B16F1세포에서 항산화 활성 및 멜라닌 합성에 대한 유백피 에탄올 추출물의 효능 Effect of Ulmus macrocapa Ethanolic Extracts on Anti-oxidant Activity and Melanin Synthesis in B16F1 Cells원문보기
멜라닌은 superoxide, hydroxyl radical, singlet oxygen, hydrogen peroxide와 같은 활성산소를 생성하는 자외선으로부터 피부를 보호하는 핵심적인 역할을 한다. 그러나 지질, 단백질, DNA 산화를 야기시키는 활성산소는 주근깨와 기미의 원인으로 알려진 melanin 과잉생산을 유도한다. 한약재중에서 본 연구에 사용된 유백피는 주요 성분으로 flavonoids를 함유하는 것으로 보고되었다. 본 연구의 목적은 B16F1에서의 유백피 에탄올 추출물의 미백효과 및 항산화 효과를 조사한 것이다. UMEE는 $3.12{\mu}g/ml$ 이하의 농도에서 세포독성을 보여주지 않았다. 항산화 실험에서 UMEE는 높은 환원력과 DPPH 소거효과를 보여주었다. 더욱이 UMEE는 지질과산화 억제효과가 있는 것으로 관찰되었다. UMEE는 in vitro에서 tyrosinase활성에 대한 억제효과는 없었다. 그러나 UMEE는 melanogenesis에서 중요한 효소인 tyrosinase 및 tyrosinase related protein-2 (TRP-2)의 발현을 감소시키는 것으로 나타났다. 이러한 결과들은 UMEE가 항산화 활성뿐 만 아니라 tyrosinase 및 TRP-2의 발현억제를 통한 미백효과를 나타내어, 피부에 미백효과를 줄 수 있는 기능적인 잠재성을 가지고 있다는 것을 암시한다.
멜라닌은 superoxide, hydroxyl radical, singlet oxygen, hydrogen peroxide와 같은 활성산소를 생성하는 자외선으로부터 피부를 보호하는 핵심적인 역할을 한다. 그러나 지질, 단백질, DNA 산화를 야기시키는 활성산소는 주근깨와 기미의 원인으로 알려진 melanin 과잉생산을 유도한다. 한약재중에서 본 연구에 사용된 유백피는 주요 성분으로 flavonoids를 함유하는 것으로 보고되었다. 본 연구의 목적은 B16F1에서의 유백피 에탄올 추출물의 미백효과 및 항산화 효과를 조사한 것이다. UMEE는 $3.12{\mu}g/ml$ 이하의 농도에서 세포독성을 보여주지 않았다. 항산화 실험에서 UMEE는 높은 환원력과 DPPH 소거효과를 보여주었다. 더욱이 UMEE는 지질과산화 억제효과가 있는 것으로 관찰되었다. UMEE는 in vitro에서 tyrosinase활성에 대한 억제효과는 없었다. 그러나 UMEE는 melanogenesis에서 중요한 효소인 tyrosinase 및 tyrosinase related protein-2 (TRP-2)의 발현을 감소시키는 것으로 나타났다. 이러한 결과들은 UMEE가 항산화 활성뿐 만 아니라 tyrosinase 및 TRP-2의 발현억제를 통한 미백효과를 나타내어, 피부에 미백효과를 줄 수 있는 기능적인 잠재성을 가지고 있다는 것을 암시한다.
Melanin plays a key role in the protection of skin from ultraviolet light that generates reactive oxygen species (ROS), such as superoxide, hydroxyl radical, singlet oxygen and hydrogen peroxide. However, the ROS leading to the oxidation of lipids, proteins and DNA are involved in the overproduction...
Melanin plays a key role in the protection of skin from ultraviolet light that generates reactive oxygen species (ROS), such as superoxide, hydroxyl radical, singlet oxygen and hydrogen peroxide. However, the ROS leading to the oxidation of lipids, proteins and DNA are involved in the overproduction of melanin that is known to cause melasma, age spots and freckles. Among the herb medicines, Ulmus macrocarpa used in this study was reported to contain flavonoids as a main component. The aim of this study is to investigate the whitening and anti-oxidant effects of Ulmus macrocarpa ethanolic extracts (UMEE) in B16F1 cells. UMEE below $3.12{\mu}g/ml$ did not show cytotoxicity. In an anti-oxidant experiment, UMEE showed not only high reducing power and scavenging activity on DPPH, but it was also observed that UMEE exhibit an inhibitory effect on lipid peroxidation. UMEE did not display an inhibitory effect on tyrosinase activity in vitro. However, UMEE inhibited melanin synthesis in B16F1 cells. In addition, UMEE reduced the expression levels of tyrosinase and tyrosinase-related protein-2 (TRP-2), which are key enzymes in melanogenesis. These results indicate that UMEE exert a whitening effect through the inhibition of both tyrosinase and TRP-2 expressions as well as anti-oxidant activity, suggesting that UMEE could have the functional potential for a whitening effect on the skin.
Melanin plays a key role in the protection of skin from ultraviolet light that generates reactive oxygen species (ROS), such as superoxide, hydroxyl radical, singlet oxygen and hydrogen peroxide. However, the ROS leading to the oxidation of lipids, proteins and DNA are involved in the overproduction of melanin that is known to cause melasma, age spots and freckles. Among the herb medicines, Ulmus macrocarpa used in this study was reported to contain flavonoids as a main component. The aim of this study is to investigate the whitening and anti-oxidant effects of Ulmus macrocarpa ethanolic extracts (UMEE) in B16F1 cells. UMEE below $3.12{\mu}g/ml$ did not show cytotoxicity. In an anti-oxidant experiment, UMEE showed not only high reducing power and scavenging activity on DPPH, but it was also observed that UMEE exhibit an inhibitory effect on lipid peroxidation. UMEE did not display an inhibitory effect on tyrosinase activity in vitro. However, UMEE inhibited melanin synthesis in B16F1 cells. In addition, UMEE reduced the expression levels of tyrosinase and tyrosinase-related protein-2 (TRP-2), which are key enzymes in melanogenesis. These results indicate that UMEE exert a whitening effect through the inhibition of both tyrosinase and TRP-2 expressions as well as anti-oxidant activity, suggesting that UMEE could have the functional potential for a whitening effect on the skin.
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문제 정의
유백피(Ulmus macrocarpa)는 느릅나무의 껍질로서 관절염을 억제하는 천연물로 잘 알려진 한약재이지만 피부미백효과에 대한 연구는 부족한 실정이다. 따라서 본 연구는 위와 같은 효과를 가지고 있는 유백피의 피부 미백효과 및 항 산화 효과에 대하여 연구하고자 한다.
호흡과 대사과정을 통해 생성되는 ROS는 체내에서 radical로 작용하여 세균 및 바이러스로부터 조직 및 기관을 보호하지만 과도하게 발생할 경우 세포 손상을 야기시키고 암, 당뇨, 관절염 등의 질병을 유발할 뿐만 아니라 노화를 촉진시킨다고 알려져 있다[3]. 따라서 본 연구에서 UMEE의 항산화 효과를 확인하기 위해 DPPH free radical scavenging assay, TBARS, 환원력 측정실험을 수행하였다. 환원력 측정 실험에서 나타난 UMEE의 높은 환원력은 radical에 의한 tyrosin의 산화를 억제하여 산화를 통한 합성기전을 차단시켜 UMEE의 새로운 melanin 합성 억제효과의 가능성을 제시한다[9].
DOPAquinone이 산화되어 생성된 DOPAchrome은 TRP -2에 의하여 melanin으로 전환된다. 본 연구에서는 TRP-2가 관여하는 melanin합성 과정에서의 UMEE의 작용을 조사하기 위해 western blot을 수행 하였다. 그 결과UMEE는 tyrosinase 및 TRP-2 단백질 발현을 억제시키는 것을 통하여 TRP-2에 의한 melanin 합성을 유의적으로 억제시킬 수 있을 것으로 사료된다.
Tyrosinase 는 인체내의 melanin 생합성 경로에서 가장 중요한 초기 속도결정단계에 관여하는 효소로서 많은 미백 성분이 이 효소를 억제하는 작용기전을 가지고 있다. 이 시험은 In vitro에서 tyrosinase의 활성을 저해하는 정도를 평가할 수 있다. Fig.
제안 방법
B16F1 cell에 대한 UMEE의 세포독성을 조사하기 위해 MTT assay를 수행 하였다. Fig.
Brand-Williams [7] 실험방법을 변형하여 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl (DPPH) radical에 대한 UMEE의 소거능력을 측정하였다. 각 시료를 시험농도로 처리하고 10초 동안 잘 혼합한 다음, 실온에서 20분 동안 반응시킨 후 525 nm에서 흡광도를 측정하였다.
DPPH radical에 대한 UMEE의 소거능을 조사하기 위해 DPPH free radical scavenging assay를 수행 하였다. DPPH radical소거법은 항산화 물질에 의한 DPPH radical의 탈색 정도를 지표로 하여 산화억제 정도를 예측할 수 있다.
Melanin 생성의 중요한 효소인 tyrosinase와 melanin 합성 신호전달기전에 중요한 tyrosinase related protein-2 (TRP-2) 의 단백질 발현을 조사하였다. Melanin 합성을 촉진시키기 위하여 B16F1세포에 melanin stimulating hormone (α-MSH) 으로 자극하였다.
Melanin 합성을 촉진시키기 위하여 B16F1세포에 melanin stimulating hormone (α-MSH) 으로 자극하였다.
melanin 표준품(Sigma, USA)으로 얻은 표준 검량선을 이용 하여 각 well에서 생성된 melanin 양을 산출하였다. Melanin은 단위세포(104 cells)에서의 melanin 생성량을 비교하였다.
UMEE의 ·OH radical에 의한 지질과산화 억제효과를 조사하기 위해 TBARS를 수행하였다.
Western blot의 band는 LAS3000 ®image analyzer (Fuji film Life Science, Tokyo, Japan)를 이용하여 관찰하였다.
여기서 얻은 pellet에 1N NaOH (10% DMSO) 200μl를 첨가하고 vortex 후 405 nm에서 흡광도를 측정 하였다. melanin 표준품(Sigma, USA)으로 얻은 표준 검량선을 이용 하여 각 well에서 생성된 melanin 양을 산출하였다. Melanin은 단위세포(104 cells)에서의 melanin 생성량을 비교하였다.
10 μg의 세포용출액을 10% Tris–HCl gel에서 전기영동 후 단백질을 전기적으로 nitrocellulose membrane으로 전이 시켰다. 그 다음 10% skim milk를 nitrocellulose mem- brane에 전 처리하고 목적 단백질에 대한 1차 항체(anti-tyrosinase, anti-TRP -2, anti-beta-actin (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, USA))를 처리한 다음 2차 항체를 처리후, chemiluminescent ECL kit (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, USA)를 사용하여 목적단백질을 검출하였다. Western blot의 band는 LAS3000 ®image analyzer (Fuji film Life Science, Tokyo, Japan)를 이용하여 관찰하였다.
그 다음, 15:1 비율의 n-butanol : pyridine 용액을 500 μl 첨가하고 1,000× g에서 10분 동안 원심 분리하여 상등액을 532 nm에서 흡광도를 측정하였으며 지질과산화 정도는 시료 첨가 전후의 흡광도 비를 % 값으로 환산하였다.
12 μg/ml 이하에서 어떠한 독성도 나타나지 않았다. 다음 실험으로 DOPA자극을 통한 melanin 생성조절효과를 조사하기 위해 B16F1 세포를 사용하여 melanin 함량을 측정 하였다. Fig 5B에서 보는 바와같이 양성 대조군으로 사용된 2,000 μg/ml의 arbutin은 melanin 합성효과가 우수한 것으로 나타났다.
대상 데이터
세포배양을 위한 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), Trypsin-EDTA, penicillin (10,000 U/ml )/ streptomycin (10,000 μ/ml )/ amphotericin (2,500 μg/ml), fetal bovine serum (FBS) 시약은 Gibco BRL, Life Technologies (Paisley, Scotland)로 부터 구입하였다. B16F1 cell line은 ATCC (American Type Culture Collection, USA)로부터 구입하였다. MTT reagent, gelatin, agarose와 기타시약은 Sigma Chemical Co.
B16F1 cell line은 ATCC (American Type Culture Collection, USA)로부터 구입하였다. MTT reagent, gelatin, agarose와 기타시약은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)로 부터 구입하였다.
세포배양을 위한 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), Trypsin-EDTA, penicillin (10,000 U/ml )/ streptomycin (10,000 μ/ml )/ amphotericin (2,500 μg/ml), fetal bovine serum (FBS) 시약은 Gibco BRL, Life Technologies (Paisley, Scotland)로 부터 구입하였다.
여기에 10% TCA 용액 1 ml를 가하여 13,500× g에서 15분 동안 원심 분리하여 얻은 상등액 1 ml 에 증류수 및 ferric chloride 각 1 ml를 가하여 혼합한 후 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로 0.01% vitamin C를 사용하였다. 시료의 환원력은 시료 첨가군와 대조군의 흡광도 비를 % 값으로 환산하여 나타내었다.
세척·건조된 상기 유백피를 주정에 3일간 추출하고 여과한 후, 여과된 여액을 감압농축하여 분말 형태의 유백피 주정추출물을 얻는다. 제조된 분말형태의 시료들을 시험농도로 희석하여 본 연구에 사용하였다.
데이터처리
각 시료 농도군에 대한 유의차 검정은 대조군과 비교하여 Student’s t test 한 후 p<0.05 값을 통계적으로 유의성 있는 결과로 간주하였다.
각 실험은 3회 이상 반복실험을 통하여 그 결과를 얻어 각각의 시료농도에 대해 평균±표준편차로 나타내었다.
이론/모형
Hansen [18]의 방법에 따라 B16F1 세포에 대한 UMEE 의 세포독성을 MTT (3-(4,5-dimethyl-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)를 이용하여 측정하였다.
Oyaizu [11]의 방법에 따라 측정하였다. UMEE 1 ml에 pH 6.
성능/효과
UMEE 는 62.5 μg/ml 농도에서 350%의 환원력을 나타내어 양성대조군으로 사용된 10 μg/ml 의 vitamin C보다 환원력이 우수한 것으로 나타났다.
UMEE의 환원력을 조사한 결과 Fig. 2에서 보는 바와 같이 농도에 비례하여 환원력이 증가하는 것으로 나타났다. UMEE 는 62.
각 농도별로 소거능을 조사한 결과 Fig. 1에서 보는 바와 같이 UMEE 의 농도가 증가함에 따라 비례하여 DPPH free radical 소거능이 증가되는 것으로 나타났으며 31.2 μg/ml 에서는 약 50%의 DPPH free radical 소거효과가 있는 것으로 나타났다.
그 결과 Fig. 3에서 보는 바와 같이 Blank군과 비교하여 양성 대조군으로 사용된 vitamin E는 1,000 μg/ml의 농도에서 지질과산화화를 20% 억제하였으나 UMEE는 vitamin E보다 16배 낮은 농도인 62.5 μg/ ml 농도에서 10%의 지질과산화 억제효과를 나타내었다.
본 연구에서는 TRP-2가 관여하는 melanin합성 과정에서의 UMEE의 작용을 조사하기 위해 western blot을 수행 하였다. 그 결과UMEE는 tyrosinase 및 TRP-2 단백질 발현을 억제시키는 것을 통하여 TRP-2에 의한 melanin 합성을 유의적으로 억제시킬 수 있을 것으로 사료된다. 따라서 UMEE는 DOPA에서 DOPAquinone과 DOPAchrome을 통한 melanin 합성기전을 억제시켜 미백효과를 나타낼 수 있을 것으로 사료된다.
그 결과UMEE는 tyrosinase 및 TRP-2 단백질 발현을 억제시키는 것을 통하여 TRP-2에 의한 melanin 합성을 유의적으로 억제시킬 수 있을 것으로 사료된다. 따라서 UMEE는 DOPA에서 DOPAquinone과 DOPAchrome을 통한 melanin 합성기전을 억제시켜 미백효과를 나타낼 수 있을 것으로 사료된다. 이러한 미백효과를 나타내는 유백피는 향후 미백기능성 화장품으로의 활용가치가 높을 것으로 기대된다.
그래서 본 연구에서는 tyrosinase 효소활성에 대한 UMEE의 억제효과를 조사하였으나 유의성 있는 결과를 나타내지 못하였다. 반면 DOPA 합성에 의한 melanin 합성을 측정한 결과 세포 밖으로 분비된 melanin 의 경우 효과를 나타내지 못하였으나 세포 내의 melanin 합성은 우수한 억제효과를 나타내었다. 이것은 UMEE가 세포 내 DOPA억제를 통하여 DOPAquinone의 합성을 억제하고 melanin 합성기전을 차단하여 melanin 합성 억제효과를 가질 수 있다는 긍정적인 가능성을 제시한다[6].
78μg/ml 농도에서 melanin 합성에 관여하는 2가지 중요한 효소인 tyrosinase와 TRP-2의 단백질의 발현수준을 감소시키는 것으로 나타났다. 특히, TRP-2의 단백질 발현수준이 tyrosinase 발현수준보다 현저하게 감소되는 것이 관찰되었다.
하지만 세포 내 melanin 생성량을 측정하기 위해 1N NaOH를 이용하여 세포 내 melanin을 측정한 결과 Fig 5C에서 UMEE는 2,000 μg/ml의 arbutin 보다 훨씬 낮은 농도에서 melanin 합성을 유의성 있게 저해하는 것으로 나타났다(*** p<0.001).
후속연구
Tyrosinase는 melanin 합성 단계 중에 반응초기 속도를 결정하는 효소로 작용하여 tyrosin이 DOPA로 전환할 때 관여하는 촉매효소이다[15]. 그래서 본 연구에서는 tyrosinase 효소활성에 대한 UMEE의 억제효과를 조사하였으나 유의성 있는 결과를 나타내지 못하였다. 반면 DOPA 합성에 의한 melanin 합성을 측정한 결과 세포 밖으로 분비된 melanin 의 경우 효과를 나타내지 못하였으나 세포 내의 melanin 합성은 우수한 억제효과를 나타내었다.
따라서 UMEE는 DOPA에서 DOPAquinone과 DOPAchrome을 통한 melanin 합성기전을 억제시켜 미백효과를 나타낼 수 있을 것으로 사료된다. 이러한 미백효과를 나타내는 유백피는 향후 미백기능성 화장품으로의 활용가치가 높을 것으로 기대된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
유백피란?
하지만 이런 물질들은 안정성의 문제로 인해 현재 사용에 제한을 두고 있다. 유백피(Ulmus macrocarpa)는 느릅나무의 껍질로서 관절염을 억제하는 천연물로 잘 알려진 한약재이지만 피부미백효과에 대한 연구는 부족한 실정이다. 따라서 본 연구는 위와 같은 효과를 가지고 있는 유백피의 피부 미백효과 및 항 산화 효과에 대하여 연구하고자 한다.
Melanin은 어떠한 과정에서 합성이 되는가?
Melanin은 신체의 눈동자, 머리카락 또는 피부색등을 결정짓는 색소로서 자외선과 같은 외부로부터의 자극으로부터 세포를 보호하는 과정에서 합성된다. 자외선에 의해 피부가 자극을 받으면 표피의 melanocyte에 존재하는 melanocortin 1 receptor (MC1R)와 뇌하수체에서 분비되는 α-melanocyte stimulating hormone (α-MSH)과 결합하여 cyclic adenosine monophosphate (cAMP)/protein kinase A (PKA) 경로에 의해 microphthalmia-associated transcription factor (MITF)의 발현이 증가된다[1, 4, 12].
vitamin C와 비슷한 효과를 나타내는 미백제는?
대표적인 항산화제로 알려진 vitamin C는 미백에도 탁월한 효과가 있는 물질로서 tyrosinase의 활성부위에 결합하여 활성을 억제한다. 비슷한 효과를 나타내는 albutin도 미백제로서 잘 알려진 물질이다. 하지만 이런 물질들은 안정성의 문제로 인해 현재 사용에 제한을 두고 있다.
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