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문제 정의
- )과피는 대표적인 안토시아닌 색소의 주원료로 항산화, 항균 및 체내 지질 개선에 효능이 있으며[2, 46], 국화(Chrysanthemum, Chrysnathemum morifolium Ramat flower)로 부터 추출한 색소성분은 경구 독성 및 피부자극에 의한 부작용을 일으키지 않아 천염염료로 두루 사용되고 있는 것으로 알려져 있다[29]. 그 외에도 천연색소로 주로 사용하는 태수(Tesu flower, Butea Frondosa Butea monosperma), 헤나(Henna, Lawsonia inermis L.), 붉은백단향(Sandalwood red, Pterocarpus santalinus), 대황(Himalyan rhubarb, Rheum rhabarbarum L.), 서양꼭두서니(Madder, Rubia akane Nakai) 등 색소 11종에 대하여 항산화 및 항비만 활성을 비교 분석함으로써 향후 고부가 가치의 식품소재 및 비만 치료제 개발을 위한 기초자료를 제공하고자 한다.
제안 방법
- 천연식물 소재로부터 색소 성분을 분리하고, 추출물을 제조하기 위하여 각각의 건조 시료 1 kg에 catalase (BiotouchⓇ CAT200, AB Enzymes, Finland) 및 alcalase (AlacalaseⓇ, Novozymes, Denmark)를 1% 농도로 첨가하고 10 l의 물을 넣어 45℃에서 10시간 동안 반응시킨 후 80℃로 조절된 추출기(Cosmos660, Kyungseo, Korea)를 이용하여 2시간 동안 추출 하였다. 그 후 추출물을 여과하여 농축기(rotavapor R-220, Buchi, Switzerland)로 농축한 다음 분무건조기를 이용하여 분말화해 실험용 시료로 사용하였다.
대상 데이터
- 실험에 사용된 지방전구세포인 3T3-L1 세포는 American type culture collection (ATCC, USA)에서 분양받아 10% bovine calf serum (BCS, Hyclone, USA), 1% penicillin/streptomycin (Sigma, USA)을 첨가한 DMEM (Gibco, Germany) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 3T3-L1세포가 confluent한 상태가 되면 10% fetal bovine serum (FBS, Hyclone, USA), 1 μM dexamethasone (Sigma, USA), 0.
- 천연색소 소재로 쪽, 아카시아, 코치닐, 아선약, 포도과피, 태수, 헤나, 국화, 붉은백단향, 대황, 서양꼭두서니는 한약건재상에서 건조된 것을 구입하여 시료로 사용하였다.
데이터처리
- 0을 사용하여 통계처리 하였으며, 각각의 시료에 대해 평균±표준편차로 나타내었다. 각 시료군에 대한 유의차 검정은 분산분석을 한 후 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple test에 따라 분석하였다.
- 각 실험은 3∼5회 반복 실험한 결과에 대하여 SPSS 12.0을 사용하여 통계처리 하였으며, 각각의 시료에 대해 평균±표준편차로 나타내었다. 각 시료군에 대한 유의차 검정은 분산분석을 한 후 p<0.
이론/모형
- 3T3-L1 세포에 대한 시료 추출물의 지방세포 분화 억제 효과는 Oil red-O staining법으로 측정하였다. 분화된 세포를 먼저 PBS로 세척한 다음 10% formalin으로 1시간 동안 고정하였다.
- ABTS [2,2-azinobis-(3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulphonate)] 라디칼 소거활성은 Re 등[41]의 방법에 따라 7 mM의 ABTS 용액에 potassium persulfate를 2.4 mM이 되도록 용해시킨 다음 암실에서 12∼16시간 동안 반응시킨 후 415 nm에서 흡광도가 1.5가 되도록 증류수로 조정한 ABTs 용액을 사용하였으며, ABTs 용액에 동량의 시료액을 혼합하여 실온에서 10분간 반응시켜 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 라디칼 소거활성은 시료 무첨가구에 대한 시료첨가구의 흡광도비로 계산하여 그 활성이 50% 감소되는데 필요한 시료의 농도(inhibition concentration, IC50, μg/ml)로서 표기하였다.
- DPPH 라디칼 소거활성은 Blois [4]의 방법에 따라 1,1- Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)에 대한 전자공여 활성으로 나타내었다. 즉, 추출물과 DPPH 용액(5 mg/100 ml methanol)을 동량으로 혼합한 다음 실온에서 20분간 반응시킨 후 525 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- FRAP법에 의한 항산화 활성은 Benzie와 Strain [7]의 방법에 따라 300 mM acetate buffer (pH 3.6), 40 mM HCl에 용해한 10 mM TPTZ (2,4,6-tripyridyl-s-triazine) 용액 및 20 M ferric chloride를 각각 10:1:1 (v/v/v)의 비율로 혼합하여 37℃의 수욕상에서 가온한 것을 FRAP 기질액으로 사용하였다. 96 well plate에 시료액 40 μl, FRAP 기질액 100 μl 및 증류수 40 μl를 차례로 혼합하여 37℃에서 4분간 반응 시킨 후 593 nm에서 흡광도를 측정하였으며, ferrous sulfate를 표준물질로 하여 얻은 표준검량선으로부터 계산하였다.
- Watanabe & Kawabata [50]의 방법에 따라 10 mg/ml 농도의 시료액 10 μl를 0.7 unit/ml α- glucosidase 효소액 50 μl와 혼합하여 405 nm에서 반응전의 흡광도를 측정하였다. 5분간 실온에 방치하고 기질액 5 mM pNPG (p-nitrophenyl-α- glucopyranoside) 50 μl를 가하여 37℃에서 5분간 반응시킨 후, 다시 흡광도를 측정하여 반응전후의 흡광도 값 변화로부터 효소 저해활성을 계산하였다.
- 시료 추출물이 3T3-L1 세포의 생존율에 미치는 영향을 확인하기 위해 MTT (3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-di-phenyl-tetrazolium bromide) assay 수행하였다. 96 well plate에 3T3-L1 세포를 5×104 cells/well 농도로 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 배양한 후 각 시료 추출물을 농도별(1.
- 총 페놀 함량은 Folin-Denis법[12]에 따라 각 추출물 1 ml에 Foline-Ciocalteau 시약 1 ml를 넣고 3분 후 10% Na2CO3 용액 1 ml씩을 가한 후 혼합하여 실온의 암실에서 1시간 정치한 다음 760 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 gallic acid (Sigma Co.
성능/효과
- α-amylase에 대한 저해효과를 측정한 결과, 아선약 추출물이 64.53%로 가장 높은 저해율을 나타내었으며, 다음으로 아카시아, 포도과피 및 대황 추출물 순으로 acarbose보다 높은 수준이었다. 반면, 태수와 헤나 추출물은 30% 미만으로 acarbose보다도 저해 활성이 낮았다.
- α-glucosidase 및 α-amylase 저해효과 측정을 위해 색소원료 식물류 중 아선약, 아카시아, 포도과피, 태수, 헤나 및 대황 추출물과 대표적인 혈당강화제로 시판되고 있는 acarbose를 비교한 결과는 Table 4와 같다. α-glucosidase에 대한 저해효과를 측정한 결과, 모든 추출물에서 acarbose (16.06%)보다 높은 활성을 나타내었는데, 특히 아카시아 추출물이 93.93%로 가장 높은 저해율을 보였으며, 다음으로 아선약이 81.49%, 포도과 피는 73.82%, 대황은 72.28%로 활성이 높았고, 헤나는 19.78%로 가장 활성이 낮았다.
- 3T3-L1 세포에 대한 천연색소 시료 추출물의 지방 축적율을 평가한 결과(Table 7) 아선약 추출물이 55.8%로 가장 낮아 지방세포 분화 억제 효과가 가장 높았고, 다음으로 포도과피 추출물이 74.6%로 억제 효과가 높게 측정되었다. Fig.
- 식물류 색소원료의 trypsin, α-chymotrypsin 및 lipase에 대한 저해효과를 측정한 결과는 Table 5와 같다. Trypsin에 대한 저해활성은 아카시아 추출물이 61.48%로 가장 높았고, 다음으로 아선약 추출물에서 56.83%의 저해활성을 나타내었다. 포도과피와 헤나 추출물은 40% 미만, 태수와 대황 추출물은 10%미만으로 낮은 활성을 나타내었다.
- 상기의 연구보고로 미루어 볼 때, 본 실험의 결과에서 단백질 분해 저해 활성도 페놀 함량이 높았던 시료에서 그 활성이 높았다. 따라서 색소원료중 아카시아와 아선약추출물은 trypsin과 α-chymotrypsin과 같은 단백질 분해효소를 저해함으로써 체내에서 분해되는 단백질의 양을 감소시켜, 과잉으로 흡수되는 단백질의 양을 제한하여 체중조절에 영향을 줄 것으로 생각된다.
- 한국에 자생하는 약용식물의 경우 총 페놀 함량이 30 mg/g 이상이면 뛰어난 항산화 활성을 나타낸다고 하였는데[18], 본 연구의 아선약, 아카시아, 대황 및 포도과피 등의 천연색소 추출물은 30 mg/g 이상의 총 페놀을 함유하고 있어 상당한 항산화 활성을 보일 것으로 추측되며, 인체 내 생리활성의 증강에도 유익할 것으로 사료된다.
- 식물류 색소원료의 pancreatic lipase의 저해활성을 측정한결과 아카시아 추출물이 52.73%로 유의적으로 가장 높은 저해 활성을 나타내었으며, 다음으로 포도과피가 37.30%로 나타났다. 태수와 헤나 추출물은 각각 21.
- 다양한 천연식물로 부터 추출한 색소성분이 β-carotene linoleic acid system계에서 항산화 활성에 미치는 영향을 분석한 결과는 Table 2와 같다. 천연색소 중 아카시아 추출물의 항산화 활성이 가장 높으며, 다음으로 태수, 아선약, 코치닐, 국화 추출물 순으로 활성이 우수하였다.
후속연구
- Shin 등[44]은 삼백초 추출물을 75 μg/ml로 처리한 지방세포의 중성지방 양을 측정한 결과, 중성지방이 최대 75% 이상 감소되는 것으로 보고하였으며, Choi 등[10]은 지방세포에 참취 추출물을 10∼100 μg/ml로 처리하였을 때 대조군과 비교하여 농도 의존적으로 중성지방이 감소됨을 확인하였는데, 중성지방은 precursor fibroblast에서부터 지방세포로의 분화과정에서 생성되며, PPARγ 및 C/EBPɑ와 같은 중요한 adipogenic transcription factor들에 의해 조절되는 것으로 알려져 있다. 본 실험의 아선약 및 포도과피 추출물은 이들 추출물에 비해 활성이 더 높은 것으로 생각되며 이와 관련된 전사 인자 및 단백질 발현에 관련된 연구가 더 진행되어야 할 것으로 여겨진다.
- 본 연구 결과 acarbose보다 활성이 우수한 아선약과 아카시아 추출물은 탄수화물의 소화과정에서 α-amylase와 α-glucosidase에 의한 단당류 생성을 저해함으로써 식사 후 혈당이 급격히 상승하는 등의 증상에 효과적으로 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
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