (TCBS; Oxoid, Hampshire, England)에 도말하여 37oC에서 20시간 배양한 후 녹색집락을 선택하여 tryptone soy agar (TSA; Oxoid)에 계대 배양하였다.
매실 추출액과 MHB (Oxoid)를 혼합한 후 MHB를 이용 계단 희석하여 매실 추출액-MHB배지를 제조하였다. 제조된 매실 추출액-MHB 배지를 시험관에 1 mL씩 분주한 후 접종 균액 1 mL 넣어 최종 매실 추출액의 농도가 0.1%부터 6.4%까지 되도록 하였다. 균액이 접종된 시험관을 37oC에서 20시간 배양한 후 각각시험관의 배양액 0.
9 McFarland의 탁도를 가진 균액을 조제하였다. 조제된 균액을 다시 멸균생리식염수로 100배 희석하여 접종 균액으로 하였다. 매실 추출액과 MHB (Oxoid)를 혼합한 후 MHB를 이용 계단 희석하여 매실 추출액-MHB배지를 제조하였다.
대상 데이터
vulnificus의 항생제 내성 현황을 파악하기 위해 Vitek 2 system을 이용하여 항생제 내성을 실험하였다. 실험에 사용된 항생제 카드는 AST-N169 card(biomerieux)로 구성 항생제 종류는 ampicillin (AMP),amoxicillin/clavulanic acid (AMC), ampicilln/sulbactam(SAM), cefazolin (CFZ), cefotetan (CTT), cefoxitin (FOX), ceftriaxone (CRO), imipenem (IPM), amikacin (AMK), gen-tamicin (GEN), nalidixic acid (NAL), ciprofloxacin (CIP), tetracycline (TET), chloramphenicol (CHL), trimethoprim/sulfamethoxazole (SXT) 등 총 15종을 사용하였다. 각각항생제에 대한 내성(Resistant; R), 중등도 내성(Intermediate; I), 감수성(Susceptible; S) 판정은 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)의 항생제 내성기준16)에 따라 판정하였다.
실험에 사용한 매실 추출물은 매실즙을 착즙한 후 가열 농축한 광양시 청매실농원의 고형분 함량 70% 이상인 매실농축액을 사용하였다. 매실 농축액을 동량의 멸균증류수로 용해하여 4,000 rpm에서 5분간 원심분리 한 후 상층액을 0.
실험에서 사용한 균주는 2014년부터 2015년 까지 수산물, 수족관수, 해수, 갯벌에서 분리되어 전라남도보건환경연구원에 보관된 V. vulnificus 28주를 대상으로 하였다. 양성, 음성 대조를 위한 표준균주는 V.
vulnificus에 대한 매실 추출액의 항균활성을 측정함으로서 다소비 식품인 수산물의 미생물학적 안전성 확보에 기여하고자 하였다. 실험에서 사용한 균주는 수산물, 수족관수, 해수, 갯벌에서 분리된 V. vulnificus 28주를 대상으로 하였다. V.
vulnificus 28주를 대상으로 하였다. 양성, 음성 대조를 위한 표준균주는 V. vulnificus NCCP 11135, V. parahemolyticus NCCP 11143, V. cholerae NCCP 13589를 사용하였다.
이론/모형
실험에 사용된 항생제 카드는 AST-N169 card(biomerieux)로 구성 항생제 종류는 ampicillin (AMP),amoxicillin/clavulanic acid (AMC), ampicilln/sulbactam(SAM), cefazolin (CFZ), cefotetan (CTT), cefoxitin (FOX), ceftriaxone (CRO), imipenem (IPM), amikacin (AMK), gen-tamicin (GEN), nalidixic acid (NAL), ciprofloxacin (CIP), tetracycline (TET), chloramphenicol (CHL), trimethoprim/sulfamethoxazole (SXT) 등 총 15종을 사용하였다. 각각항생제에 대한 내성(Resistant; R), 중등도 내성(Intermediate; I), 감수성(Susceptible; S) 판정은 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)의 항생제 내성기준16)에 따라 판정하였다.
매실 추출물의 최소살균농도(MBC, minimum bactericidal concentration)는 액체배지희석법17)에 따라 실험하였다. V.
매실 추출물의 항균활성을 탐색하기 위해 V. vulnificus 분리균주 1주와 V. vulnificus NCCP 11135, V. para-hemolyticus NCCP 11143, V. cholerae NCCP 13589 표준균주 각각 1주에 대하여 paper disc diffusion법17)을 이용하여 실험하였다. 각각의 균주를 Mueller-Hinton broth(MHB; Oxoid)에 접종하여 37oC에서 18시간 배양한 후 멸균생리식염수를 이용 0.
성능/효과
1에 나타내었다. V. cholerae NCCP 13589와 V. parahemolyticus NCCP 11143 표준균주 모두 매실추출물 0.625%와 1.25%에서 생육 저지환을 나타내지 않고, 2.5%와 5%에서 생육 저지환을 나타내었다. 또한 V.
vulnificus는 tetracycline과 chloramphenicol 항생제에 감수성을 나타내어 환자 발생 시 이 두 종류의 항생제가 치료에 용이할 것으로 판단되었다. V. cholerae NCCP 13589와 V. parahemolyticus NCCP 11143 표준균주 모두 매실추출물 2.5%와 5%에서 생육 저지환을 나타내었다. 또한V.
625%에서는 생육 저지환을 나타내지 않았다. V. cholerae와 V. parahemolyticus에 비해 V. vulnificus에 대한 매실 추출물의 항균활성이 높게 나타났다.
parahemolyticus순으로 매실 당침출액의 항균활성이 크게 나타난 것으로 보고8)되었다. V. parahemolyticus에 대한 매실 당침출액의 항균활성이 다른 식중독균에 비해 크다는 보고와 매실 추출액에 대한 항균활성은 V. parahemolyticus 보다 V. vulnificus에서 더 크다는 본 연구의 실험결과를 종합해 볼때 수산물 중 V. vulnificus 생육억제에 매실 추출물이 매우 유용할 것으로 판단된다.
vulnificus 28주를 대상으로 하였다. V. vulnificus 28주 모두에서 vvhA 유전자가 검출되고 good identification 이상의 생화학 동정 결과를 나타내어 V. vulnificus임이 확인되었다. 실험에 사용된V.
vulnificus에 대한 매실 추출물의 항균활성이 높게 나타났다. V. vulnificus에 대한 매실 추출액 최소살균농도가 1.6%로 나타나 수산물 중 V. vulnificus 생육억제에 매실 추출물이 매우 유용할 것으로 판단되었다. 수산물과 관련된 비브리오균 중 패혈증을 일으키는 V.
, Seoul, Korea)와 realtime PCR (7500 Fast real-time PCR, Applied Biosystems, Singapore)을 사용 제조사의 실험조건에 따라 실시하였다.real-time PCR 결과 vvhA 유전자가 확인된 균주는 Vitek 2 system (Biomerieux, Durham, NC, USA)를 이용 생화학적 동정을 실시하여 최종 V. vulnificus를 확인하였다.
Vitek 2 system 실험결과 good identification, very good identification, excellent로 동정될 경우 분리 균주가 정확하게 동정되었음을 의미한다.real-time PCR 실험결과 28주 모두에서 V. vulnificus의 특이 유전자인 vvhA 유전자가 검출되었으며, 생화학 동정에서도 28주 모두 good identification 이상의 결과를 나타내어 본 실험에 사용된 분리균주는 모두 V. vulnificus임이 확인되었다.
또한V. vulnificus 분리균주와 V. vulnificus NCCP 11135 표준균주 모두 매실 추출물 1.25%, 2.5%, 5%에서 생육 저지환을 나타내어 V. cholerae와 V. parahemolyticus에 비해 V. vulnificus에 대한 매실 추출물의 항균활성이 높게 나타났다. V.
실험에 사용된V. vulnificus는 tetracycline과 chloramphenicol 항생제에 감수성을 나타내어 환자 발생 시 이 두 종류의 항생제가 치료에 용이할 것으로 판단되었다. V.
6% 농도의 시험관에서 혼탁이 관찰되지 않았다. 또한 0.8%, 1.6%, 3.2%의 시험액을 취하여 배양한 결과 0.8%에서는 V. vulnificus 집락이 형성되었고 1.6%와 3.2% 두 농도의 배양액에서는 V. vulnificus 집락이 형성되지 않아 매실 추출액의 최소살균농도는 1.6%로 나타냈다. 최소살균농도를 포함한 0.
5%와 5%에서 생육 저지환을 나타내었다. 또한 V. vulnificus 분리균주와 V. vulnificus NCCP 11135 표준균주 모두 매실 추출물 1.25%, 2.5%, 5%에서 생육 저지환을 나타내었고, 0.625%에서는 생육 저지환을 나타내지 않았다. V.
매실 추출액의 최소살균농도(MBC) 실험결과 V. vulnificus NCCP 11135 표준균주와 V. vulnificus 분리균주 28주 모두 매실 추출액 0.8% 농도의 시험관에서 혼탁이 관찰되고, 1.6% 농도의 시험관에서 혼탁이 관찰되지 않았다. 또한 0.
vulnificus에 대한 항생제 내성 실험결과는 Table 2에 나타내었다. 실험결과 가장 높은 내성을 나타낸 항생제는 cefoxitin으로 24균주 (85.7%)에서 내성을 나타내었으며, ampicilln는 4균주 (14.3%)에서 내성을 나타내었다. 중등도 내성(intermediate)은 cefotetan에서 5균주 (17.
6%)로 나타났다. 실험에 사용된 V. vulnificus 28균주 모두는 tetracycline과 chloramphenicol 등 11종의 항생제에 감수성을 나타내었다. 이러한 결과는 2001년 국내에서 분리된 V.
또한 매실 추출물의 친수성 분획이 미생물 대사관련 효소 중glucose-6-phosphate dehydrogenase, succinate dehydrogenase, malate dehydrogenase, hexokinase 등 에너지대사 관여 효소 작용을 억제하는 것으로 보고25)되고 있다. 이러한 보고를 종합해 볼 때 매실 추출물에 포함되어 있는 isoeugenol등의 항균물질과 citric acid 등의 유기산이 미생물의 에너지대사 효소를 억제하고 세포막의 기질 투과성을 억제하여 항균활성을 나타내는 것으로 판단된다. 수산물과 관련된 비브리오균 중 발열, 설사, 복통과 함께 패혈증을 일으키는 V.
6%로 나타냈다. 최소살균농도를 포함한 0.8%, 1.6%, 3.2% 매실 추출액-MHB의 pH는 각각 4.68, 3.91, 3.39로 측정되었다.
후속연구
이러한 원인은 비브리오 패혈증의 진행 속도가 매우 빠르고, ampicilin, moxalactam, cefoperazone, cefomandole 등의 항생제에 내성을 나타내며 신속한 치료가 이루어지지 않기 때문인 것으로 보고7) 되고 있다. 따라서 수산물 섭취로 인한 V. vulnificus 식중독을 예방하기 위하여 항생제 내성 V. vulnificus에 대한 항균활성 연구가 필요하다 하겠다.
vulnificus균은 국내에서 매년 환자를 발생시키고5,6)있으며 특히 최근 5년간 147명의 사망자를 발생시켰다6).본 연구결과 V. vulnificus균에 대한 매실 추출물의 항균활성을 확인하였으며 수산물에 의한 식중독을 예방하기 위한 매실 추출물 활용연구가 필요한 것으로 판단된다.
vulnificus균은 국내에서 매년 지속적으로 환자와 사망자를 발생시키고 있다. 수산물 생식 시 발생할 수 있는 식중독을 예방하기 위한 매실 추출물 활용연구가 필요한 것으로 판단된다.
3%를 나타내었다는 보고5)와 비교 할 때 cefoxitin 내성은 79%, ampicilln 내성 11% 증가한 경향을 나타내었다. 이러한 결과는 V. vulnificus의 항생제 내성이 증가할 위험성을 내포하고 있어 지속적 연구가 필요한 것으로 판단되었다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
수산물 취급 시 주의해야 할 사항은?
2015년 수산물 생산액이 7조원 이상을 기록하는 등 축산물 보다 수산물을 통한 단백질 섭취가 증가하고 있으며 수산물의 영양학적 가치로 수산식품은 건강식품으로 인식되고 있다1,2). 수산물은 미생물에 의한 변패가 용이하여 식중독 원인식품으로 작용할 수 있으며, 주요 병원성세균으로 비브리오균이 보고1)되고 있다. 특히 우리나라의 경우 해산물 섭취가 많고 어패류를 생식하는 식습관 상 비브리오균에 의한 감염 위험이 높게 보고3)되고 있다.
2011~2015년 기준 5년간 V. vulnificus에 의한 치사율은 어느 정도인가?
vulnificus 감염은 오염된 수산물을 섭취하거나 해수에 상처가 노출되었을 때 발생하며 발열, 오한, 복통, 설사 등의 증상과 피부 병변이 나타난다5). 질병관리본부 보고6)에 의하면 2011부터 2015년까지 5년간 전국에서 발생한 비브리오 패혈증 환자 269명 중 147명(54.6%)이 사망하는 등 비브리오 패혈증은 높은 치사율을 나타내고 있다. 이러한 원인은 비브리오 패혈증의 진행 속도가 매우 빠르고, ampicilin, moxalactam, cefoperazone, cefomandole 등의 항생제에 내성을 나타내며 신속한 치료가 이루어지지 않기 때문인 것으로 보고7) 되고 있다.
병원성 비브리오균에는 어떤 것이 있는가?
특히 우리나라의 경우 해산물 섭취가 많고 어패류를 생식하는 식습관 상 비브리오균에 의한 감염 위험이 높게 보고3)되고 있다. 병원성 비브리오균에는 Vibrio parahemolyticus, Vibrio cholerae, Vibrio vulnificus 등이 대표적이며, 수산물 섭취와 관련된 사망사고의 95% 이상이 V. vulnificus와 연관된 것으로 보고4)되고 있다.
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