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문제 정의
- 이러한 관점에서 본 연구진은 마늘의 가공조건을 변화하여 기존의 생마늘 및 흑마늘과 차별화되는 색상과 물리적 특성을 가지는 홍마늘을 개발하여 제조과정 중의 특성[9], 생마늘, 흑마늘과의 생리활성 비교 연구[19,25], 항염증활성[7] 등에 대해 다양한 연구를 추진하고 있다. 본 연구에서는 홍마늘 생리활성 규명을 위한 연구의 일환으로 홍마늘 용매 분획물을 제조하여 항산화 활성 및 항비만 활성을 규명하기 위한 기초자료를 확보하고자 하였다.
- 이러한 가공법의 차별화나 변형은 다양한 생리활성과 특성을 가지는 맞춤형 기능식품을 선호하는 현대인들의 소비성향과도 부합하고 있다. 이러한 관점에서 본 연구진은 마늘의 가공조건을 변화하여 기존의 생마늘 및 흑마늘과 차별화되는 색상과 물리적 특성을 가지는 홍마늘을 개발하여 제조과정 중의 특성[9], 생마늘, 흑마늘과의 생리활성 비교 연구[19,25], 항염증활성[7] 등에 대해 다양한 연구를 추진하고 있다. 본 연구에서는 홍마늘 생리활성 규명을 위한 연구의 일환으로 홍마늘 용매 분획물을 제조하여 항산화 활성 및 항비만 활성을 규명하기 위한 기초자료를 확보하고자 하였다.
제안 방법
- 3T3-L1 전지방세포를 5×104 cell/ml이 되도록 현탁하여 96 well plate에 90 μl씩 분주하고 5% CO2 , 37℃ 조건의 incubator에서 24시간 동안 배양한 다음, 배지를 모두 제거하고 혈청이 포함되지 않은 배지를 90 μl씩 첨가하였다.
- 96 well plate에 시료액 40 μl, FRAP 기질액 100 μl 및 증류수 40 μl를 차례로 혼합하여 37℃에서 4분간 반응시킨 후 593 nm에서 흡광도를 측정하였으며, FeSO4·7H2O를 표준물질로 하여 얻은 표준검량선으로부터 계산하였다.
- Lipase 저해효과 측정은 Saisuburamaniyan 등[22]의 방법을 변형하여 사용하였다. 각 천연식물류 추출물 0.
- 그 후, CCK-8 (Colorimetric Cell Counting kit-8, Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan) 용액을 10 μl씩 분주하여 3시간 동안 배양한 후 ELISA reader (Victor TM X3, Perkin Elmer, USA)를 이용 하여 450 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
- 여기에 시료 추출물을 100 μg/ml의 농도로 처리한 다음, 5% CO2 , 37℃ 조건의 incubator에서 2일간 배양한 후, 분화유지 배지(DMEM, 10% FBS, 1% P/S, 10 μg/ml insulin)로 교체하고 시료 추출물을 100 μg/ml의 농도로 재처리하였다. 다시 48시간 후 DMEM, 10% FBS, 1% P/S 및 시료추출물을 함유한 배지로 교환한 후 2일 간격으로 8일 동안 배양하였다. 최종 배양 후 배지를 제거하고, 세포를 고정시키기 위해 10% formaldehyde를 500 μl씩각 well에 넣고 4℃에서 1시간 동안 유지시켰다.
- 그 후, CCK-8 (Colorimetric Cell Counting kit-8, Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan) 용액을 10 μl씩 분주하여 3시간 동안 배양한 후 ELISA reader (Victor TM X3, Perkin Elmer, USA)를 이용하여 450 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 시료를 처리하지 않은 대조군의 흡광도 값에 대한 시료 처리군의 흡광도 값의 비로 나타내었으며, 각 실험은 독립적으로 3회 반복 실행하여 평균치를 구하였다.
- 세포가 confluent된 후 48시간 더 배양 한 다음 DMEM, 10% FBS (fetal bovine serum), 1% P/S, 10 μg/ml insulin, 1 μM dexamethasone 및 0.5 mM isobuthylmethylxanthine이 첨가된 배지로 교체하여 분화를 유도하였다.
- 세포독성 평가 결과에 따라 최고 농도인 100 μg/ml에서 항비만 활성을 평가하였다.
- 여기에 시료 추출물을 100 μg/ml의 농도로 처리한 다음, 5% CO2 , 37℃ 조건의 incubator에서 2일간 배양한 후, 분화유지 배지(DMEM, 10% FBS, 1% P/S, 10 μg/ml insulin)로 교체하고 시료 추출물을 100 μg/ml의 농도로 재처리하였다.
- 5% 농도로 용해한 후 증류수와 3:2(v:v)의 비율로 혼합하여 제조한 염색시약을 500 μl씩 가하여 상온에서 1시간 동안 염색하였다. 염색된 세포는 PBS로 3번 세척한 후 현미경(IX71, Olympus, Tokyo, Japan)으로 관찰하였으며, 지방에 염색된 염색시약을 isopropyl alcohol로 추출하여 ELISA reader (Victor TM X3, Perkin Elmer, USA)로 595 nm에서 흡광도 값을 측정하였다. 지방 축적율은 시료를 처리하지 않은 대조군의 흡광도 값에 대한 시료 처리군의 흡광도 값의 비로 나타내었다.
- 분쇄한 홍마늘 시료에 약 10배의 메탄올을 가하여 60℃의 수욕상에서 환류냉각하면서 2회 반복 추출하여 메탄올 조추출물을 얻었다. 이것을 회전식 진공증발기로 추출용매를 제거한 다음 메탄올과 물 혼합액(1:9, v/v)에 재용해하고, 순차적으로 hexane, chloroform, ethyl acetate, butanol을 각각 가하여 2회씩 반복 추출해 각각의 용매 분획물을 얻었으며, 잔사를 물분획물로 하였다. 5종의 용매분획물은 회전식 진공증발기로 완전건고 시킨 다음 일정량을 취하여 항산화 활성 측정용 시료로 사용하였다.
- 총 페놀 함량은 1,000 μg/ml 농도의 홍마늘 용매 분획물 1 ml에 Foline-Ciocalteau 시약 및 10% Na 2 CO 3 용액을 각각 1 ml씩 차례로 가하여 실온에서 1시간 반응시킨 후 700 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 홍마늘 용매 분획물에 대한 FRAP (ferric reducing antioxidant power) 측정은 pH 3.6의 300 mM acetate buffer, 40mM HCl에 용해한 10 mM TPTZ (2,4,6-tripyridyl-s-triazine)용액 및 20 mM FeCl3 · 6H2O를 각각 10:1:1(v/v/v)의 비율로 미리 혼합한 다음 37℃의 수욕상에서 가온한 뒤 FRAP 측정용 기질로 사용하였다.
- 3 ml를 차례로 혼합하고 실온에서 40분간 반응시킨 다음 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 홍마늘 용매 분획물의 총 페놀 및 플라보노이드 함량은 표준물질로 각각 caffeic acid 및 quercetin (Sigma Co., St. Louis, MO, USA)을 이용한 검량선에 의해 계산하였다.
- 홍마늘 용매 분획물의 추출수율은 건조 및 추출 전·후의 시료 중량을 측정하여 계산하였다.
- 홍마늘은 경남 남해산 깐마늘을 이용하여 본 연구진이 특허 출원한(제 10-2011-0109281호) 방법에 따라 -80℃에서 24시간 동결건조시킨 후 뚜껑이 있고 밀폐가 되는 용기에 넣어 80℃의 항온항습기에서 36시간 숙성시켰다. 이어 온도 60℃, 습도 60%의 조건에서 12시간 숙성시킨 다음 60℃에서 5시간 동안 건조시켜 완성하였다.
대상 데이터
- 실험에 사용한 3T3-L1 전구지방세포는 한국세포주은행(KCLB)으로부터 분양받았으며, 10% bovine serum (GIBCO, Rockville, MD, USA)과 1% P/S (Penicillin/streptomycin)이포함된 DMEM (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium, GIBCO, Rockville, MD, USA) 배지를 가하여 5% CO2 , 37℃ 조건의 incubator (3517-02, Shellab Co., Cornelius, USA)에서 배양하였다.
데이터처리
- 각 실험군에 대한 유의성 검정은 분산분석을 한 후 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple test를 실시하였다.
- 반복 실험하여 얻은 결과는 SPSS 12.0 package를 사용하여 분산분석 하였으며, 결과는 평균±표준편차로 나타내었다.
성능/효과
- 1,000 μg/ml의 고농도에서는 chloroform 분획물에서 48.64±0.32%로 가장 활성이 높았고, ethyl acetate와 물 분획물이 40% 이상으로 활성이 높았으나 butanol 추출물의 활성은 12.74±0.52%로 가장 낮았다.
- 1과 같다. Chloroform 분획물의 흡광도 값은 0.80으로 타 분획물에 비해 유의적으로 높아, hexane 분획물(0.46)과 물 분획물(0.45)에 비해 약 1.7배 정도 높은 함량이었다. Ethyl acetate 및 butanol 분획물의 갈변도는 0.
- 대조군에비해 홍마늘 분획물을 처리함으로서 유의적으로 지방 축적율이 감소하였다. 가장 활성이 높은 물분획물의 대조군에 대비 지방축적율은 50.24% 였으며, 다음으로 butanol과 ethyl acetate 분획물이 각각 62.80%와 64.73%로 대조군 대비 지방 축적율이 낮았으며, 용매 분획물 중 가장 활성이 낮았던 hexane 분획물의 지방 축적 억제율은 약 8% 정도에 불과하였다.
- 시료의 농도 증가와 더불어 DPPH 라디칼 소거 활성도 증가하였는데 62.5 μg/ml의 저농도에서는 물 분획물의 활성이 13.37±0.96%로 가장 높았다.
- 시료의 농도가 증가하면서 lipase 저해활성도 증가하였는데, 500 μg/ml 농도에서는 25% 이상으로 활성이 증가하였다.
- 시료의 첨가 농도가 증가함에 따라 ABTS 라디칼 소거능은 유의적으로 상승하였으며, 1,000 μg/ml 첨가시 chloroform, ethyl acetate 및 물 분획물에서 70% 이상의 소거능을 보였으나, hexane 및 butanol 분획물의 경우에는 50% 미만으로 활성이 낮았다.
- 2와 같다. 총 페놀 함량은 hexnae 분획물에서 132.39 mg/g으로 가장 높았으며, 다음으로 chloroform 분획물이었으며, butanol 분획물에서는 35.13 mg/g으로 가장 낮은 함량이었다. 플라보노이드 함량도 hexane 분획물에서 16.
- 홍마늘 용매별 분획물의 항산화능을 측정하여 FeSO 4 당량으로 나타낸 결과는 Table 3과 같이 시료의 첨가 농도에 의존 적으로 항산화능이 증가하였다. 특히 chloroform 분획물이 가장 높은 항산화능을 보였고, 다음으로는 hexane 분획물 이었다. Butanol 분획물의 경우에는 62.
- 1배 정도 높은 활성을 보였다. 홍마늘 분획물의 항산화능은 전반적으로 chloroform, hexane 분획물에서 높게 나타났는데, chloroform 분획물은 hexane 분획물에 비해 갈변물질의 함량이 약 1.7배 정도 높았으며, hexane 분획물은 chloroform 분획물에 비해 총 페놀 및 플라보노이드 함량이 유의적으로 높았다.
- 홍마늘 용매 분획물의 추출 수율(data not shown)은 butanol 분획물이 8.21%로 가장 높았으며, hexane, chloroform, ethyl acetate 및 물 분획물은 각각 0.29, 0.38, 0.10 및 0.83%로모두 1% 이하였다.
- 홍마늘 용매 분획물의 항비만 활성 평가에 이용된 3T3-L1 세포에 대한 세포독성을 평가한 결과(Fig. 3) 최고 농도에서도세포 생존율은 98.61% 이상으로 실험에 사용된 100 μg/ml 까지는 세포 생장에 영향을 미치지 않음을 확인할 수 있었다.
후속연구
- 지방의 분해 및 흡수와 관련된 효소 중 pancreatic lipase는 triacylglycerol을 2-monoacylglycerol과 두 분자의 fatty acid로 분해하는 핵심적인 반응을 진행시키는 효소로 작용한다 [20]. 따라서 지방의 분해에 관여하는 효소의 활성을 저해하여 소화를 방해함으로써 체내로의 지방 흡수를 억제하게 되어 비만억제 활성을 나타낼 것으로 기대된다. Ballinger와 Peikin [1]에 의하면 시판되는 장관 내 lipase 저해제인 orlistat (상품명; xenical (R))는 위장과 소장의 관강 내에서 위와 췌장의 지방분해효소의 활성부위인 serine과의 공유결합을 형성하여 lipase를 불활성화시킴으로써 항비만 약제 기능을 하는데, 주로 지방변과 같은 소화기계 증상의 부작용을 나타내는 것으로 알려져 있다.
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